نظام الحقن الدقيق القائم على الموائع الدقيقة لضخ الأدوية والفيزيولوجيا الكهربية

الملخص

المصدر: Vanegas, M. I., et al. نظام الحقن المجهري لضخ الأدوية والفيزيولوجيا الكهربية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو جهازا مائعا دقيقا قائما على أقطاب كهربائية دقيقة يوفر محلول الدواء من خلال أنبوب شعري ، باستخدام محلول علامة قائم على الزيت لتتبع الحجم بدقة وتمكين التسجيل العصبي المتزامن وتسريب الدواء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. بناء Microinjectrode للتحفيز والتسجيل (الشكل 1 أ)

1. قياس طول القنية والمسبار (في هذا المثال ، مستشعر نانوي). يجب أن يكون المسبار أطول من القنية بطولها ليبرز من طرف القنية (حسب تصميم المسبار) ، بالإضافة إلى حوالي 2 سم.
2. تحت المكبر أو المجهر (~ تكبير 10x) ، قم بتحميل المسبار في القنية ؛ إذا أمكن ، يفضل التحميل الخلفي لحماية طرف المسبار.
   ملاحظة: هذه الخطوة ، التي يتم إجراؤها يدويا ، تمثل تحديا. يوصى بالتدرب على قطب كهربائي دقيق تحت عدسة مكبرة قبل محاولة إجراء مسبار تجريبي فعلي.
3. مرر القنية (التي تحتوي على المسبار) عبر الطويق العلوي ، وتقاطع T ، والحلقة السفلية.
   1. إذا كان المسبار عبارة عن سلك واحد فقط بدون أي مرفقات، فقم بتحميله مرة أخرى في الكانولا وأدخل المجموعة في تقاطع T من الطويق السفلي. يجب وضع الجزء العلوي من القنية (الجانب المسطح الطرف) في منتصف التقاطع T ، داخل الجزء السفلي ولكن ليس الطويق العلوي. يجب أن يبرز المسبار التجريبي أو المستشعر الحيوي فوق الجزء العلوي من الطويق.
      ملاحظة: يمكن أيضا صنع الحلقات المصنوعة حسب الطلب عن طريق حفر ثقب في سدادات الطويق باستخدام لقم الثقب الصغيرة ، ويعتمد حجم الثقب على القطر اللازم لتشديد القنية على تقاطع T.
4. استخدم مفتاح الطويق لتشديد الحلقات في الجزء العلوي والسفلي من تقاطع T. لا تفرط في الشد. يمكن إضافة قطعة صغيرة من الأنابيب لتقوية دعم القطب الكهربائي داخل الطويق العلوي.
لحام
5. دبابيس الذهب لكل من أطراف المسبار (إشارة ، أرض ، إلخ) ، وفقا لمواصفات المسبار.
6. اضبط الموضع النسبي للمسبار والقنية. قم بقياس المسافة التي يبرز بها المسبار من القنية تحت التكبير ، واضبطها يدويا من الطرف العلوي (يمكن أن ينزلق المسبار بحرية داخل الحلقات
7. أضف غراء الايبوكسي بين المسامير الذهبية والحلقة العلوية لربط المسبار بالطويق.
8. قم بفك الطويق العلوي لسحب المسبار داخل القنية. تأكد بصريا من أن المسبار يقع بالكامل داخل القنية تحت التكبير.
9. قم بتوصيل الحقن بمحرك الأقراص الصغيرة.

2. بناء الحقن الدقيق لتسريب الدواء (الشكل 1 ب)

1. قم بإرفاق الطرف "غير المشطوف" أو المسطح للقنية بأسفل الوصلة T باستخدام الطويق. استخدم مفتاح الطويق لتشديد الطويق.
2. قم بتوصيل قطعة صغيرة من الأنابيب الشعرية (~ 1.5 سم) بالجزء العلوي من الوصلة T عن طريق تمريرها عبر الطويق القياسي. شد مع مفتاح الطويق.
3. قم بتحميل القطب الصغير من خلال الأنابيب الشعرية ، وتقاطع T ، والقنية ، والحلقات المقابلة.
4. تأكد من أن الطرف الخلفي للقطب يبرز على بعد أقل من 1 سم من الجزء الخلفي من الأنبوب الشعري ، وأن طرف القطب يبرز من القنية على المسافة المطلوبة على الجانب السفلي. يمكن ضبط موضع القطب يدويا من الطرف العلوي.
5. لحام دبوس ذهبي في طرف القطب الكهربائي الدقيق.
6. أضف غراء الايبوكسي بين الدبوس الذهبي والحلقة العلوية لربط القطب الصغير بالطويق.
7. قم بفك الطويق العلوي لسحب المسبار داخل القنية. تأكد بصريا من أن القطب الصغير قد تم سحبه بالكامل في القنية.

3. بناء دائرة الموائع الدقيقة (الشكل 2)

1. ضع لوح تجارب على سطح مستقر. ضع الصمامين ثلاثي الاتجاهات بالتوازي مع أطول جوانب اللوح ، حوالي 6 بوصات. بصرف النظر عن ذلك ، مع وجود منفذ واحد (المنفذ المفتوح دائما) يواجه بعضهما البعض. استخدم البراغي لتثبيت الصمامات على اللوح.
2. ضع مسطرة بجوار الصمامات (لقياس وتتبع حركة السوائل داخل الأنبوب الشعري).
3. قم بتحميل خليط من الزيت منخفض اللزوجة 1: 1 وملون الطعام (علامة) في المحقنة محكمة الإغلاق وضعها في مضخة العلامة. قم بقص قطعة واحدة من الأنابيب الشعرية ، واستخدم الحلقات القياسية وموصلات قفل لور لتوصيل المحقنة بأحد المنافذ الموجودة على صمام الإدخال. هذا هو "خط العلامة".
4. قطع قطعة قصيرة من الأنابيب الشعرية ل "خط المسطرة". استخدم الحلقات القياسية لتشديد المنافذ المواجهة للصمامات.
5. قم بقص قطعتين أطول من الأنابيب الشعرية لتوصيل صمام الإخراج بالمحقن الدقيق ، ولتوصيل مضخة الدواء بصمام الإدخال (استخدم الحلقات القياسية).
   ملاحظة: يعتمد طول هذين الخطين على الإعداد التجريبي ، يجب أن يكون أحدهما طويلا بما يكفي للوصول من جهاز التسريب إلى ، والآخر من مضخة الدواء إلى صمام الإدخال. استخدم حجر الشق لقطع الأنابيب الشعرية.

4. تركيب Microinjectrode على Microdrive (الشكل 3)

1. تأكد من سحب القطب الصغير / المسبار التجريبي في القنية قبل التركيب.
   ملاحظة: يجب أن يكون أنبوب التوجيه في وضع محرك الأقراص الصغيرة.
2. قم بتوصيل محول مخصص بالحقن الدقيق.
3. قم بتحميل الحقن الدقيق من خلال أنبوب التوجيه وتثبيته في المحول باستخدام البراغي.
4. قم بقياس موضع محرك الأقراص الصغيرة (العمق) الذي يبرز عنده الحقن الدقيق من أنبوب التوجيه ، ثم اسحبه ~ 1 سم للتحضير للإدخال.
5. بالنسبة لتجارب التسريب الدقيق ، قم بتوصيل "خط الدماغ" بفتحة الوصلة T غير المستخدمة للقطب الصغير. استخدم طوقا قياسيا وقم بإحكام ربطه باستخدام مفتاح ربط.

5. تنظيف وإعداد نظام الموائع

1. الدقيقة: ضع محرك الأقراص الصغيرة مع microinjectrode فوق دورق النفايات.
2. قم بتحميل الكلورهيكسيدين (على سبيل المثال ، نولفاسان ، المذاب عند 20 جم / لتر) في المحقنة محكمة الغلق بالغاز سعة 1 مل وضعها في مضخة الأدوية. قم بتدوير اتجاه تدفق الصمامات بحيث ينتقل السائل من مضخة الدواء عبر الصمام إلى خط الصمام ويخرج من "خط الدماغ".
3. اغسل الدائرة بالكلورهيكسيدين باستخدام معدل تدفق منخفض (50-200 ميكرولتر / دقيقة) لمدة لا تقل عن 10 دقائق. كرر الخطوات من 5.2 إلى 5.3 باستخدام محلول ملحي معقم ثم الهواء.
   ملاحظة: من المهم التحقق من وجود تسرب في هذه المرحلة. ضع مناديل خالية من النسالة برفق عند التقاطعات للمساعدة في الكشف عن أي تسرب للسوائل من خلال الحلقات
4. قم بتحميل الدواء في حقنة محكمة الغلق سعة 500 ميكرولتر ، واضغط على الهواء ثم ضعه في مضخة الدواء. يتدفق بسرعة 50 ميكرولتر / دقيقة حتى تتدفق بضع قطرات من الحقن الدقيق.
5. انقع أنبوب التوجيه في الكلورهيكسيدين (المذاب عند 20 جم / لتر) لمدة 15 دقيقة.
6. أدر اتجاه صمام الإخراج باتجاه "خط التنظيف". تقدم مضخة العلامة حتى يتم ملاحظة حافة واضحة من اللون والزيت على خط المسطرة. تأكد من وجود زيت دائما بين الدواء واللون حتى لا تخلط المادتين القابلتين للذوبان في الماء وتفقد الحافة الحادة بينهما. ضع علامة على موضع البداية لخط الزيت / الصبغة هذا (بقطعة من الشريط أو علامة).
7. أدر اتجاه صمام الإخراج باتجاه خط الدماغ.

6. إجراء التسجيل أو تجربة التسريب

ملاحظة: تختلف خطوات التعامل مع حسب المختبر والتجربة. يجب تنفيذ الخطوات التالية بعد الإعداد الجراحي اللازم والتحضير لفضح الجافية. بعد التجربة ، يجب تنفيذ جميع خطوات ما بعد الإجراء الضرورية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من المؤسسة.

1. قم بتوصيل محرك الأقراص الصغيرة بغرفة التسجيل. اخفض أنبوب التوجيه لاختراق الجافية.
   ملاحظة: يجب ألا يخترق أنبوب التوجيه أبعد من الجافية لتجنب إتلاف القشرة.
2. اخفض الحقن الدقيق إلى حوالي 2 مم فوق الموقع للتسجيل / الحقن في الدماغ.
3. شد الطويق العلوي (القطب الكهربائي الدقيق البارز / المستشعر الحيوي) وقم بتوصيل المسامير الذهبية بنظام التسجيل. استمر في تقدم الحقن الدقيق إلى الموقع المستهدف.
   NOTE: تذكر تضمين المسافة التي يمتدها القطب الصغير إلى ما وراء القنية في الحسابات.
4. لتجارب التسريب ، استخدم مضخة المحقنة الدقيقة اليدوية لتحريك عمود الزيت بمقدار 1 سم كل 3 دقائق (~ 60 نانولتر / دقيقة). بمجرد غرس الحجم المطلوب ، قم بتبديل صمام الإخراج نحو خط التنظيف.
   ملاحظة: سيختلف الحجم المنقوع بناء على نوع النموذج ومنطقة الدماغ المستهدفة. قد تؤدي معدلات التدفق الأسرع إلى تلف الأنسجة العصبية.
5. عند اكتمال التجارب ، اسحب الحقن الدقيق داخل أنبوب التوجيه (اترك المسبار بارزا). ثم قم بإزالة محرك الأقراص الصغيرة للتنظيف. اغسل نظام الموائع الدقيقة للتحضير لإعادة الاستخدام. ملاحظه: من خلال تجربتنا ، سيستمر الحقن الدقيق لعدة استخدامات إذا تم توخي العناية المناسبة. تنخفض جودة التسجيل الفيزيولوجي الكهربي بشكل أسرع من قدرة الحقن.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display: table؛ margin-left: auto؛ margin-right: auto؛ width: 75٪؛ '>

الشكل 1: تصنيع microinjectrode خطوة بخطوة. (أ) التكوين للاستخدام بشكل مستقل عن نظام الموائع الدقيقة. يتم قياس القنية والمسبار من أجل التأكد من أن طرف المسبار يمكن أن يبرز بالطول المطلوب (على سبيل المثال ، 150 ميكرومت...

المواد