الزرع عبر الأنف للخلايا الدبقية البشرية المستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة في دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Parajuli، B.، et.al. زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان في دماغ الفئران ذات الكفاءة المناعية عبر طريق الأنف غير الغازي. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو الزرع عبر الأنف لخلايا الخلايا الدبقية البشرية المستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSMG) في دماغ الفأر. يتم تطبيق الهيالورونيداز على فتحات أنف الفأر المستنفد من الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز النفاذية. يتم إعطاء تعليق iPSMG داخل الأنف, ويسمح للفأر بالتعافي. يتم إعطاء وسائل الإعلام الغنية بعامل النمو بانتظام لدعم بقاء iPSMG في أنسجة المخ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير وسط الخلية ووسط الزرع وخليط التخدير

1. تحضير وسط الخلية بإضافة 10٪ مصل بقري للجنين و 0.1٪ بنسلين / ستربتومايسين في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو.
2. قم بإعداد وسط الزرع عن طريق إضافة عامل تحفيز المستعمرة البشرية 1 أو hCSF1 (250 نانوغرام / مل) وعامل النمو البشري المحول بيتا 1 أو hTGF-β1 (100 نانوغرام / مل) إلى وسط الخلية.
3. تحضير خليط التخدير للحقن داخل الصفاق عن طريق خلط 0.45 مل من هيدروكلوريد ميديتوميدين ، و 1.2 مل من ميدازولام ، و 1.5 مل من طرطرات البوتورفانول في 11.8 مل من محلول ملحي عادي.

2. تحضير الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSMG)

ملاحظة: تم الاحتفاظ ب iPSMG المجمدة (جدول المواد) عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

1. قم بإذابة الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينات حتى يذوب كل الجليد المرئي.
2. أضف الخلايا الدبقية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSMG) المستحثة المذابة إلى وسط المزرعة الدافئ إلى 37 درجة مئوية. أضف 1 مل من الخلايا المذابة التي تحتوي على وسط (1 × 10⁶ خلايا) إلى 10 مل من وسط الثقافة.
3. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبات الخلية.
4. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة جميع المواد الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. من المستحسن الإزالة الكاملة للطافي لتقليل تخفيف تركيز السيتوكين في وسط الزرع.
5. أضف وسط الزرع للحصول على تركيز خلية 1 × 10⁵ خلايا / ميكرولتر.
6. ضع iPSMG على الجليد وانتقل على الفور إلى الزرع.
   ملاحظة: يتم إعداد iPSMG للزرع على مقعد نظيف لتجنب التلوث.

3. تحضير الفأر للزرع عبر الأنف (Tsn)

1. قم بإطعام ذكور الفئران البرية (C57BL / 6J ، 8 أسابيع) بنظام غذائي يحتوي على PLX5622 لمدة 7 أيام.
2. في نهاية اليوم السابع ، توقف عن نظام PLX الغذائي وأطعم الفئران بنظام غذائي طبيعي حتى نهاية الدراسة.
   ملاحظة: يتم تحضير PLX5622 النظام الغذائي الذي يحتوي على إضافة 1.2 جم من PLX5622 في 1 كجم من AIN-93G (جدول المواد).

4. زرع الخلايا عبر الأنف

1. بعد 24 ساعة من التوقف عن تغذية PLX ، قم بوزن الفئران وتخديرها باستخدام حقن داخل الصفاق لخليط التخدير (0.2 مل / 20 جم).
2. بعد تخدير الفئران تماما كما تم تقييمها من خلال عدم الاستجابة لمنعكس انسحاب الدواسة (قرصة إصبع القدم الصلبة) ، قم بإعطاء 2.5 ميكرولتر من الهيالورونيداز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (100 وحدة / مل) ، قبل ساعة واحدة من زرع iPSMG عبر الأنف إلى كل فتحة أنف مرتين باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لزيادة نفاذية الغشاء المخاطي للأنف.
3. بعد تطبيق الهيالورونيداز ، ضع الفئران في وضع ضعيف.
4. كرر الخطوة 4.2 قبل 10 دقائق من زرع iPSMG عبر الأنف.
5. ضع 2.5 ميكرولتر من معلق الخلية في فتحة أنف واحدة من الفأر باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر.
6. ضع الفأر في وضع ضعيف لمدة 5 دقائق قبل إعطاء تعليق الخلية على فتحة الأنف الأخرى.
7. كرر الخطوتين 4.5 و 4.6 أربع مرات ، مع تطبيق حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل.
8. ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة حرارة 37 درجة مئوية حتى التعافي من التخدير.
9. في 48 ساعة بعد التوقف عن تغذية PLX ، كرر الخطوات 4.1-4.7 على نفس الفئران مرة أخرى.
   ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن خلايا iPSMG توضع على الجليد أثناء الزرع.

5. تطبيق السيتوكينات

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط التخدير (0.2 مل / 20 جم).
2. ضع 2.5 ميكرولتر من وسط الزرع في فتحة أنف واحدة من الفأر باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر.
3. ضع الفأر في وضع ضعيف لمدة 5 دقائق قبل إعطاء وسيط الزرع في فتحة الأنف الأخرى.
4. كرر الخطوتين 5.2 و 5.3 أربع مرات ، مع تطبيق حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل.
   ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن الإدارة الأنفية لوسط الزرع (السيتوكينات البشرية) مطلوبة كل 12 ساعة من أجل جدوى iPSMG المزروعة حتى نهاية الدراسة.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 100٪ ؛ '>< فئة الجدول = 'ck-table-resize'>< نمط العمود = 'العرض: 25٪ ؛ '>< نمط عمود = 'العرض: 25٪ ؛ '>< نمط العمود = 'العرض: 25٪ ؛'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific10566 AIN 93G الشرقية الخميرة الشرقية Co مصل الأبقار الجنينGE Healthcare Life SciencesSH30070.03 مختبر iPSMGShionogi & Co.، Ltd المجمد لاكتشاف الأدوية وأبحاث الأمراضعامل تحفيز المستعمرة البشرية 1 (hCSF1)PeproTech300-25 HyaluronidaseSigma-AldrichH-3506 Medetomidine hydrochlorideMeiji SeikaVETLI5 MidazolamAstellas18005A2 ParaformaldehydeWako Pure Chemical Industries162-16065 Penicillin / StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122 PipetteEppendorf3120000011 طرف الماصةEppendorf30076028 PLX5622أماديس كيماويكالA930097 تحويل عامل النمو-β1 (Tgf-b1)PeproTech100-21