التحفيز الكهربائي عبر الجمجمة للقشرة الحركية في فأر مستيقظ

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الإجراء الجراحي: زرع قطب الصدر

ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة عند وضع القطب المضاد خارجيا على الصدر المحلوق بسترة.

1. ضع القوارض المعرضة (على الصدر) على طاولة العمليات.
   ملاحظة: في حالة التخدير بالاستنشاق ، احتفظ بخطم الفئران في فوهة التخدير ، مما يقلل من تركيز الأيزوفلوران إلى 1.5-2٪.
2. تطهير فروة الرأس المحلوقة برذاذ مطهر أو بمسحة مبللة بعامل مطهر (على سبيل المثال ، الإيثانول 70٪) واتركها تجف في الهواء. كرر مرتين.
3. قم بقص الجلد بمشرط في سطر واحد من مستوى العين المنقارية إلى مستوى الأذن الوسطى.
   ملاحظة: يسمح هذا بحفر نفق كابل التوصيل من قطب الصدر المزروع باتجاه الجزء العلوي من الرأس وهو أيضا القطع المطلوب لوضع مقبس قطب التحفيز المباشر للتيار المباشر (DCS).
4. اقلب الجرذ إلى وضع الاستلقاء ، بحيث يتعرض الصدر.
5. تطهير جلد الصدر كما هو موضح في الخطوة 1.2.
6. ارفع الجلد الجانبي للصدر الأيمن باستخدام ملقط الأنسجة وقم بقطع عروة بمقص صغير يبلغ طوله حوالي 0.5 سم من الإبط الأيمن. ثم قم بعمل قطع سهمي مستقيم في اتجاه الجمجمة بالمقص.
7. قم بتشكيل كيس تحت الجلد عن طريق فصل الجلد عن العضلة الصدرية الرئيسية اليسرى. افعل ذلك عن طريق فتح المقص الصغير بشكل متكرر (أو بواسطة قطعة قطن مبللة بالمحلول الملحي).
8. اقلب على جانبه الأيمن لنفق مسار الكابل من الزاوية القذالية اليسرى لجلد الرأس المفتوح على طول الرقبة للخروج إلى الحقيبة الصدرية عن طريق اختراق اللفافة السطحية باستخدام ملقط استتبابي.
9. افتح ملقط التماثل بعناية للإمساك بنهاية كابل القطب الكهربائي المتصل بالقطب البلاتيني دون السماح للأسلاك الحادة بالابتعاد. اسحب الكابل عبر النفق حتى يدخل القطب الكهربائي إلى الحقيبة ، موجها بنقطة اللحام باتجاه الطرف الخلفي الأيسر للقوارض. أعد القوارض إلى وضع الانبطاح.
10. قم بتثبيت اللوحة البلاتينية بخياطة مضفرة اصطناعية معقمة وغير قابلة للامتصاص على اللفافة الصدرية عند فتحتي الزاوية المتعارضتين (يوصى باستخدام 4-5 عقدة لتحقيق الاستقرار).
11. وبالمثل ، قم بتوصيل الكبل باللفافة بواسطة عقدة فضفاضة ، لتشكيل حلقة طفيفة قبل مدخل نفق الأنسجة.
12. أغلق الجلد ب 3-4 خيوط جلدية ، اعتمادا على حجم القطع (يمكن استخدام نفس مادة الخياطة للقطب الكهربائي والكابل).

2. الإجراء الجراحي: وضع مقبس التحفيز الكهربائي للدماغ فوق الجمجمة (tES)

1. ضع في إطار تجسيم.
   ملاحظة: في حالة استخدام التخدير بالاستنشاق ، قم بخفض تركيز التخدير إلى تدفق الأيزوفلوران للصيانة ~ 1.5-1٪ ، تم تعديله وفقا لمنعكس قرصة إصبع القدم ونمط التنفس.
2. تطهير فروة الرأس المحلوقة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
3. اقطع الجلد بمشرط في سطر واحد من مستوى العين المنقارية إلى مستوى الأذن الوسطى.
   ملاحظة: إذا تم إجراء وضع قطب الصدر ، فقد تم بالفعل تنفيذ الخطوتين 2.2 و 2.3.
4. اكشط السمحاق (النسيج الضام على الجمجمة) على الجانبين باستخدام المشرط وامسحه جيدا بمسحات قطنية. قم بتثبيت النسيج الضام في 4 زوايا من القطع باستخدام مشابك البلدغ واتركها تتدلى بشكل جانبي لإبقاء حقل الجراحة مفتوحا.
5. ضع محلول ملحي بنسبة 0.9٪ لتنظيف سطح العظام والأنسجة بمسحات قطنية. ثم نظف سطح العظام بنسبة 3٪ H₂O₂. تجنب ملامسة الأنسجة. بموجب هذا يتم تنظيف العظام بشكل أكثر شمولا وسيتم إيقاف النزيف الطفيف من العظام. أيضا ، تصبح بقايا السمحاق مرئية. قم بإزالة هذه البقايا بقطعة قطن مع الضغط المعتدل.
   ملاحظة: ستؤدي إزالة بقايا السمحاق إلى زيادة التصاق ومتانة مقبس tES الملصق على العظم.
   1. في حالة النزيف الذي لا يمكن إيقافه ، استخدم مثقاب العظام ولمسه لمدة 1-3 ثوان مع ضغط طفيف على العظم. سيؤدي هذا الإجراء الميكانيكي ، في معظم الحالات ، إلى إيقاف النزيف دون تسخين كبير. لا تستخدم أبدا الكي الكهربائي على العظام. حتى التطبيق القصير سيؤدي إلى تلف أنسجة المخ (يجب استخدام الكي الكهربائي فقط لنزيف أنسجة الجرح).
6. نظرا لأن مسامير التثبيت ستعمل على تحسين الالتزام بالإعداد ، فاختر مثقاب يناسب حجم المسمار. ضع فتحتين لدغ على لوحين عظميين مختلفين عن طريق الحفر المسبق باستخدام مثقاب يدوي ثم عن طريق تطبيق الضغط الرأسي الطفيف باستخدام مثقاب العظام. تجنب القرب من الموضع المطلوب لمقبس tES ، لأنه قد يعيق الشد في القطب الكهربائي (على سبيل المثال ، بالنسبة للمحرك الأساسي الأيسر ، اختر موضع المسمار الجداري الأمامي والخلفي الأيمن).
7. في حالة وجود قطب مضاد مزروع ، قم بحفر ثقب ثالث يقع في العظم الجداري الخلفي الأيمن للتثبيت المستقبلي للكابل النفقي.
8. ضع البراغي البلاستيكية في فتحات الأزيز وقم بالمسمار حتى يشعر بالاحتكاك الأول. ثم قم بإجراء ثلاث دورات لولبية إضافية بزاوية 180 درجة. تحقق باستخدام الملقط للتأكد من ثبات المسمار وأضف منعطفا آخر إذا لم يكن ضيقا بدرجة كافية.
   ملاحظة: بالنسبة للفئران البالغة ، سيضمن ذلك وضع البراغي فوق الجافية دون الإضرار بالجافية أو الدماغ (اعتمادا على تصميم الخيط اللولبي ، قد يختلف رقم المنعطف). يجب أن يكون استخدام مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ ممكنا أيضا لأنه حتى في الكثافة الحالية DCS أعلى من عتبة التنكس العصبي. لم يزعج وضع المسمار موقع الآفة أو مداها أسفل البراغي.
9. قم بتشغيل مكواة اللحام وقم بالتسخين المسبق لمدة 5 دقائق تقريبا. قم بلف الكابل الخارج من نفق الأنسجة قذاليا حول المسمار الجداري الأيمن ثم قم بقصه ، مع ترك كابل بطول 1 سم تقريبا خلف اللف. قم بتجريد العزل بعناية في نهاية الكابل بمشرط.
10. ثبت الكابل المتعرج على المسمار والعظم باستخدام الغراء السيانواكريليك.
11. ضع كمية صغيرة من لحام القصدير الخالي من الرصاص على الموصل وعلى الأسلاك العارية لكابل القطب المضاد وقم بتوصيله بالضغط لفترة وجيزة على كلا الجزأين الملحومين مسبقا معا أثناء لمس طرف اللحام حتى يذوب لحام القصدير (حوالي 2-3 ثوان). قم بإزالة طرف اللحام على الفور لتجنب التسخين المفرط للمعدن للكابل مع تلف الأنسجة اللاحق.
12. التقط مقبس القطب الكهربائي tES المصنوع خصيصا (الشكل 1 ب ، باللون الأحمر) باستخدام ملقط طرف مثني ومسنن وقم بتطبيق طبقة رقيقة من الغراء السيانو أكريليك على الحافة السفلية للمقبس. لوضعه فوق القشرة الحركية واستخدام مقبس قطره 4 مم ، ضع نقطة التجويف الوسطى عند 2 مم أمامية و 2 مم جانبية من البرجما. بالنسبة لهذا الموضع ، يجب أن ينتهي الحد الإنسي الداخلي للتجويف مباشرة عند الخيط السهمي ، ويجب أن تنتهي الحدود الذيلية عند ذروة البريجما. اضغط على المقبس لفترة وجيزة على العظم (تتصلب معظم المواد اللاصقة السيانوال الأكريليك بالضغط).
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي وضع مصدر ضوء فوق المقبس مباشرة إلى تسهيل وضع المقبس.
13. تأكد من أن العظم داخل منطقة المقبس خال من الغراء (عن طريق التحقق بالضوء لأن الغراء عاكس). في حالة انسكاب الغراء ، قم بإزالة المقبس ، واكشط الغراء بالمشرط ، وكرر الخطوة 2.12.
14. بعد أن يكون المقبس في مكانه وتكون منطقة التحفيز المستقبلية خالية من الغراء ، قم أولا بإغلاق الحدود الجانبية للتجويف بالأنسجة المجاورة بقطرة صغيرة من الغراء السيانو أكريليك لتجنب جسر سائل قد يؤدي إلى تحويل التيار في هذا الموقع. لا تضع الكثير من الغراء لأنه قد يتدفق إلى منطقة التحفيز (إذا حدث ذلك ، فارجع إلى الخطوة 2.12).
    ملاحظة: يعد الحفاظ على منطقة التحفيز خالية من الغراء أمرا بالغ الأهمية لأن تقليل منطقة التحفيز قد يزيد بشكل كبير من كثافة التيار (A / m²).
15. قم بتغطية جميع البراغي بغراء سيانواكريليك.
16. امزج الأسمنت الأكريليكي للأسنان المكون من عنصرين في أنبوب أو زجاج سيليكون صغير. بمجرد أن يصبح لزجا ، ضعه بملعقة أسنان لإغلاق الحدود المتبقية من التجويف إلى العظم. تجنب أي تدفق لأسمنت الأكريليك للأسنان إلى منطقة التحفيز.
17. أخيرا ، قم بتغطية الجمجمة بالكامل ، والبراغي ، وكابل القطب المضاد ، والمقبس حتى 1/3 من المقبس بأسمنت أكريليك الأسنان. تأكد من أن الأسمنت لديه اللزوجة الصحيحة: إذا كان سائلا جدا ، فسوف يتدفق إلى الأنسجة المحيطة ؛ إذا كان الأمر صعبا للغاية ، فمن الصعب توزيعه بالتساوي.
18. عندما يتم تغطية كل العظام وتقوية الأسمنت ، قم بإزالة مشابك البلدغ ؛ يجب أن يلمس الجلد الأسمنت المتراكم حتى لا تكون هناك حاجة للخياطة. (إذا تم اختيار القطع الأولي لفترة طويلة جدا وكان النسيج الضام أو العضلة مرئيا ، فضع خياطة كما هو موضح في الخطوة 1.12).
19. ضع طبقة واحدة من اليود بقطعة قطن حول حدود الجلد المقطوع وحقن الكاربروفين تحت الجلد (5 مجم / كجم من وزن الجسم المذاب في 5-7.5 مل من محلول ملحي 0.9٪ لعلاج الألم واستبدال السوائل).
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم التخدير الاستنشاقي ، فقم بإيقاف تشغيله الآن.
20. ضع القوارض في صندوق تسخين للتعافي من التخدير حتى يستيقظ القوارض ويستعيد استقرار الوضعية.
    ملاحظة: تحقق من نمو وزن وحالة الجرح ومعايير الرفاهية العامة يوميا وفقا لتوصية المؤسسة.

3. إجراء التحفيز الكهربائي عبر الجمجمة

ملاحظة: نظرا لأن التخدير يؤثر على تأثيرات tES ، يوصى بإجراء التحفيز في القوارض التنبيهية كلما أمكن ذلك. اسمح للقوارض بالتعافي لمدة 5 أيام على الأقل (التئام جرح الرأس والصدر) قبل بدء التجارب. يمكن إجراء التجارب في نقاط زمنية مبكرة بعد الجراحة عند استخدام قطب مضاد خارجي مثبت بسترة ، حيث أن جرح الصدر يكون أكثر سرعة الانفعال ، ولكن يجب أن تعتاد على سترة القطب الكهربائي لعدة أيام ، وقد يحدث تداخل مع المهام السلوكية.

1. املأ نصف مقبس القطب الكهربائي tES بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ وقم بإزالة فقاعات الهواء.
2. قبل جلسات تحفيز التيار المباشر عبر الجمجمة الكاثودية (tDCS) ، تحقق دائما من الكلور ، وإذا لزم الأمر (مثل سطح فضي لامع) ، أعد كلور قطب Ag / AgCl. قبل جلسات tDCS الأنودية ، قم بإزالة رواسب AgCl الزائدة المحتملة من المحفزات السابقة باستخدام ورق الصنفرة للسماح بالتوصيل الجيد أثناء التحفيز. قم بربط الغطاء اللولبي الكهربائي tES (الشكل 1 ب ، قطعة رمادية).
   تنبيه: سيؤدي الفشل في إعادة كلور القطب بين جلسات tDCS الكاثودية إلى استنفاد الكلور أثناء التحفيز وتراكم السموم عن طريق التفاعل الكهروكيميائي. سيؤدي ذلك إلى تلف الأنسجة. ليست هناك حاجة إلى إعادة الكلور خلال جلسة واحدة إذا كانت مدة التحفيز أقصر من 20 دقيقة.
3. قم بتوصيل الكابلات بالموصلين الموجودين على الرأس (للتحفيز الآلودي ، يتم توصيل الكبل الأنودي بالموصل الموجود على غطاء المسمار ، للتحفيز الكاثودي ، إنه عكس ذلك).
   ملاحظة: عند استخدام قطب مضاد يتم وضعه خارجيا ، قم بتغطية القطب المضاد بهلام موصل وضعه على صدر القوارض. يكون هذا أسهل إذا كان القطب مثبتا مسبقا في سترة صغيرة من القوارض ، والتي يمكن للقوارض ارتداؤها أثناء التحفيز.
4. ضع القوارض في القفص التجريبي ، مع توصيل الكابلات بقطب فوق القفص يسمح بحرية الحركة.
5. قم بتشغيل المحفز واضبط معلمات التحفيز (شدة التحفيز ، والمدة ، ووقت المنحدر لأعلى ولأسفل).
6. عند عدم استخدام جهاز تحفيز متاح تجاريا مع إنذار إيقاف التشغيل والفصل الآمن ، قم بتضمين مقياس في الدائرة للتحقق من تدفق التيار المستمر.
   ملاحظة: باستخدام هذا الإعداد ، يمكن تطبيق التحفيز أثناء أداء المهام السلوكية أو تدريبها.
7. تحقق من وجود علامات الإجهاد أو الانزعاج في القوارض أثناء التحفيز.
8. بعد انتهاء التحفيز ، افصل الكابلات ، وفك غطاء القطب الكهربائي على الرأس ، وقم بتنظيف وتجفيف المقبس بقطعة قطن. أعد القوارض إلى بيئة المنزل أو تابع إجراء سلوكيا إذا رغبت في ذلك.

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>

الشكل 1: مستلزمات الجراحة والمخطط الفني لمقبس tES ووحدة غطاء القطب. (أ) 1. مسحات قطنية ، 2. مطهر ، 3. الإطار التجسيمي ، 4. لحام الحديد ، 5. مسكن (مثل كاربروفين) ، 6. و 7. التخدير (على سبيل المثال ، الزيلازين والكيتامين) ، 8. حقنة ، 9. كليبر ، 10. مثقاب الأذن ، 11. مرهم العين (على سبيل المثال ، البيبانثين) ، 12. لحام القصدير الخالي من الرصاص ، 13. الأسمنت الأكريليكي للأسنان مكون من عنصرين (DAC) ، 14. اليود ، 15. 3٪ H2O2 ، 16. 0.9٪ محلول ملحي ، 17. خياطة مضفرة اصطناعية غير قابلة للامتصاص (على سبيل المثال ، Mersilene 4-0) ، 18. لقم الثقب ، 19. غراء سيانواكريليك ، 20. مشابك البلدغ 21. ملقط متجانس ، 22. ملقط طرف مثنية ، مسنن ، 23. ملقط مستقيم حاد ، 24. مستقيم ، ملقط الأنسجة ، 25. ملعقة أسنان ، 26. مشرط ، 27. مقص ، 28. الحفر اليدوي ، 29. مفك البراغي ، 30. الحفر الذي يحركه المحرك ، 31. موصلات أنثى ، 32. مقبس tES ، 33. قطب كهربائي بلاتيني مربع متصل بالكابل ، مفصل لحام مغطى بغراء هيستوأكريليك ، 34. مسامير بلاستيكية. (ب) مقبس tES (أحمر) للتثبيت على جمجمة القوارض بقطر داخلي يبلغ 4 مم ؛ تم بناء وحدة القطب الكهربائي (الرمادي) بواسطة غطاء لولبي وختم داخلي بفتحة مركزية تترك مساحة لكابل قطب القرص Ag / Cl ، والذي يتم لصقه في الجزء السفلي من الطابع. هذا يسمح بأقصى قدر من الاستقرار لإعداد وتجنب فواصل الأسلاك عند نقطة اتصال السلك الكهربائي الحساسة.