تصور الجلطة الدماغية في الفأر باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق

الملخص

المصدر: كيم ، د. ، وآخرون. al. التصوير الفلوري القريب من الأشعة تحت الحمراء والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتصور الجلطات الدماغية مباشرة. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تصور الجلطات الدماغية في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (التصوير المقطعي المحوسب الدقيق). يتم حقن نموذج فأر الجلطة الدماغية بجزيئات نانوية ذهبية مستهدفة بالفيبرين تعمل كعامل متباين. يتم وضع الماوس على سرير جهاز التصوير المقطعي المحوسب الصغير ، ويتم الحصول على الصور من زوايا متعددة. باستخدام البرامج المناسبة ، يتم إعادة بناء الصور ومعالجتها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير جلطة مشكلة خارجيا تحمل علامة مضان (الشكل 1)

1. تخدير الفأر في غرفة الحث باستخدام 3٪ إيزوفلوران ممزوج ب 30٪ أكسجين (1.5 لتر / دقيقة 100٪ أكسجين). تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال مراقبة قوة العضلات وتأكيد عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
2. ضع على ستارة معقمة في وضع الانبطاح واحتفظ به تحت التخدير باستخدام قناع استنشاق و 2٪ إيزوفلوران ممزوج ب 30٪ أكسجين. قم بتنفيذ الإجراءات التالية باستخدام تقنيات التعقيم والعباءات / الأقنعة / القفازات / الأدوات المعقمة. حافظ على ظروف معقمة عن طريق تنظيف وتعقيم منطقة التجربة بنسبة 70٪ كحول قبل وبعد الإجراءات.
3. اجمع حوالي 300 ~ 1,000 ميكرولتر من الدم الشرياني بعد ثقب القلب. امزج 70 ميكرولتر من الدم الكامل مع مسبار 30 ميكرولتر C15 (تركيز 20 ميكرولتر / لتر) ، وهو مسبار فلوري Cy5.5 حساس لنشاط التشابك الفيبريني لإنزيم التخثر العامل الثالث عشر المنشط (FXIIIa) ، لتمييز الجلطة بالفلورسنت ( الشكل 1 أ ). حقن الدم المختلط باستخدام حقنة سعة 3 مل (إبرة قياس 23) في أنبوب بولي إيثيلين بطول 20 سم (PE-50 ، معرف 0.58 مم). يجب تعقيم أنابيب البولي إيثيلين (أو اعتمادها معقمة من قبل الشركة المصنعة) ، ويجب تحضير الجلطات بشكل معقم في غطاء زراعة الأنسجة.
4. تحقق من موت من خلال ملاحظة قلة التنفس والنبض القلبي.
5. اترك الأنبوب المحمل بالدم في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، ثم عند 4 درجات مئوية لمدة 22 ساعة ، وقم بتنفيذ الإجراءات التالية ، كما تم الإبلاغ عنه سابقا.
6. قطع الأنبوب المحتوي على الجلطة إلى قطع بطول 1.5 سم. باستخدام حقنة سعة 3 مل مملوءة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، قم بطرد الجلطة على صفيحة 6 آبار تحتوي على PBS عن طريق حقن PBS برفق في كل قطعة من الأنبوب. اغسل الجلطة ثلاث مرات باستخدام PBS ( الشكل 1 ب ).
7. قم بتحميل الجزء النهائي البعيد من أنبوب PE-10 بطول 15 سم (معرف 0.28 مم) بخثرة بطول 1.5 سم عن طريق سحب الجلطة المغسولة بعناية ، مع تجنب فقاعات الهواء ، باستخدام حقنة مملوءة بالمحلول الملحي سعة 1 مل بإبرة قياس 30 يتم إدخالها في الطرف القريب من الأنبوب.
8. قم بتوصيل أنبوب PE-10 المحمل بالجلطة بأنبوب PE-50 بطول 3 سم (معرف 0.58 مم) معدل ليكون له نهاية مدببة (معرف 200 ميكرومتر) ، والذي سيتم وضعه على الشريان الدماغي الأوسط (MCA) - منطقة تشعب الشريان الدماغي الأمامي (ACA) للشريان السباتي الداخلي (ICA) في نموذج فأر للسكتة الدماغية الصمية ( الشكل 1C ).

2. نمذجة نموذج فأر لسكتة دماغية جلطية الدم (الشكل 2)

1. تخدير فأر مختلف ليتم ضربه في غرفة الحث باستخدام 3٪ إيزوفلوران ممزوج ب 30٪ أكسجين (1.5 لتر / دقيقة). حقن ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ) تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال مراقبة قوة العضلات وتأكيد عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
2. ضع كمية صغيرة من المرهم البيطري على كل عين لمنع الجفاف أثناء التخدير. قم بإجراء العمليات الجراحية التالية باستخدام تقنيات التعقيم والعباءات / الأقنعة / القفازات / الأدوات المعقمة. حافظ على ظروف معقمة عن طريق تنظيف وتعقيم منطقة الجراحة بالكحول بنسبة 70٪ قبل الجراحة وأثناءها وبعدها.
3. حرك الماوس إلى طاولة العمليات. ضع على ستارة معقمة في وضع الانبطاح واحتفظ به تحت التخدير باستخدام قناع استنشاق و 2٪ إيزوفلوران. بعد ذلك ، قم بتثبيت درجة حرارة الجسم عند 36.5 درجة مئوية باستخدام بطانية حرارة منزلية مع ردود فعل من مقياس حرارة المستقيم.
4. بعد التحضير الجراحي بالبيتادين و 70٪ كحول ، قم بعمل شق عمودي بطول 1 سم باستخدام مشرط على فروة الرأس بين الأذن اليسرى والعين. قم بلصق الطرف البعيد للألياف الضوئية لمقياس تدفق دوبلر بالليزر على سطح العظم الصدغي الأيسر المكشوف (1 مم يسار و 4 مم أسفل البريجما). بعد ذلك، ابدأ مراقبة تدفق دوبلر ( الشكل 2A).
5. ضع. قم بتصويب الرقبة عن طريق شد السن الأمامي العلوي بخيط متصل بدبوس ، وحلق منطقة الرقبة. بعد ذلك ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط بطول 3 سم ، وانشره مفتوحا ، وكشف منطقة البصلة السباتية اليسرى عن طريق تشريح الأنسجة الرخوة المحيطة بالأوعية الدموية. احرص على عدم إصابة العصب المبهم.
6. اربط الشريان السباتي المشترك القريب الأيسر (CCA) باستخدام خياطة حريرية سوداء معقمة 6-0 ، وربط ICA الأيسر والشريان الجناحي الأيسر (PPA) باستخدام خيوط حريرية سوداء معقمة 7-0.
7. كي الشريان السباتي العلوي الأيسر ، وهو فرع من الشريان السباتي الخارجي الأيسر ، باستخدام كي كهربائي أحادي القطب ، وربط الشريان السباتي الخارجي القريب الأيسر (ECA) بشكل فضفاض والموقع البعيد بإحكام باستخدام خيوط حريرية سوداء معقمة 7-0.
8. باستخدام مقص دقيق ، قم بعمل ثقب صغير (قطره حوالي 0.2 ~ 0.25 ميكرومتر) بين المواقع المربوطة في ECA.
9. أدخل القسطرة المحتوية على الجلطة في الفتحة الموجودة في ECA أثناء فك ربط ECA القريب. شد ربط ECA القريب مرة أخرى بعد دفع القسطرة إلى CCA من أجل تثبيت القسطرة في مكانها.
10. الكي لقطع الجزء البعيد ECA ، وهو بعيد عن موقع الربط البعيد ، وقم بتدوير ECA القريب الحر في اتجاه عقارب الساعة لمحاذاة اتجاه ICA أثناء سحب القسطرة من CCA. بعد ذلك ، تقدم القسطرة حوالي 9 مم إلى منطقة تشعب MCA-ACA من ICA البعيدة مباشرة بعد تخفيف ربط ICA. ثم, تشديد ربط ICA.
11. ضع الجلطة في منطقة التشعب عن طريق الضغط برفق على المحقنة 1 مل لحقن الجلطة. تحقق من انخفاض تدفق الدم الدماغي دوبلر (CBF) ، والذي يجب خفضه بنسبة 30٪ أو أقل مقارنة بخط الأساس ، إذا نجح الجلطة في سد الوعاء الدموي ( الشكل 2 ب ).
12. قم بإزالة القسطرة ، وربط الموقع القريب من ECA على الفور وبإحكام. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإلغاء التزام التقييم القطري المشترك واتفاقية شراء الطاقة.
13. أغلق موقع الشق باستخدام 6-0 خيوط حريرية. توقف عن التخدير بعد مواصلة مراقبة دوبلر خلال الفترة الزمنية المطلوبة (هنا ، لمدة 30 دقيقة بعد حقن الجلطة). أعد الماوس في قفص فارغ ، واحتفظ به دافئا باستخدام مصباح تدفئة. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يكتسب وعيا كافيا للحفاظ على الاستلقاء القصي.

3. في الجسم الحي التصوير المقطعي المحوسب المجهري للجلطة الدماغية (الشكل 3)

1. {{}} إعادة تخدير الفأر بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران كما هو موضح في الخطوة 2.1 في نقطة زمنية محددة مسبقا (هنا ، 1 ساعة) بعد ظهور السكتة الدماغية الصمية بسبب وضع الجلطة الدماغية في الشريان الدماغي. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال تأكيد عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. ضع كمية صغيرة من المرهم البيطري على كل عين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
2. قم بتعليق جزيئات الذهب النانوية المستهدفة بالفيبرين (فيب-GC-AuNP4) بتركيز 10 مجم Au / ml في 10 ملي مولار PBS ، وصوتنة عامل تصوير الجلطة لمدة 30 دقيقة لضمان انحلال وتشتت الجسيمات النانوية. حقن 300 ميكرولتر من الفيبونيال GC-AuNP (10 مجم / مل) في وريد القضيب.
3. ضع على سرير جهاز التصوير المقطعي المحوسب ، وقم بتصويب الرقبة عن طريق سحب السن الأمامي العلوي بخيط متصل بدبوس لتقليل القطع الأثرية للحركة.
4. في 5 دقائق بعد حقن fib-GC-AuNP ، ابدأ في الحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة للدماغ. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا ، استخدم معلمات التصوير التالية: 65 كيلو فولت ، 60 ميكرو أمبير ، 26.7 × 26.7 × 27.9 مم ³ مجال رؤية ، 0.053 × 0.053 × 0.054 مم ³ حجم فوكسل ، 100 مللي ثانية لكل إطار ، متوسط واحد ، 360 مشاهدة ، مصفوفة إعادة بناء 512 × 512 ، 600 شريحة ، وقت المسح الضوئي 64 ثانية.
5. أعد الماوس إلى قفص فارغ ، واحتفظ به دافئا باستخدام مصباح تدفئة. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يكتسب وعيا كافيا للحفاظ على الاستلقاء القصي.
6. قم بتحويل بيانات الصورة الأولية إلى تنسيق التصوير الرقمي والاتصالات في الطب (DICOM) باستخدام الأمر " Start" من لوحة " إعادة البناء " في حزمة برامج مثبتة على ماسح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق.
7. للتحليلات الكمية للصور (في الخطوة 6)، قم بتحويل بيانات DICOM إلى تنسيق TIFF باستخدام حزمة برامج متوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
8. للتحليلات النوعية وكذلك التحليلات الكمية بطريقة أبسط وأسرع ، استخدم حزمة البرامج والصور الأصلية بسمك 0.054 مم بتنسيق DICOM لإنشاء مجموعة جديدة من الصور المحورية والإكليلية التي يتم عرضها بسماكة 1 أو 2 مم (هنا ، 2 مم) ، على النحو التالي.
   1. حدد مجلد DICOM على شجرة "Data Source"، وانقر فوق زر الماوس الأيمن، واستورد المجلد إلى "MasterDB" أو "PrivateDB".
   2. انقر فوق "MasterDB" أو "PrivateDB" في شجرة "مصدر البيانات"، وحدد المجلد الذي تم استيراده. بعد النقر فوق علامة التبويب "3D" في اللوحة الموجودة في أقصى اليسار ، عندما تنبثق نافذة "خيارات التحميل" ، اضغط على "OK " لاستيراد سلسلة من الصور في المجلد كمكدس.
   3. قم بتغيير تمثيل الصورة إلى تنسيق الإسقاط الأقصى للكثافة (MIP) بالنقر فوق الكلمة "MRP" في نوافذ الصور المحورية والإكليلية واختيار "MIP" في القائمة المنبثقة. بعد ذلك ، قم بتغيير سمك الصورة إلى 2 مم بعد النقر فوق "TH : 0 [mm] " في نفس النافذة.
   4. باستخدام شريط الملاح ثلاثي الأبعاد بعرض 2 مم الذي يسمح باستكشاف مكدس الصور وتقطيعه بزاوية وموقع مناسبين ، قم بإعداد صورة مقطع محوري بسمك 2 مم مع تغطية كاملة لدائرة ويليس (COW) ، التي تؤوي جلطة الدم. انقر فوق زر الالتقاط (رمز الكاميرا) في لوحة " الإخراج ". احفظ الصورة بتنسيق TIFF.
9. بعد ذلك ، قم بإعداد خمس صور للمقطع الإكليلي بسمك 2 مم تغطي بشكل متجاور من الفص الجبهي إلى المخيخ.
   1. أولا ، قم بإعداد الشريحة الثانية عن طريق محاذاة شريط الملاح بعناية على الصورة المحورية بحيث يمكن للصورة الإكليلية تصور تجلط MCA-ACA بشكل أفضل.

بعد ذلك ، قم بإعداد الشرائح الأربع الأخرى بطريقة متجاورة. انقر فوق زر الالتقاط (رمز الكاميرا) في لوحة " الإخراج". احفظ الصور بتنسيق TIFF.

النتائج

الشكل 1: نظرة عامة على تحضير جلطة دموية تحمل علامة الفلورسنت. (أ) خلط الدم الكامل الطازج مع مسبار الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء (NIRF) Cy5.5 (C15) المرتبط تساهميا بخيوط الفيبرين في الجلطة عن طريق العمل الأنزيمي المتشابك للفيبرين لعا...

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resized'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Machines microCTNanoFocusRay ، JeonJu ، كورياNFR Polaris-G90 مقياس الجريان بالليزر دوبلرPerimed ، ستوكهولم ، السويدنظام PeriFlux 5000 مجهر جراحيLeica Microsystems ، سيول ، كورياEZ4HD آلة التخدير الاستنشاقيةPerkinElmer ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةXGI-8 Software NFR التحكمفي NanoFocusRay ، JeonJu ، كورياNFR Polaris-G90microCT برنامج التحكمLucionInfinitt ، سيول ، كورياLucion3D تقديم برنامج التصويرمخطط المختبر 7ADInstruments ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةمخطط المختبر 7rCBFImage J softwareWanye Rasband ، NIH ، الولايات المتحدة الأمريكية1.49dتحليل التصويرالأجهزة / الأدوات مضخة التسريبهارفارد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةمضخة 22 ( 55-2226) بطانية حرارة منزليةPanlab ، برشلونة ، إسبانياHB101 جيب كيودايجونج ، سيول ، كورياDJE-39 ماتريكة الدماغتيد بيلا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية15003القسم الإكليليPE-50 أنابيبناتسومي ، طوكيو ، اليابانSP-45 (PE-50) معرف 0.58 مم OD 0.96 ممأنابيب PE-10ناتسومي ، طوكيو ، اليابانSP-10 (PE-10) معرف 0.28 مم OD 0.61 مم30 مقياس إبرةsungshim-medical ، سيول ، كوريا حقنةCPL-Medical ، أنسان ، كوريا 1 و 3 سم مكعبشاشباناميديك ، تشيونان ، كوريا الشريط سكوتش ، سيول ، كوريا3M-810 مايكرو أدوات العلوم الدقيقة الملقط، فانكوفر ، كندا11253-27أدوات العلوم الدقيقة #L5 مقصدومون ، فانكوفر ، كندا15000-03أدوات العلوم الدقيقة مقص الربيع Vannas، فانكوفر ، كندا14084-08خياطة حريرية سوداء8.5 سم Ailee ، بوسان ، كورياSK6071 ، SK7286-0 و 7-0كواشف ميلوكسيكاميوهان ، سيول ، كوريا مرهم بيطرينوفارتيس ، بازل ، سويسرا 10٪ بوفيدون اليود (بيتادين) فيرسون ، تشون آن ، كوريا كلوريد الحديديكسيجما ، ميسوري ، الولايات المتحدة157740-5G TTCAmresco ، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية0765-100 جم إيزوفلورانهانا فام ، جيونجي ، كورياإيفران100 ملPBSWelgene ، دايجو ، كورياLB001-02500 ملمن الجسيمات النانوية الذهبية التوليفالمحلول الملحيالعادي دايهان فام ، سيول ، كوريا48N3AF320 مل