تلطيخ الكيمياء المناعية للمؤشرات الحيوية في أقسام الغلاف العصبي لأورام الدماغ

الملخص

المصدر: Núñez, F. J., et al. تقييم المؤشرات الحيوية في الورم الدبقي بواسطة الكيمياء المناعية على مزارع الغلاف العصبي ثلاثية الأبعاد للورم الدبقي المضمنة في البارافين. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية كيميائية مناعية لوضع العلامات الحيوية للورم في المجالات العصبية لورم الدماغ المضمنة في البارافين. تخضع أقسام الغلاف العصبي لإزالة البارافين وإعادة الجفاف ، يليه العلاج لفضح مواقع المؤشرات الحيوية. ثم يتم تطبيق الأجسام المضادة الأولية والثانوية لتسمية هذه المؤشرات الحيوية. ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بإنزيمات بيروكسيداز مترافقة مع أفيدين ، والتي تؤكسد ركائز كروموجينيك للإشارة إلى مواقع المؤشرات الحيوية. أخيرا ، يتم الانتهاء من التلوين النووي وإعداد الشرائح للتحليل المجهري.

البروتوكول

1. الكيمياء المناعية (IHC) للمجالات العصبية المدمجة في البارافين (NS)

1. قم بإذابة البارافين عن طريق وضع الشرائح في رف معدني واحتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. قم بإزالة الشرائح عن طريق الحضانة في قطار الإماهة في درجة حرارة الغرفة (RT): 3 × زيلين لمدة 5 دقائق ، 100٪ 2x إيثانول لمدة دقيقتين ، 95٪ 2x إيثانول لمدة دقيقتين ، 70٪ 1x إيثانول لمدة دقيقتين ، و 1x ماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين. هنا ، احتفظ بالشرائح في ماء الصنبور حتى استرجاع المستضد ، لأن الجفاف سيؤدي إلى ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
3. احتضان الشرائح في عازلة السترات (10 ملي مولار حامض الستريك ، 0.05٪ منظف غير أيوني ، درجة الحموضة 6) عند 125 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وعند 90 درجة مئوية لمدة 10 ثوان. دعهم يبردوا ، ثم اشطف الشرائح 5 مرات بالماء المقطر.
4. احتضان الشرائح في RT في 0.3٪ H₂O ₂ لمدة 30 دقيقة.
5. اغسل الشرائح 3 مرات في محلول الغسيل (0.025٪ منظف في محلول ملحي مخفض [TBS]) لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
6. احتضان الشرائح في RT بمحلول مانع (مصل حصان 10٪ ، ألبومين مصل بقري 0.1٪ [BSA] في TBS) لمدة 30 دقيقة.
7. احتضان الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة مع جسم مضاد أولي محضر في محلول التخفيف (0.1٪ BSA في TBS). اغسل الشرائح 3 مرات في عازلة الغسيل لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
8. احتضان الشرائح في RT لمدة 1 ساعة باستخدام جسم مضاد ثانوي بيوتينيل محضر في محلول التخفيف. اغسل الشرائح 3 مرات في عازلة الغسيل لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
9. احتضن الشرائح في RT في الظلام لمدة 30 دقيقة باستخدام مركب بيروكسيداز الفجل الحار أفيدين البيوتينيل. اغسل الشرائح 3 مرات في عازلة الغسيل لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
10. احتضن الشرائح باستخدام 3،3′-Diaminobenzidine (DAB)-H₂O₂ العلامات التجارية للركيزة هنا لمدة 2-5 دقائق في RT.
11. اشطف 3 مرات بماء الصنبور. اغمس (1-2 ثانية) الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمواجهة تلطيخها ، ثم اشطفها جيدا في ماء الصنبور حتى تصبح صافية.
12. جفف الشرائح على النحو التالي: احتضان في الماء المقطر لمدة دقيقتين ، واغمس 3 مرات في 80٪ من الإيثانول ، واحتضان في 95٪ من الإيثانول مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما ، واحتضان في 100٪ من الإيثانول مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما ، وأخيرا في الزيلين 3 مرات لمدة 3 دقائق لكل منهما.
13. قم بتغطية الشرائح بوسيط تثبيت قائم على الزيلين واتركها تجف على سطح مستو عند RT حتى تصبح جاهزة للتصوير.

} ملاحظة: في حالة إجراء تلطيخ DAB ، يمكن تخزين الشرائح في RT. ومع ذلك ، إذا تم إجراء تلطيخ التألق المناعي ، فيجب تخزين الشرائح في الظلام عند -20 درجة مئوية لتقليل التبييض الضوئي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أرنب متعدد النسيلة مضاد ATRX,	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	sc-15408	IHC, 1:: 250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat poly-clonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18