التسجيل والتلوين الخلوي المتجاوب لرسم خرائط دقيقة للنشاط العصبي في الفئران المستيقظة

الملخص

المصدر: Moore, J. D., et al. مراقبة وتوطين الخلايا العصبية المفردة داخل هياكل الدماغ تحت القشرية للفئران التنبيهية المقيدة بالرأس. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو طريقة التسجيل المتجاوب والتلطيخ في فأر مستيقظ مقيد. يتضمن الإجراء تسجيل الإشارات من الخلايا العصبية وحقن الصبغة لتحديد موقع التسجيل بدقة. تسمح هذه التقنية برسم خرائط دقيقة للنشاط العصبي للبنية التشريحية للدماغ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. المراقبة الخلوية المجاورة للوحدات العصبية

1. اسحب أنابيب الكوارتز الشعرية على مجتذب ماصة دقيقة بالليزر ثاني أكسيد الكربون (انظر قسم المواد) بأقطار طرف أقل من 1 ميكرومتر ( الشكل 2 أ ).
   ملاحظة: ستختلف معلمات التسخين وفقا للأداة المعينة ، وأن قطر العنق المطلوب سيختلف اعتمادا على بنية الدماغ التي تهمك. بالنسبة للتسجيلات في مهاد الفئران، تتراوح أعناق الماصات الدقيقة من 5-7 مم.
2. قم بتثبيت الماصة في مكانها تحت مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) المجهز بأهداف لمسافات العمل الطويلة. استخدم طين النمذجة لتثبيت الماصة في مكانها على منصة المجهر.
3. حرك ببطء كتلة زجاجية (بسمك 0.5 - 1 سم ؛ قطعة من الزجاج المستخدمة في صنع سكاكين فائقة الصغر مناسبة) إلى مجال الرؤية باستخدام طرف الماصة. باستخدام أداة المعالجة الدقيقة للمسرح ، المس طرف الماصة برفق على الزجاج ، مما يتسبب في كسرها. كرر ذلك حسب الضرورة حتى يتراوح القطر الخارجي لطرف الماصة بين 1-3 ميكرومتر ( الشكل 2 ب، ج ). تأكد من أن هذه الماصات الدقيقة لها مقاومة تتراوح بين 5-15 ميجا أوم تقريبا.
4. تحضير محلول ملحي خارج الخلية (135 ملي كلوريد الصوديوم ، 5.4 ملي كلوريد كلوريد ، 1.8 ملي كلور الملطيم ₂ ، 1 ملي مللي كلوريد ₂ ، 5 ملي مولار هيبس (4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثانسلفونيك) ، درجة الحموضة 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم) وإضافة 2٪ (وزن / حجم) شيكاغو سكاي بلو. املأ الطرف الخلفي من الماصة بالمحلول باستخدام حقنة بإبرة 30 جم أو أصغر. بدلا من ذلك ، لوضع العلامات أحادية الخلية المتجاورة ، أضف 2٪ (وزن / حجم) Neurobiotinin أو أمين ديكستران البيوتينيل (BDA-3000 أو BDA-10000) إلى المحلول الملحي بدلا من Chicago Sky Blue.
5. ضع الجرذ داخل جورب القماش داخل الأنبوب الصلب على رقصة تجريبية مناسبة ( الشكل 1 ). انتظر ما لا يقل عن 72 ساعة بعد الجراحة قبل وضع على رقصة مسند الرأس. شد الرباط حول القص العلوي ، بدلا من الرقبة ، لتجنب انسداد مجرى الهواء. إذا بدا أن التنفس صعب أو مسدود ، فقم بفك الرباط أو حركه للخلف. قم بهذا الإجراء بينما يكون الجرذ في حالة تأهب.
6. قم بتوصيل لوحة تقييد الرأس على الفئران بالقطعة المقابلة على الرقصة. للقيام بذلك ، قم أولا بتثبيت لوحة مسند الرأس في مكانها ، ثم قم بتثبيتها باستخدام برغي 4-40. تأكد من الانتظار حتى يهدأ لتجنب تطبيق عزم الدوران المفرط على الرأس. بعد ذلك ، ضع صمولة 8-32 على مسمار تقييد الرأس المزروع في الفئران. ثم قم بربط قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بخيوط بمسمار الرأس. قم بلصق القضيب على الرقصة التجريبية بحيث يمكن إحكام ربطها في مكانها ( الشكل 1 ).
   ملاحظة: يؤدي تأمين بمسمار الرأس وكذلك لوحة مسند الرأس إلى تقليل ثني الجهاز وتحسين ثبات التسجيل. في معظم الحالات ، يمكن أن يبدأ التسجيل في اليوم الأول الذي يكون فيه مقيدا بالرأس. ومع ذلك ، إذا كان يتململ بشكل مفرط أو ينطق ، فقدم يوما واحدا من التدريب على التعود على تقييد الرأس قبل البدء في أي تسجيلات. في هذه الحالة ، اترك على الرقصة لمدة 15 دقيقة ثم ضعه مرة أخرى في قفصه. كرر هذه الخطوة في اليوم التالي واستمر في البروتوكول.
7. افتح غرفة التسجيل وقم بإزالة هلام السيليكون. إذا نمت الأنسجة مرة أخرى في حج القحف ، فقم بتنظيفها باستخدام ملقط دقيق.
8. قم بتوصيل الماصة بجهاز المعالجة الدقيقة الآلي، وقم بتوصيل مكبر الصوت الأولي لمرحلة الرأس.
   ملاحظة: في العرض الحالي ، تقوم دائرة ترحيل صغيرة على مرحلة الرأس بالتبديل بين أسلاك الرصاص لمكبر الصوت ومصدر تيار خارجي مع امتثال عال ( الشكل 3A-C ). لاحظ أن بعض مكبرات الصوت لها مصدر مناسب مدمج عالي التوافق.
9. استخدم المعالج الدقيق الآلي لتحريك طرف الماصة إلى العلامة المحددة بشكل مجسم في غرفة التسجيل. لاحظ إحداثيات هذا الموقع. احرص على عدم كسر طرف الماصة على الجمجمة.
10. انقل الماصة إلى موقع التسجيل المطلوب في المحاور الأمامية والخلفية والمتوسطة الجانبية. ثم قم بدفع الماصة بطنيا عبر الجافية حتى تصل إلى حوالي 500 ميكرومتر ظهرية إلى موقع التسجيل المقصود.
11. قم بدفع الماصة ببطء أثناء الاستماع إلى أحداث الارتفاع على شاشة صوتية للجهد المضخم المسجل بين طرف الماصة والسلك المرجعي. بمجرد تحديد أحداث الارتفاع ، استمر في تحريك الماصة من 0 إلى 100 ميكرومتر حتى يتم ملاحظة انحرافات الجهد الموجب التي تزيد عن 500 ميكرو فولت تقريبا.
    ملاحظة: ستزداد مقاومة القطب بمعامل 1.5-10 تقريبا عند حدوث ذلك.
12. يجب أن يبدأ التسجيل بمجرد عزل الوحدة ، جنبا إلى جنب مع جميع المقاييس السلوكية والفسيولوجية الأخرى ذات الأهمية. في العرض الحالي ، تتم مراقبة حركات الاهتزاز التي تم إنشاؤها ذاتيا باستخدام تصوير فيديو عالي السرعة (انظر المواد القسم).
13. لتسمية موقع التسجيل ، قم بتبديل أسلاك القطب للاتصال بالمصدر الحالي. هناك عدة طرق للقيام بذلك ، إما باستخدام دائرة ترحيل ( الشكل 3 أ - C ) ، أو مصدر حالي مدمج على مكبر الصوت ، أو يدويا ( الشكل 3D) . قم بتمرير -4 ميكرو أمبير مع نبضات مدتها 2 ثانية عند دورة عمل 50٪ لمدة 4 دقائق لحقن Chicago Sky Blue أيونيا عبر الماصة.
14. اقتل وقم بنقحه بعد عدة إجراءات وضع العلامات وفقا للممارسة القياسية. قسم الدماغ وقم بتحديد الموقع التشريحي لموقع التسجيل. قم بمكافحة تلطيخ الأنسجة لتفاعل السيتوكروم أوكسيديز. بدلا من ذلك ، حدد رواسب Chicago Sky Blue باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
    ملاحظة: للتمييز بدقة بين الوحدات المختلفة ذات الملصقات، من المهم أن تصنع جميع الملصقات بنفس الماصة في نفس اليوم، دون فك تثبيت الماصة بين الملصقات. في هذه الحالة ، يمكن تمييز مواقع التسجيل حسب مواقعها النسبية في علم الأنسجة اللاحق ، جنبا إلى جنب مع إحداثيات المتلاعب الملحوظة لكل موقع. لتحديد لا لبس فيه ، ضع علامة على الملصقات بمسافة 200 ميكرومتر على الأقل عن بعضها البعض ، ولا تزيد عن 3-5 ملصقات لكل منطقة في الدماغ.

النتائج

الشكل 1: الرقصة التجريبية. رسم تخطيطي للفئران في الرقصة الميكانيكية لتجارب المراقبة الفيزيولوجية الكهربية والسلوكية. يستخدم الرقصة الشريط واللوحة

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Ketaset (Ketamine HCl)Fort DodgeN / A Anased (محلول Xylazine)Lloyd LaboratoriesN / A Betadyne (Povidone-Iodine)CVS Pharmacy269281 Loctite 495Grainger Industrial Supply4KL8620-40 cp cyanoacrylateVetbond3M1469SB Grip مسحوق الأسمنتDentsply Intl675571لقاعدة غرفة التسجيلسائل الأسمنتGrip Dentsply Intl675572لقاعدة غرفة التسجيلSiliconeGel Dow CorningMar-80 مسحوق الأكريليك لإصلاح أطقم الأسنان النفاثةشركة لانج لتصنيع الأسنانغير متاحلتأمين جهاز مسند الرأس إلى الجمجمةOrtho-Jet سريع المعالجة سائل راتنج الأكريليك لتقويم الأسنان Lang Dental Manufacturing Co.غير متاحلتأمين جهاز تقييد الرأس بالجمجمةشيكاغو السماء الزرقاءسيجماC8679 ParaformaldehydeSigma158127للتروية وتثبيت الأنسجةمحلول ملحي مخزن بالفوسفاتSigmaP3813للتروية وتثبيت الأنسجةالسيتوكروم CSigmaC2506 DiaminobenzidineSigmaD5905 جورب الفئرانخياطة أنيقة (سان دييغو ، كاليفورنيا) N / A أنبوب PVC 2 1/2 "شركة بلاستيك أمريكية.34108 دبابيس ومآخذ D Subminiature TEConnectivity205089-1 سلك موسيقى من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.010 "قطرPrecision Brand Products، Inc.21010 إطار عقد تجسيميKopfInstruments نموذج 900 قضبان الأذن التجسيميةKopf Instrumentsنموذج 957 مناور StereotaxicKopfInstruments نموذج 960 1/2 مم لدغ الحفرهنري شاين100-3995 حفر الأسنان في الهواء الهادئالغرب الأوسط الأسنان393-1600 الفولاذ المقاوم للصدأ 0-80 1/8 "برغيالسحابة سوبرستور 247438 0.2 مل أنبوب الطرد المركزيفيشر العلمي05-407-8A قضيب تثبيت الرأس المخصصUCSD SIO MachineShop N / A الزاوية اليمنى بعد المشبكنيوبورتMCA-1 8-32 3/4 " برغيالسحابة Superstore240181 4-40 1/4 "برغيالسحابة Superstore239958 الكوارتز الأنابيب الشعريةأدوات SutterQF-100-60-10 بمحركات micromanipulatorSutter InstrumentsMP-285 Microelectrode مكبرللصوت الأجهزة الجزيئيةMulticlamp 700Bالجزء البديل: الأجهزة الجزيئية Axoclamp 900A مرحلة رأس مكبر للصوت الكهربائيالصغير الأجهزة الجزيئيةCV-7Bالجزء البديل: HS-9Ax10 مع الأجهزة الجزيئية Axoclamp 900Aمحفز النبض المعزولأنظمةAM موديل 2100الجزء البديل: HS-9Ax10 مع الأجهزة الجزيئية Axoclamp 900Aمراقب الصوتراديو شاك32-2040 سلك الرصاص الكهربائيسلك كونرNEF34-1646 مرحل لمكبر للصوت في مرحلةالرأس COTO Technology # 2342-05-000 (اختياري) تستخدم مع لوحة الدوائر المطبوعة المصنوعة حسب الطلب (UCSD Physics Electronics Shop) ، الشكل 6A-Cكاميرا فيديو رقميةBaslerA602fm حامل ماصةWarner Instruments#MEW-F10T لوحة مخصصة لتثبيت الرأسUCSD SIO Machine ShopN / A