هذا هو أسلوب لتصور التصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية في الضغط المقطوع. هذه التقنية تتيح دراسة التصاق الأوعية الدموية تحت تدفق القص مع اختلاف الضغوط داخل اللمعة ما يصل الى 200 ملم زئبقي وبالتالي تقليد جي الظروف المرضية في جسم المريض من ارتفاع ضغط الدم.
مقالة منهجية
التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُفيد التقارير العالمية بأن ارتفاع ضغط الدم يصيب حوالي ربع السكان، وهو العامل البيولوجي الطبي الرئيسي المؤدي للوفاة في جميع أنحاء العالم. ويرتبط ارتفاع ضغط الدم في الأوعية الدموية بخلل في وظائف البطانة وزيادة الالتهاب، مما يؤدي إلى تصلب الشرايين وحالات مرضية مختلفة مثل مرض الكلى المزمن2، والسكتة الدماغية3، وفشل القلب4. وتتمثل الخطوة الأولية في الالتهاب الوعائي المؤدي إلى تكوين اللويحات التصلبية في شلال الالتصاق الذي يتضمن التدحرج، والربط، والالتصاق، ثم الهجرة اللاحقة للكريات البيضاء عبر البطانة. ويتم تجنيد وتراكم الكريات البيضاء في البطانة عن طريق زيادة تنظيم جزيئات الالتصاق مثل جزيء الالتصاق بالخلية الوعائية-1 (VCAM-1)، وجزيء الالتصاق بالخلية داخل الخلوية-1 (ICAM-1)، وE-selectin، بالإضافة إلى زيادة إفراز السيتوكينات والكيموكينات وزيادة تنظيم أنواع الأكسجين التفاعلية5. وتساعد الطرق المختبرية In vitro مثل اختبارات الالتصاق الساكن في تحديد الآليات المسببة للالتصاق بين الخلايا بالإضافة إلى تحليل جزيئات الالتصاق الخلوي. وقد أظهرت الطرق المستخدمة في الدراسات المختبرية in vitro السابقة أن الزيادات الحادة في الضغط على البطانة يمكن أن تؤدي إلى التصاق الخلايا الوحيدة، وزيادة تنظيم جزيئات الالتصاق والعلامات الالتهابية6؛ ومع ذلك، وعلى غرار العديد من الاختبارات المختبرية in vitro، لم تُجرَ هذه النتائج في الوقت الفعلي تحت ظروف التدفق الفسيولوجية، ولا باستخدام الدم الكامل. وبناءً على ذلك، يتم استخدام الاختبارات الحيوية in vivo بشكل متزايد في النماذج الحيوانية لإثبات الالتهاب الوعائي وتطور اللويحات. ويُستخدم المجهر الحيوي الآن على نطاق واسع لتقييم التصاق الكريات البيضاء وتدحرجها وهجرتها وانتقالها7-9. وعند الجمع بين تأثيرات الضغط على التصاق الكريات البيضاء بالبطانة، تكون الدراسات الحيوية in vivo أقل شمولاً؛ حيث تبحث إحدى هذه الدراسات في تأثيرات التدفق والقص في الوقت الفعلي على نمو الشرايين وإعادة تشكيلها، ولكن تم تقييم العلامات الالتهابية فقط عبر الكيمياء النسيجية المناعية10. نقدم هنا نموذجاً لتسجيل التصاق الكريات البيضاء في الوقت الفعلي في أوعية دموية مضغوطة وسليمة باستخدام تروية بالدم الكامل. وتعد هذه المنهجية تعديلاً لنموذج تروية غرفة وعائية خارج الجسم ex vivo9 والذي يسمح بالتحليل في الوقت الفعلي للتفاعلات الالتصاقية بين الكريات البيضاء والبطانة في الأوعية السليمة. ويسمح تعديلنا بالتحكم في الضغط داخل اللمعة حتى 200 mmHg، مما يتيح الدراسة ليس فقط تحت ظروف التدفق الفسيولوجية ولكن أيضاً تحت ظروف الضغط. وبينما أثبتت أنظمة قياس الضغط العضلي سابقاً قدرتها على ملاحظة جدار الوعاء وقطر اللمعة11 بالإضافة إلى انقباض الوعاء، فإن هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها إثبات التفاعلات بين الكريات البيضاء والبطانة في الوقت الفعلي. ونقوم هنا بتوضيح هذه التقنية باستخدام الشرايين السباتية المستخرجة من الجرذان والموصلة بقسطرة إلى غرفة تدفق مصنعة خصيصاً ومقترنة بمجهر فلوري. تم تجهيز غرفة الوعاء بغطاء زجاجي سفلي كبير يسمح باستخدام عدسة شيئية ذات قطر كبير ومسافة عمل قصيرة لتصوير الوعاء. علاوة على ذلك، يمكن استخدام محفزات و/أو مضادات مختارة لمزيد من البحث في الآليات التي تتحكم في الالتصاق الخلوي. وتشمل مزايا هذه الطريقة مقارنة بالمجهر الحيوي عدم الحاجة إلى جراحة توغلية، وبالتالي يمكن الحصول على إنتاجية أعلى. كما تتيح هذه الطريقة استخدام علاج مثبط موضعي للوعاء المطلوب، بينما لا يتيح المجهر الحيوي سوى العلاج المثبط الجهازى.
البروتوكول
1. عزل الشرايين السباتية
- Euthanase10 الاسبوع القديمة سبراغ داولي الفئران عبر CO 2 / O 2 الاختناق.
- اليمين واليسار الموحد المكوس الشرايين السباتية مع الأبهر والقلب ضمان الحد الأدنى تمتد من السفن.
- في المخزن الجليد الباردة كريبس فصل الشرايين السباتية من الشريان الأورطي والقلب وأداء تشريح قريبة.
- تبقي السفن معزولة في كريبس على الجليد قبل التركيب.
تقريبا. الساعة = 45 دقيقة
2. فتيلة السفينة الغرفة
- في الموصلات القريبة والبعيدة من غرفة عازلة سفينة كريبس تدفق الحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية عن طريق غرس كربوجين الغاز (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) من خلال المنطقة العازلة في 37 درجة مئوية.
- ضمان أنابيب ومسح cannulas تماما ويتم محاذاة.
- تدفق كريب العازلة من خلال P1 (القريبة) ومحولات الطاقة P2 (قاص). إغلاق صنابير المياه لضمان عدم وجود فقاعات الهواء في محولات الطاقة.
- ربط المحولات في موصلات المقابلة مرة أخرى وتدفق أكثر كريبس العازلة ضمان عدم فقاعات الهواء. إغلاق الصنابير الى قاعة المحكمة.
تقريبا. الساعة = 15 دقيقة
3. غرفة الضغط على سفينة
- بدوره على معدات الضغط : أجهزة الضغط ومراقبة ضغط ، ومضخة تمعجية (الشكل 1).
- مع مضخة تمعجية على الضغط والضغط على أجهزة أوتوماتيكية العازلة كريبس من خلال تشغيل الأنبوب عند 20 مم زئبق (الطلب في 1) ، وضمان عدم فقاعات الهواء.
- توصيل أنابيب للمحول P2 مغلقة. وسوف تصبح ضغط مستقرة.
- فتح الصنبور P2 إلى غرفة سفينة لطرد أي فقاعات ثم أغلق الخروج.
- ملء حوض الاستحمام مع العازلة كريبس (5 -- 7 مل).
تقريبا. الساعة = 10 دقيقة
4. تصاعد السفينة
- تحت المجهر مكان تشريح العلاقات البوليستر الأسود على كل قنية (الشكل 2).
- نقل cannulas وأصحاب قنية ، وبصرف النظر جبل. ¼ السفينة (قوس الأبهر نهاية) على قنية P1 ضمان عدم تمزق السفينة.
- استخدام حقنة مليئة العازلة كريبس تدفق الدم الزائد بلطف من السفينة عن طريق محول P1. إغلاق P1 إلى الغرفة.
- تأمين السفينة إلى قنية P1 مع ربطة عنق البوليستر.
- نقل cannulas / أصحاب قنية أقرب للتركيب على القنية P2.
- جبل نهاية البعيدة للسفينة (~ ¼ طول) على القاصي قنية. آمنة مع ربطة عنق البوليستر.
تقريبا. الساعة = 20 دقيقة
5. الضغط على سفينة
- ضبط أصحاب قنية لضمان عدم الانحناء أو التمدد في السفينة.
- مع P1 و P2 مغلقة إلى غرفة تبديل أجهزة ضغط من تلقائي إلى يدوي. التحقق من مضاعفات ضغط عدم وجود انخفاض في ضغط متواصل في غضون 10 ثانية. إذا كان هناك ، يتم حدوث تسرب وصلات ومحولات الطاقة تحتاج إلى المضمون في المكان.
- ضبط مضاعفات ضغط مرة أخرى إلى التلقائي P2 ثم فتح الى قاعة المحكمة. تحت المجهر مراقبة السفينة تمدد عند فتح الصنبور إلى الغرفة.
- تبديل أجهزة الضغط إلى يدوي. الاختيار مرة أخرى للانخفاض المستمر في الضغط في غضون 10 ثانية. إذا كان هناك تسرب ثم النظام لا ضغط ضيق وهناك من المرجح أن يكون ثقبا في السفينة.
- التبديل إلى P1 فتح التلقائي للغرفة. على إعداد دليل تأكد من أن الضغوط لا تزال مستقرة.
- إذا لم يحصل أي تسرب ، على إعداد دليل لزيادة الطلب 2 (40 مم زئبق).
- التكيف التلقائي ومراقبة السفينة تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، وضبط صاحب قنية لضمان عدم خضوع في vessel.Check عن التسريبات حول إعداد يدوي.
- كرر الخطوات من 5،6-5،7 زيادة الطلب على 3 (60 ملم زئبقي) ، 4 (80 مم زئبق) وهلم جرا ، حتى يتم التوصل إلى الضغط المطلوب.
تقريبا. الوقت = 15 -- 30 دقيقة
6. تفرخ السفينة الضغط
- مجموعة الاتصال وحدة تحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- مع الثانية مضخة تمعجية العازلة كريبس يروي (1 مل / دقيقة) في الإناء حمام الغرفة.
- الاتصال تتم إزالة الشافطة لضمان الغرفة فقط الطبقة العليا من حوض الاستحمام.
- احتضان سفينة الضغط على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الضغط لتعيين التلقائي.
- تحقق من عدم حدوث أي تسرب الضغط (التحول إلى دليل) بشكل دوري.
- ويمكن ملاحظة آثار التدخلات الدوائية المختلفة ببساطة عن طريق إضافة إلى مجمع الحمام أثناء الحضانة.
تقريبا. الوقت = 1 ساعة
7. Perfusing السفينة مع ضغط الدم الكامل
- خلال الحصول على حضانة على الأقل 7.5 مل من الدم البشري كله / السفينة التي تم جمعها في الهيبارين يو 40 / مليلتر دم. في احتضان الصقر 50 مل عند 37 درجة مئوية.
- 10 دقائق قبل نهاية طنانه الدم حضانة التسمية مع VybrantDil (1:1000) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
- بعد 10 دقيقة ، وجمع الدم في حقنة إزالة أي فقاعات ، ونعلق على مضخة المحاقن مع سترة الحرارة وضعت في 37 درجة مئوية.
- إغلاق محول P1 للغرفة / السفينة والمحاقن وتوصيل أنابيب النفايات.
- تطهير الدم في 1000 ميكرولتر / دقيقة عن طريق أنابيب النفايات لإزالة أي فقاعات.
- فتح P1 الى قاعة المحكمة. فإن أجهزة ضبط الضغط تلقائيا للحفاظ على الضغط المطلوب.
- يروي الدم عند 100 ميكرولتر / دقيقة.
- باستخدام المجهر الفلورسنت بالإضافة إلى كاميرا رقمية حقول two سجل السفينة perfused لمدة 15 ثانية في 1 و 3 و 5 و 7.5 و 10 دقائق.
- ويمكن تقييم سلامة نضح آخر وظيفة بطانة الأوعية الدموية عن طريق تقنيات مثل الدوائية يمكن تحديد myograph والتصاق جزيء التعبير التي المناعية للتحقق من صحة مزيد من الاستجابة للالتهابات.
تقريبا. الساعة = 15 دقيقة
8. ممثل النتائج :
ويظهر رسم تخطيطي للضغط الإعداد الغرفة في الشكل 1. ويمكن تصور أن يكون مع كاميرا رقمية بالإضافة إلى النتائج المجهر الفلورسنت على الفور عن طريق تسجيلات فيديو حية. وينظر الى صور الفيديو ممثل في الشكل 3 حيث تعتبر الكريات البيضاء لتكون ملتصقة على البطانة اذا ظلت ثابتة لمدة 10 ثانية. يمكن مع تسجيلات فيديو على الخلايا حلقة مستمرة انضمت تحسب حقل متوسط. في حين أن كلا منخفضة (الشكل 3A) وعالية (الشكل 3B) الضغط سوف يسبب قدرا من الالتصاق وينظر الى زيادة كبيرة في التصاق الكريات البيض في الضغط العالي داخل اللمعة ويتجلى هذا أيضا كميا (الشكل 4).
الشكل 1. مضغوطة سفينة فيفو السابقين التخطيطي الغرفة. سفينة مقنى متصلا محول (P1) القريبة والبعيدة (P2) محولات ضغط الدم الذي يمكن أن يتم التلاعب داخل السفينة. يتم الاحتفاظ نضح من خلال محول P1 و P2 الضغط عبر محول.
الشكل 2. Cannuala مع العلاقات بين البلدين. مرفقة العلاقات البوليستر الأسود إلى كل قنية.
الشكل 3. صور الفيديو التمثيلية. الحيوي التصاق الخلية (السهم الأحمر) تحت مضان في 80 مم زئبق (أ) و 120 مم زئبق (B) بعد 10 دقيقة من نضح.
الشكل 4. السباتي التصاق كريات بيضاء في الشرايين بعد سبراغ داولي حضانة ساعة 1 في انخفاض (80 مم زئبقي) والضغط العالي (120 مم زئبق). *** P <0.001 ، وتحليلها وبنسبة 2 في اتجاه والتدابير المتكررة ANOVA باستخدام اختبار آخر مخصص Bonferroni.
المناقشة
هذا هو أسلوب لدراسة تعديل لالتصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية الدموية سليمة في ظل ظروف الضغط معزولة في الوقت الحقيقي. نضح من الغرفة وحدها السفينة تمكن من التحقق من صحة السريع الموالية للالتهابات سلالات من الفئران الكبيرة والسفن الفئران. تمكين التلاعب الضغط يسمح لوحظ من التفاعلات الحيوية الخلية المنخفض لضغوط داخل اللمعة عالية جدا ، وبالتالي أفضل تقليد جي الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. ويمكن أيضا للسفن القطر يقاس باستخدام خلايا كافية تصوير برنامج ويمكن تحديد تدفق القص وبالتالي معدل وبالتالي التلاعب.
مع قدرات myograph والخمسين ، التدخلات الدوائية وضعها في حمام تضيف بعدا آخر للظروف تجريبية محتملة مع هذا النموذج من الدراسات تمكين المسارات الآلية والإشارات. في حين لا يستطيع المحافظة على البطانية خلال التلاعب وأكد أن الضغوط ، يمكن أن تتم الاستجابة لأدن تشافيز وPE نضح آخر 9.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا يدل على الإعداد آثار الضغط داخل اللمعة على الخلية الى خلية التفاعلات لا آثار تدفق الدم الانقباضي أو نابض ولا الضغوط الانبساطي. وعلاوة على ذلك ، في حين لوحظت تغييرات الضغط الحاد على التصاق الكريات البيض ، ويمكن استخدام هذا الإعداد أيضا أن ننظر إلى آثار الضغط المزمن (أي زيادة مرات حضانة واستخدام الحيوانات الضغوط المزمنة نموذجا). وأظهرت سبراغ الشرايين السباتية داولي المشتركة في هذه المجموعة لكنها يمكن أن تستخدم السلالات والأنواع الأخرى مع إجراء التعديلات المناسبة لحجم قنية. في الواقع ، فمن المهم أن نلاحظ أن العمر والوزن من الحيوانات تؤثر على حجم السفينة ، وبالتالي أن مجموعة يحتاج إلى ما يقارب تكون فردية عن كل سفينة. يمكن تشريح وثيق ودقيق لتحسين التصور النسيج الضام من الكريات البيض كثيرا.
الإفصاحات
تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من البحوث الطبية والتعليم ألفريد المخفر الحيوان جنة الأخلاقيات ومستشفى ألفريد جنة الأخلاقيات.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة في جزء من برنامج الحكومة OIS الفيكتوري ، والوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية من برنامج المنح والمشاريع أستراليا (JPF شين الغبار) ، والمنح الدراسية للدراسات العليا (D ميشل).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف / المعدات | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| مجهر | كارل زايس ، وشركة | STEREO ديسكفري V.20 | |
| الدكتوراه مضخة الحقنة 2000 | جهاز هارفارد | 70-2016 | |
| كاميرا رقمية والمراقب المالي | هاماماتسو ORCA - ER | C4742 - 95 | |
| مضان نظام الإضاءة. | التجويف حيوية | X - سايت 120 | |
| سفينة غرفة | نظم التهوية المعيشة | CH/1/SH | |
| الضغط ومضخة هيدروليك المراقب تحوي | نظم التهوية المعيشة | PS -- 200 | |
| ضغط التروية مراقب | نظم التهوية المعيشة | م -- 4 | |
| 2 X محول الضغط | نظم التهوية المعيشة | PT -- F | |
| درجة الحرارة المراقب المالي | نظم التهوية المعيشة | TC - 01 | |
| مضخة تمعجية | Instech المختبرات ، وشركة | P720 | |
| VybrantDil الخلية وضع العلامات الحل | Invitrogen | V - 22885 | استخدام 1:1000 |
المراجع
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
إعادة الطباعة والأذونات
