Method Article

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف طريقة لإعداد نشطة translationally ، synaptoneurosomes سليمة (SNS) من قشرة دماغ الفأر. الأسلوب يستخدم متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز السماح للتحضير السريع لSNS النشطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتم الحصول على Synaptoneurosomes (SNS) بعد التجانس والتجزئة من قشرة الدماغ الماوس. وأعادت أنهم حويصلات أو المحطات المعزولة التي كسر بعيدا عن محطات محوار عند النسيج المتجانس القشرية. وتحتفظ SNS الخصائص قبل وبعد المشبكي ، مما يجعلها مفيدة في دراسة انتقال متشابك. أنها تحتفظ الآلية الجزيئية المستخدمة في الإشارة العصبية وتكون قادرة على امتصاص وتخزين ، وإطلاق النواقل العصبية.

ويمكن إنتاج وعزلة SNS النشطة يكون إشكاليا باستخدام الوسائط مثل Ficoll ، والتي يمكن السامة للخلايا ويتطلب الطرد المركزي طويلة بسبب كثافة عالية ، وطرق الترشيح والطرد المركزي ، والذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بسبب الاضرار الميكانيكية للSNS. ومع ذلك ، فإن استخدام متقطع التدرجات كثافة Percoll - السكروز لعزل SNS يوفر طريقة سريعة لإنتاج غلة جيدة من SNS translationally النشطة. أسلوب التدرج Percoll - السكروز سريع ولطيف لأنها توظف الظروف متساوي التوتر ، ويدور الطرد المركزي أقل وأقصر ويتجنب الخطوات الطرد المركزي التي SNS بيليه وإلحاق أضرار الميكانيكية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعدادات 1-4

  1. تحضير 500 مل متوسطة الانحدار (GM) العازلة عن طريق خلط 50 مل من الطين السكروز 2.5 م ، 2.5 مل من حمض الهيدروكلوريك ، تريس 1M ، منظر pH7.5 ، و 0.1 مل من EDTA 0.5 متر ، ودرجة الحموضة 8.0 ملي الأسهم مع س للحجم المياه. فلتر تعقيم الحل ، قسامة وتخزين المجمدة.
  2. يعد من الأسهم 1000x سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) بجعل حل 1 ملم في ملي - Q O. 2 H ويمكن تخزين Aliquots من TTX في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 10X الاحتياطي تحفيز بجعل حل تريس 100 ملم (7.5 درجة الحموضة) ، 5 مم نا 2 هبو 4 ، 4 ملم KH 2 ص 4 ، 40 ملم NaHCO 3 ، و 800 ملي مول كلوريد الصوديوم في المياه ملي - Q. ويمكن تخزين المخزون في 4 درجات مئوية.
  4. قبل أجهزة الطرد المركزي لتبريد 4 درجات مئوية.
  5. يعد حل سهم Percoll Isosmotic (SIP) وذلك بإضافة 9 مجلدات من Percoll (18 مل) إلى 1 السكروز حجم M 2.5 (2 مل) في ملي - Q الماء ومزيج جيد.
  6. إعداد 3 ، 10 ، 15 ، وطبقات متدرجة 23 ٪ عن طريق إضافة كميات منها إلى SIP العازلة جنرال موتورز وخلط كل منها :

جدول سلسلة التدرج بيانات حل المخزن المؤقت ؛ التركيز مقابل نسبة التدرج ؛ بحث.

  1. صب طبقات متدرجة من قبل pipetting 2 مل من كل 23 ، 10 ، 15 ، و 3 ٪ حلول Percoll isosmotic في أنابيب الطرد المركزي بيكمان مع القبعات باستخدام P1000 جيلسون Pipetman. وينبغي أن التفاعل بين الطبقات يكون ملحوظ بوضوح مع عدم وجود اختلاط الطبقات. تخزين التدرجات في 4 درجات مئوية على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام. ويمكن تخزين التدرجات لمدة تصل إلى 24 ساعة على الرغم من المستحسن استخدام نفس اليوم. [يجوز لموظفي المختبر عديم الخبرة الممارسة التدرجات إعداد بإضافة صبغة زرقاء للحلول Percoll isomotic لتصور من واجهات الطبقة.]

2. تشريح الفأر 1

  1. ضمان أن يتم تنفيذ كافة تربية الماوس والقتل الرحيم الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وجامعة. الموت ببطء الجراء (العمر لP13 P21) خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون أو أسلوب المعتمد في بروتوكول الحيوان.
  2. دبوس الماوس إلى لوحة التشريح ورذاذ الجزء الخلفي من الرقبة والرأس مع الايثانول. باستخدام مقص حاد يقطع الحبل الشوكي عند قاعدة الجمجمة ، وإزالة الجلد من الجزء العلوي من الجمجمة ، وقطع الجمجمة أفقيا بين العظم الجداري والعظم بين الجداري أو بين المخ ومناطق القشرة. ثم قطع الجمجمة من القاعدة إلى الأنف (على طول الدرز sagital) ، إزالة بعناية العظم الجداري الناعمة عن طريق سحب كل نصف الكرة الأرضية إلى جانب وإزالة القشرة مع ملعقة. تضاف ملعقة في المخ والمخيخ فوق مغرفة ثم إلى القشرة ووضعه في المخزن جنرال موتورز الجليد الباردة. الشروع فورا في خطوة التجانس. لا تدع قشرات الجلوس في الجليد الباردة العازلة لمدة طويلة جدا حيث ان هذا سوف يؤثر سلبا على تشكيل SNS.

3. إعداد وجناسة SNS 1-4

  1. شطف قشرات في الجليد الباردة العازلة جنرال موتورز ونقل اثنين قشرات إلى الزجاج الخالط Dounce تحتوي على 5 مل من جنرال موتورز العازلة الباردة.
  2. المتجانس بلطف مع القشور من السكتات الدماغية 50-10 مدقة فضفاضة (مدقة "أ") ، تليها الجلطات 50-10 من مدقة ضيقة (مدقة "ب"). وينبغي أن يكون سريعا ولكن ضربات بطيئة بما يكفي كي لا تسبب فقاعات الهواء. صورة من بعد جناسة التجانس في مخطط 1. سيقوم عدد من السكتات الدماغية تختلف يعتمد على الفردية والمطاحن الخالط المرافق له. عندما أنهى التدرجات ينبغي إعطاء الفرقة SN قوية ، إن لم يكن ، وضبط عدد من السكتات الدماغية.
  3. نقل جناسة إلى 15 مليلتر المخروطية والطرد المركزي في 1000xg لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح (أليجرا 6KR الطرد المركزي) على الحطام الخلوية بيليه والنوى. صورة من نسج جناسة في مخطط 1.
  4. طبقة 2 مل من طاف في Percoll - السكروز كأب ، والتدرج في الأنابيب ، وأجهزة الطرد المركزي في 32500 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية في الدوار الزاوية الثابتة (بيكمان J2 - 21 الطرد المركزي ، JA - 17 الدوار) باستخدام محولات المناسب ( انظر الجدول الكواشف والمعدات).
  5. ماصة الخروج وتجاهل حل فوق الفرقة SN باستخدام ماصة باستير الزجاج. ماصة قبالة الشريط في واجهة SN 15/23 ٪ ، ونقل إلى المخروطية وتخزينها على الجليد. وسوف تدرج كل قشرة أو إنتاج one 0،9-1،1 مل من SN.
  6. ضبط تركيز الملح من SNS بإضافة واحد على عشرة من حجم 10X التحفيز العازلة ، إضافة CaCl 1000x 2 إلى التركيز النهائي من 12 نانومتر ، وإضافة الأسهم TTX 1 ملم الى تركيز النهائي من 1 ميكرومتر لقمع الإثارة غير محدد. (إضافة اختيارية CaCl 2 اذا كان ذلك يتعارض مع تطبيقات SN المصب).
  7. تحديد تركيز البروتين من SNS باستخدام بروتين BCA مايكرو أدوات الفحص. (لا ينصح فحص البروتين برادفورد بسبب الاستدلال من Percoll).
  8. ويمكن استخدام SNS مباشرة وبسرعة لtransla البروتيندراسات نشوئها. لتطبيقات أخرى قد تكون تنظيف SN lysate تتركز أعلى أو باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية.

4. ممثل النتائج :

عندما كان المتجانس الماوس القشرة والمنفصلين عن التدرجات Percoll - السكروز المتقطعة (مخطط 1) ، والعصابات 6 أو الكسور شوهدت (الشكل 1). وقد تبين في وقت سابق انها لقشرة المخ 3،5 الفئران التي تم تقسيم الفرق المكونة من الوزن الجزيئي عالية غشاء الميلين ووأن المواد الواردة مكعبات أو عضيات الميتوكوندريا (الجدول 1). يرد 23 ٪ / واجهة 15 ٪ (باند 5) وSNS المخصب.

تمت إزالة الفرقة في واجهة / 23 ٪ 15 ٪ ، وتحتوي على SNS سليمة ، وفحصها بواسطة المجهر الإلكتروني (EM) كما هو موضح سابقا. 2،6 م وأظهرت وجود حويصلات متشابك سليمة والحفاظ على العناصر قبل المشبكي وبعد المشبكي (الشكل 2). العزلة من المقصورات قبل وبعد المشبكي المهم لفحص الإشارات وتخليق البروتين ، والذي يحدث في كل من المقصورات. 7-13 التدرج Percoll - السكروز هو تنقية الخام حتى رأينا التعديلات الخلوية ، والتلوث النووي وعضية في الكسر ولكن SN وكان الانفصال الكلي جيدة.

يرد الكسور Percoll عندما درست لطخة غربية ، وعلامات البروتين المتوقع مع زيادة في نقاء متشابك في الفرقة SN (الشكل 3 ، الجدول 2). وبقيت علامات العصبية ومتشابك في الفرقة SN المخصب (باند 5) ولكن تم تخفيض كبير في وفرة من علامات أخرى. على وجه الخصوص ، كان وجود GFAP ، وهي علامة للحصول على خلايا نجمية والأورام الدبقية المنشأ ، وامين - B1 ، علامة النووي ، ضئيلة ، في حين حافظت علامات الهيكلي ومتشابك أو محسنة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك علامات للاحتفاظ عضيات مثل الميتوكوندريا وغولجي ، التي تلعب دورا في تخليق البروتين.

وكانت غلة نموذجي للفرقة SN 250-500 نانوغرام من البروتين لكل ميكرولتر ، على النحو الذي يحدده فحص البروتين BCA. تم تحديد نشاط SNS بمقدار توليف البروتين دي نوفو الحاضر كما رصدتها [35S] - الأرصاد التأسيس (الشكل 4) ، وكان النشاط 2 بصل متعدية زيادة 1.56 أضعاف عندما حفزت SNS مع 50 ميكرومتر ميكرومتر glutamate/10 جليكاين (حمض الغلوتاميك) أو 5.12 أضعاف عند تفعيله مع جغلون Pin1 المانع. واضاف نحن ويعرف Pin1 تثبيط أن يؤدي إلى زيادة تخليق البروتين. 2 لتأكيد أن الزيادة في [35S] - الأرصاد التأسيس كان من المقرر ان تركيب البروتين دي نوفو ، 40 ميكرومتر anisomycin ، مثبط تخليق البروتين ، وشهدت انخفاضا ملحوظا في التأسيس في حضور وغياب حمض الغلوتاميك بالمقارنة مع المستويات القاعدية. أيضا ، عند إضافة 2 ٪ تريتون - X 100 ، مما يعطل سلامة SNS ، فقد انخفض الترجمة القاعدية بنسبة 75 ٪. (2) وبالإضافة إلى ذلك ، عند النظر في نطاقات (B4 - B6) التي أظهرت أن معظم تخصيب علامة متشابك ، كان SNS أو باند (5) وأكبر نشاط لتخليق البروتين دي نوفو (الشكل 5). وبالتالي ، فإن متقطع Percoll - السكروز التدرجات تنتج بسرعة نشطة للغاية والفرقة SN المخصب الذي يمكن استخدامه لدراسة الترجمة البروتين.

والتدرج الداخلي المتقطع Percoll - السكروز هو أكثر فائدة من وسائل أخرى لأنه ألحق أضرارا الميكانيكية أقسى الظروف. بالمقارنة مع طريقة الترشيح ، والتي برأت جناسة القشرية يتم تمريرها من خلال سلسلة من الفلاتر التي تقلل من حيث الحجم والأسلوب 3،14-15 Percoll أشكال أكثر جوهريه بمزيد من النشاط. كما يرى في الشكل (6) ، عندما تم تمرير قسامة من SNS أعدتها طريقة الترشيح على مدى الانحدار Percoll - السكروز هناك SNS أقل بكثير في واجهة 15/23 ٪ ، وزيادة كمية الأغشية المكسورة. كانت SNS أعدتها طريقة الترشيح عندما تم قياس دي نوفو عن طريق تخليق البروتين S35 التقى التأسيس ، بقدر أقل نشاطا (الشكل 7). لزيادة النشاط متعدية نستخدم الفئران التي هي بين سن P14 وP18. يمكن إعداد SN من فئران بالغة ، ولكن لاحظنا زيادة كبيرة في النشاط متعدية مع SN المحضرة من الفئران الأحداث (الشكل 8).

مخطط جدول المكونات الخلوية يوضح بالتفصيل توزيع الغشاء والمايلين و SNs والعضيات.
الجدول 1. المكونة من عصابات من fractionations Percoll - التدرج متقطع من القشرة الماوس المتجانس. 3،5

جدول تعبير علامة البروتين. تحليل مقارن للنطاقات مع علامات للهياكل الخلوية.
الجدول 2. ملخص تحليل الترباس الغربية متقطع Percoll - السكروز الفرقة المكونة التدرج. معزولة تركيزات البروتين النسبية لكل من الفرقة الكسور باستخدام Percol متقطعوتم تحديد L - السكروز التدرج لطخة غربية. لم الحاضر البروتين (--) ، 0 ≥ ​​0.2 (+) ، 0.2 ≥ 0.8 (++)،أو> = 0.8 (+++)أضعاف أكبر من البروتين في الحاضر ممثل طاف (S ، طرد جناسة القشرة) ، ن 3.

تشريح القشرة ، التجانس في المخزن المؤقت ، الطرد المركزي المتدرج ، عملية عزل نطاق SN.
مخطط 1 : رسم تخطيطي لإعداد SN متقطع باستخدام التدرج الكثافة Percoll - السكروز تم تشريح الدماغ قشرات الفأر ، المتجانس ، وطرد على سرعة منخفضة لإزالة غير المتجانس الأنسجة والخلايا والعضيات كلها مثل النواة والأغشية. يجب أن تحدد بوضوح طبقات متدرجة متقطعة. يظهر في الصورة أقحم مثالا للطبقات ، والتي تم مصبوغة باللون الأزرق لأغراض توضيحية فقط من أجل رؤية طبقات. والطبقات وطاف على رأس التدرج Percoll - السكروز متقطع وطرد على سرعة متوسطة. ثم يتم استرداد الفرقة SN من الانحدار وجاهزة للاستخدام.

الطرد المركزي المتدرج لكثافة التوازن ، رسم تخطيطي مع نطاقات التدرج لتحليل فصل البروتين
الشكل 1. جناسة تجزيء على التدرج Percoll - السكروز متقطعا. وكان المتجانس الماوس القشرة والمنفصلين على التدرج Percoll - السكروز متقطع مما أدى إلى 6 نطاقات أو الكسور. تم العثور على ، تنقية نشط SNS (*) في باند 5.

صورة المجهر الإلكتروني للإرسال ، العضيات الخلوية ذات الأسهم الحمراء ، تحليل بنية الخلية.
الشكل 2. الاستعدادات SN تعطي خليط غير متجانس من العناصر التي تحتفظ SNS قبل المشبكي وبعد المشبكي. أجري صورة مجهرية الإلكترون من إعداد SN المحضرة من C57BL / 6 الفئران (سن P13 P21 ل) كما هو موضح سابقا SNS ويظهر مع الحفاظ على العناصر قبل المشبكي وبعد المشبكي 2 ، 6 نقطة الأسهم الحمراء إلى آخر متشابك الكثافة. شريط النطاق هو 1 ميكرون.

تظهر نتائج اللطخة الغربية التعبير عن البروتين ل β-Actin و GFAP و SNAP25 ؛ النطاقات 1-6 ، S.
الشكل 3. وأظهرت تحليلات لطخة الغربي من الاستعدادات التي تم الحفاظ SN علامات العصبية ومتشابك في SNS المنقى (باند 5) ولكن تم تخفيض كبير في وفرة من علامات أخرى. Immunoblots من طاف (S ، طرد جناسة القشرية) وشرائح 1-6 لالمتقطعة وقد بحث Percoll - السكروز التدرج لأكتين - β (الهيكلي ، ومراقبة التحميل) ، GFAP (نجمي) ، GP73 (غولجي) ، HSC70 (الهيولى والنووية) ، لامين - B1 (النووية) ، Prohibitin (الميتوكوندريا) ، PSD95 (الكثافة بعد المشبكي ) ، SNAP25 (متشابك) ، Synaptophysin (متشابك) وβ3 - تويولين (الخلايا العصبية الخاصة). كانت العصابات تصور باستخدام العاصفة 860 Phosphorimager ، ممثل ن = 3.

الرحلان الكهربائي للبروتين ومخطط دمج S35-Met ؛ تحليل جلو ، تأثيرات أنيسو.
الشكل 4. SNS تنشط ويحمل دي نوفو عن طريق تخليق البروتين [35S] - الأرصاد التأسيس. SNS كانت قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم كانت SNS غير المعالجة أو سابقة التجهيز لمدة 15 دقيقة مع 40 ميكرومتر anisomycin أو 1 جغلون ميكرومتر في 37 درجة مئوية تليها إضافة [35S] - الأرصاد ، 20 ميكرولتر تسمية برو اكسبريس ميكس S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

الرحلان الكهربائي للهلام والرسم البياني الشريطي مقارنة مستويات دمج البروتين. يعرض بيانات S35-Memet.
الشكل 5. ترد الفرقة 5 من التدرج Percoll - السكروز متقطعة على أعلى مستويات البروتين التوليف دي نوفو. وكانت العصابات 4 و 5 و 6 ، وطاف (S ، طرد جناسة القشرية) قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم ، [35S] كان المضافة الأرصاد ، وعبر عن تسمية ميكس برو S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

تنقية البروتين ، أنابيب تكوين الرواسب ، مقارنة النتائج التجريبية.
الشكل 6. SNS أعدت من أسلوب الترشيح تحتوي الأغشية أكثر مكسورة وكلها أقل من SNS SNS أعدت من أسلوب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وأعدت SNS بتمرير قشرة المتجانس من خلال سلسلة من الفلاتر مع تناقص حجم المسام كما هو موضح سابقا. 3،14-15 كان طرد أحد قسامة من SNS أعدتها طريقة الترشيح على مدى الانحدار Percoll - السكروز متقطع وبالمقارنة مع مبلغ معادل المواد باستخدام أسلوب الانحدار متقطع Percoll - السكروز.

جل SDS-PAGE ومخطط شريطي لتأسيس S35-Met ؛ تحليل البروتين ، النتائج التجريبية.
الشكل 7. SNS أعدت من أسلوب الترشيح تحتوي على أقل من البروتين نوفو دي النشاط التجميعي من SNS أعد جيئة وذهابام وأسلوب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وأعدت SNS بتمرير قشرة المتجانس من خلال سلسلة من الفلاتر مع تناقص حجم المسام كما هو موضح سابقا ، 3،14-15 وأساليب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وكانت الاستعدادات على حد سواء من SNS قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم ، [35S] كان المضافة الأرصاد ، وعبر عن تسمية ميكس برو S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

جل SDS-PAGE والرسم البياني الشريطي يوضح دمج S35-Met في عينات البروتين تحت ظروف التحكم والجلوكوز.
الشكل 8. SNS من الفئران الأصغر (P14) ونشاط أكبر من كبار السن متعدية الفئران (P85). أعدت SNS من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين مختلف باستخدام أسلوب الانحدار Percoll متقطع ، السكروز ، preequilibrated عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، مع معالجة أو غير معالجة في حمض الغلوتاميك بحضور [35S] - الأرصاد (ميكس برو اكسبريس تسمية S35 العلامات سهلة) لمدة 30 دقيقة ، والمفاجئة المجمدة ، وتنظيفها في وقت لاحق مع SDS - PAGE بيرس نموذج طقم الإعدادية. تم تشغيل ثم SNS على جل SDS - بولي أكريلاميد 12 ٪ ، والمجففة وتصويرها على العاصفة حيوية الجزيئية 860 ممثل ، phosphorimager ن = 3 ، ± SEM. وكان من SNS P14 الفئران على الأقل 3 مرات أكثر نشاطا من P85 الفئران.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والمتقطعة إعداد التدرج Percoll - السكروز الموصوفة هنا هو وسيلة سريعة وسيلة يمكن التعويل عليها لعزل SNS النشطة ، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التجارب انتقال متشابك. هذا الأسلوب التدرج ، الذي يستند على طريقة وضعها Dunkley وآخرون ، هو 3،4 تجزيء الدماغ التحت خلوية الإجراء الذي يعزل كلا قبل وبعد المشبكي غشاء الحويصلات المشتقة التي ترتبط مع بعضها البعض. دون مزيد من تنقية هذه SNS متوافقة مع مجموعة متنوعة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك مناعي ، غرب النشاف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر BK أغسطس من جامعة ويسكونسن ماديسون مرفق المجهر الالكتروني للالمجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - DA026067 وP30 - HD03352 (للشبيبة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
الفحص الدقيقة البروتين BCA كيت ثقب 23235
CaCl 2 الصياد C79 - 500
غاز ثاني أكسيد الكربون 2 Airgas (يسكونس MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH الصياد A407SK - 4
حمض الهيدروكلوريك الصياد A142 - 212
Percoll جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0891-01
KH 2 PO 4 الصياد P285 - 500
PierceSDS - PAGE كيت نموذج الإعدادية ثقب 89888
كلوريد الصوديوم RPI S23020
NaHCO 3 الصياد BP328 - 500
غ 2 بو 4 الصياد S381 - 500
السكروز RPI S24060
قاعدة تريس RPI T60040
سم الأسماك الرباعية الأسنان سيغما T5651
ميكس برو أعرب عن تسمية S35 العلامات سهلة بيركن إلمر NEG772
معدات شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
أدوات تشريح
Dounce الخالط ، 7 مل (يأتي مع اثنين من الزجاج المطاحن المسمى "A" و "ب") ويتون
P1000 جيلسون Pipetman جيلسون F123602
أليجرا 6KR جهاز طرد مركزي بيكمان كولتر 366830
GH 3.8 الدوار ، الدوار الضرب دلو بيكمان كولتر 360581
بيكمان J2 - 21 جهاز طرد مركزي بيكمان
بيكمان أنابيب مع قبعات بيكمان 355672
الجدران بيضاء محولات بيكمان 342327
محولات الجدران الزرقاء بيكمان
JA - 17 الدوار ، الدوار الزاوية الثابتة بيكمان 369691

جدول الأجسام المضادة المستخدمة في البقع الغربية :

اسم جسم شركة فهرس العدد الأنواع المضيفة تخفيف عامل
β - أكتين سيغما A5441 فأر 1:2000
GFAP سانتا كروز SC - 65343 فأر 1:200
GP73 سانتا كروز SC - 134509 أرنب 1:200
HSC70 سانتا كروز SC - 7298 فأر 1:200
Laminβ سانتا كروز SC - 6261 ماعز 1:200
Prohibitin سانتا كروز SC - 28259 أرنب 1:200
PSD95 ميليبور MAB1596 فأر 5 ميكروغرام / ميكرولتر
SNAP25 AbCam ab5666 - 100 أرنب 1:2000
Synaptophysin ميليبور MAB368 فأر 1:500
β - 3 - تويولين سانتا كروز SC - 80016 فأر 1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

Related Articles