$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. وضع العلامات على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) باستخدام الجسيمات النانوية لأكسيد الحديد الفائق المغناطيسي (SPIO)
- لتسمية الخلايا الجذعية الوسيطة باستخدام SPIO ، أضف 6 مل من وسائط الملصقات (25 ميكروغرام / مل من SPIO في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع عدم وجود مصل بقري جنيني (FBS)) إلى قارورة T75 تحتوي على الخلايا الجذعية الجذعية (التقاء 80٪).
- احتضان الخلايا بوسائط الملصقات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) دون اهتزاز. بعد 24 ساعة، قم بإزالة وسائط الملصقات برفق باستخدام ماصة باستور معقمة برأس بلاستيكي متصل بالمكنسة الكهربائية. اغسل الخلايا أحادية الطبقة 2x ب 6 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة أي آثار ل SPIO غير الداخلي.
- لتحديد ما إذا كانت الخلايا قد تم تصنيفها بنجاح، تحقق من الخلايا المصنفة تحت مجهر فلوري أو مجهر متحد البؤر إذا كان SPIO قد تم تمييزه بالفلوروفور (أي مثل تلك المستخدمة هنا. الشكل 1 ب ، ج).
- حصاد الخلايا الملتصقة بالمعالجة ب 3 مل من التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أضف 7 مل من وسائط DMEM الدافئة مسبقا مع FBS 10٪ (v / v) لتعطيل التربسين. اجمع معلق الخلية باستخدام ماصة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة تريبان الزرقاء ومقياس كثافة الدم.
ملاحظة: ستظهر حبيبات الخلية للخلايا المسماة بلون غامق بسبب تحميل الحديد (الشكل 1 د). هذا البروتوكول مناسب لوضع العلامات على MSC والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). تم تحسين إجراء وضع العلامات على MSC مسبقا ، ويتم تضمين خطوات إعداد MSCs المسماة فقط لتتبعها في الجسم الحي ، نظرا لأن التتبع في الجسم الحي هو التركيز. يجب تحسين بروتوكول زراعة ووضع العلامات على أنواع الخلايا الأخرى من قبل الباحث. - اضبط تركيز الخلية باستخدام PBS على 150,000 خلية (أو رقم ينتج عنه إشارة تصوير بالرنين المغناطيسي كافية) في 18 ميكرولتر من PBS (أو الحجم الكلي الذي سيتم استخدامه في إجراء التوصيل داخل الأنف).
ملاحظة: لوحظ أن تركيز الخلية أعلى من 150,000 خلية / 18 ميكرولتر من PBS يؤدي إلى تراكم الخلايا ، مما قد يؤثر على كفاءة الولادة داخل الأنف. إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أكبر من الخلايا للتوصيل داخل الأنف ، فقم بزيادة الحجم الكلي لتعليق الخلايا وزيادة عدد الإدارات داخل الأنف ، حيث أن الإعطاء داخل الأنف هو إجراء غير جراحي ، ويمكن إجراء جرعات متعددة.
2. إصابة التأثير القشري المتحكم فيه (CCI)
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم الاحتفاظ بذكور الفئران C57 BL / 6 (7-8 أسابيع) في دورة إضاءة / مظلمة مدتها 12/12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
- لتحضير كل فأر لإصابة CCI، قم بتطبيق كوكتيل التخدير زولازيبام (50 ملغم/كغ) والزيلازين (20 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) (1 مل/كغ). تأكد من أن عمق التخدير كاف بسبب عدم وجود استجابة لقرص إصبع القدم. بدلا من ذلك ، ضع الفأر في غرفة مزودة ب 2٪ -4٪ isoflurane لمدة 60 ثانية.
- احلق فرو السطح الظهري للجمجمة بين الأذنين باستخدام ماكينة قص الشعر الإلكترونية. نظف المنطقة المحلوقة عدة مرات باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة باليود. استخدم قطعة قطن مبللة ب 70٪ إيثانول لتنظيف اليود.
- ضع الماوس المخدر في الإطار التجسيمي وقم بتأمين الماوس باستخدام قضبان الأذن وقضبان الأنف. قم بعمل شق متوسط السهمي (حوالي 2.5 سم) في الجلد المحلوق باستخدام مقص معقم للوصول إلى سطح الجمجمة.
- قم بإزالة الأنسجة الموجودة على العظم باستخدام وسادة قطنية لكشف الجمجمة. نظف سطح الجمجمة باستخدام قطعة قطن مبللة ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ (H2O2) لمدة 10 ثوان ، ثم نظفها بقطعة قطن جافة.
ملاحظة: يمكن الآن التعرف بسهولة على خيوط الجمجمة وكل من بريجما ولامدا. - حدد الإحداثيات المختارة على سطح الجمجمة لإصابة CCI وارسم دائرة (قطر 4 مم) حول الإحداثيات باستخدام قلم رصاص أو قلم تحديد مناسب.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام الإحداثيات في الأمام الخلفي (AP) -2.0 مم والمتوسطة الجانبية (ML) +1.5 مم لتحريض CCI. - استخدم مثقاب دقيق ونتوءات دائرية (قطرها 0.5 مم) لتخفيف الجمجمة في الدائرة المحددة. تجنب الضغط أثناء الحفر ، لأن الحفر عبر العظام قد يتسبب في تلف حمة الدماغ. نظف غبار العظام باستخدام قطعة قطن نظيفة وجافة.
- قم بإزالة السديلة العظمية برفق باستخدام ملقط دقيق معقم لكشف الأم الجافية مع الحفاظ عليها سليمة. قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي الذي تم استخدامه للتحضير قبل الإصابة وضعه في الإطار التجسيمي لجهاز CCI.
- قم بتثبيت رأس الماوس باستخدام قضبان الأذن وقضبان الأنف. تأكد من أن رأس الماوس مستوي في الاتجاه الذيلي وضبط قضبان الأنف ، إذا لزم الأمر.
- اتبع التعليمات الموجودة على صندوق التحكم لتصفير طرف الاصطدام على السطح القشري المكشوف. تأكد من محاذاة طرف المصطدم مباشرة فوق إحداثيات القشرة المطلوبة ليتم إصابتها باستخدام عجلات التحكم X و Y على قاعدة المصطادم.
- اضبط معلمات التجربة باستخدام صندوق التحكم بسرعة 5 م / ث ، ووقت السكون 250 مللي ثانية ، وعمق الإصابة 1 مم للحث على إصابة خفيفة في الماوس.
- إحداث الإصابة بالضغط على زر "التأثير" في صندوق التحكم. امسح أي نزيف يحدث باستخدام قطعة قطن معقمة.
- قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وأغلق الشق باستخدام خيوط جراحية حريرية. لا تستخدم مشابك معدنية لإغلاق موقع الجراحة ، حيث سيتعرض الفأر لمجال مغناطيسي للتصوير بالرنين المغناطيسي.
- ضع المضادات الحيوية الموضعية (الباسيتراسين نيومايسين) على موقع الجراحة للوقاية من العدوى. احتفظ بالماوس على وسادة التدفئة وراقبه عن كثب أثناء مرحلة الاسترداد.
- تطبيق كيتوبروفين (2.5 ملغم/كغ، IP) يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة، ما لم يتعارض إعطاء الكيتوبروفين مع أهداف الدراسة.
3. الولادة داخل الأنف
- في يوم واحد بعد تحريض CCI ، قم بإعطاء كوكتيل التخدير زولازيبام (50 مجم / كجم) والزيلازين (20 مجم / كجم) عن طريق حقن IP. تأكد من تخدير الماوس بعمق بسبب عدم استجابة قرصة إصبع القدم.
- تحضير الفأر لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية داخل الأنف عن طريق علاج الهيالورونيديز.
- أمسك بقشرة الماوس وأدر ظهرها بقوة مع شل حركة الجمجمة. ضع طرف الماصة التي تحتوي على الهيالورونيداز في PBS معقم (4 U/μL) بالقرب من فتحة أنف الفأر بزاوية 45 درجة.
- قم بإدارة 3 ميكرولتر من تعليق الهيالورونيداز في كل فتحة أنف. حافظ على تثبيت الماوس وواجهه لأعلى على وسادة نظيفة لمدة 5 دقائق. كرر علاج الهيالورونيداز 4 مرات (إجمالي 100 وحدة من تعليق الهيالورونيداز).
- بعد علاج الهيالورونيداز ، احتفظ بالفأر المعالج على وسادة نظيفة متجهة لأعلى لمدة 30 دقيقة.
- لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية إلى الدماغ، أمسك الماوس بإحكام، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1. قم بإدارة 3 ميكرولتر / فتحة أنف من تعليق MSC بفاصل زمني 3 ثوان. استمر في الضغط على الماوس في نفس الوضع لمدة 30 ثانية حتى تختفي قطرات العينة تماما.
ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء أثناء الإعطاء. - كرر الإعطاء بفاصل زمني مدته دقيقتان يصل إلى 3x.
ملاحظة: العدد الإجمالي للخلايا التي سيتم تسليمها هو 150,000 ، بحيث يمكن تسليم 18 ميكرولتر من معلق الخلية بجرعة 3 ميكرولتر لكل فتحة أنف ، 3x لكل منها. - أعد الفأر إلى قفصه وراقبه عن كثب حتى يتعافى تماما من التخدير.
الشكل