Method Article

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف طريقة لإعداد نشطة translationally ، synaptoneurosomes سليمة (SNS) من قشرة دماغ الفأر. الأسلوب يستخدم متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز السماح للتحضير السريع لSNS النشطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتم الحصول على Synaptoneurosomes (SNS) بعد التجانس والتجزئة من قشرة الدماغ الماوس. وأعادت أنهم حويصلات أو المحطات المعزولة التي كسر بعيدا عن محطات محوار عند النسيج المتجانس القشرية. وتحتفظ SNS الخصائص قبل وبعد المشبكي ، مما يجعلها مفيدة في دراسة انتقال متشابك. أنها تحتفظ الآلية الجزيئية المستخدمة في الإشارة العصبية وتكون قادرة على امتصاص وتخزين ، وإطلاق النواقل العصبية.

ويمكن إنتاج وعزلة SNS النشطة يكون إشكاليا باستخدام الوسائط مثل Ficoll ، والتي يمكن السامة للخلايا ويتطلب الطرد المركزي طويلة بسبب كثافة عالية ، وطرق الترشيح والطرد المركزي ، والذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بسبب الاضرار الميكانيكية للSNS. ومع ذلك ، فإن استخدام متقطع التدرجات كثافة Percoll - السكروز لعزل SNS يوفر طريقة سريعة لإنتاج غلة جيدة من SNS translationally النشطة. أسلوب التدرج Percoll - السكروز سريع ولطيف لأنها توظف الظروف متساوي التوتر ، ويدور الطرد المركزي أقل وأقصر ويتجنب الخطوات الطرد المركزي التي SNS بيليه وإلحاق أضرار الميكانيكية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعدادات 1-4

  1. تحضير 500 مل متوسطة الانحدار (GM) العازلة عن طريق خلط 50 مل من الطين السكروز 2.5 م ، 2.5 مل من حمض الهيدروكلوريك ، تريس 1M ، منظر pH7.5 ، و 0.1 مل من EDTA 0.5 متر ، ودرجة الحموضة 8.0 ملي الأسهم مع س للحجم المياه. فلتر تعقيم الحل ، قسامة وتخزين المجمدة.
  2. يعد من الأسهم 1000x سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) بجعل حل 1 ملم في ملي - Q O. 2 H ويمكن تخزين Aliquots من TTX في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 10X الاحتيا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والمتقطعة إعداد التدرج Percoll - السكروز الموصوفة هنا هو وسيلة سريعة وسيلة يمكن التعويل عليها لعزل SNS النشطة ، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التجارب انتقال متشابك. هذا الأسلوب التدرج ، الذي يستند على طريقة وضعها Dunkley وآخرون ، هو 3،4 تجزيء الدماغ التحت خلوية الإجراء الذي يعزل كلا قبل وبعد المشبكي غشاء الحويصلات المشتقة التي ترتبط مع بعضها البعض. دون مزيد من تنقية هذه SNS متوافقة مع مجموعة متنوعة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك مناعي ، غرب النشاف.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر BK أغسطس من جامعة ويسكونسن ماديسون مرفق المجهر الالكتروني للالمجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - DA026067 وP30 - HD03352 (للشبيبة).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
الفحص الدقيقة البروتين BCA كيت ثقب 23235
CaCl 2 الصياد C79 - 500
غاز ثاني أكسيد الكربون 2 Airgas (يسكونس MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH الصياد A407SK - 4
حمض الهيدروكلوريك الصياد A142 - 212
Percoll جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0891-01
KH 2 PO 4 الصياد P285 - 500
PierceSDS - PAGE كيت نموذج الإعدادية ثقب 89888
كلوريد الصوديوم RPI S23020
NaHCO 3 الصياد BP328 - 500
غ 2 بو 4 الصياد S381 - 500
السكروز RPI S24060
قاعدة تريس RPI T60040
سم الأسماك الرباعية الأسنان سيغما T5651
ميكس برو أعرب عن تسمية S35 العلامات سهلة بيركن إلمر NEG772
معدات شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
أدوات تشريح
Dounce الخالط ، 7 مل (يأتي مع اثنين من الزجاج المطاحن المسمى "A" و "ب") ويتون
P1000 جيلسون Pipetman جيلسون F123602
أليجرا 6KR جهاز طرد مركزي بيكمان كولتر 366830
GH 3.8 الدوار ، الدوار الضرب دلو بيكمان كولتر 360581
بيكمان J2 - 21 جهاز طرد مركزي بيكمان
بيكمان أنابيب مع قبعات بيكمان 355672
الجدران بيضاء محولات بيكمان 342327
محولات الجدران الزرقاء بيكمان
JA - 17 الدوار ، الدوار الزاوية الثابتة بيكمان 369691

جدول الأجسام المضادة المستخدمة في البقع الغربية :

اسم جسم شركة فهرس العدد الأنواع المضيفة تخفيف عامل
β - أكتين سيغما A5441 فأر 1:2000
GFAP سانتا كروز SC - 65343 فأر 1:200
GP73 سانتا كروز SC - 134509 أرنب 1:200
HSC70 سانتا كروز SC - 7298 فأر 1:200
Laminβ سانتا كروز SC - 6261 ماعز 1:200
Prohibitin سانتا كروز SC - 28259 أرنب 1:200
PSD95 ميليبور MAB1596 فأر 5 ميكروغرام / ميكرولتر
SNAP25 AbCam ab5666 - 100 أرنب 1:2000
Synaptophysin ميليبور MAB368 فأر 1:500
β - 3 - تويولين سانتا كروز SC - 80016 فأر 1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

Related Articles