Method Article

التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل 'Peroxidative' و 'مؤكسد' Footprinting الهيدروكسيل

DOI:

10.3791/3244

⸱

October 17th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College , 2Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول توضح كيفية قياس المغنيسيوم (II) التي تعتمد على تشكيل بنية الحمض النووي الريبي العالي من قبل اثنين من أساليب footprinting الهيدروكسيل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزيئات الحمض النووي الريبي تلعب دورا أساسيا في علم الأحياء. بالإضافة إلى نقل المعلومات الوراثية ، يمكن أن الحمض النووي الريبي أضعاف في هياكل التعليم العالي دورا فريدا الوفاء بيولوجية محددة على النحو الموثق ، منظم أو المحفز. معلومات حول تكوين الاتصال العالي ضروري لفهم وظيفة من جزيئات الحمض النووي الريبي. جذور الهيدروكسيل (OH •) هي تحقيقات فريد هيكل الأحماض النووية بسبب التفاعلات عالية وحجم صغير. 1 عندما تستخدم على النحو التحقيق footprinting ، جذور الهيدروكسيل خريطة سطح المذيب يمكن الوصول إليها في العمود الفقري phosphodiester من الحمض النووي الريبي (1) و2 مع غرامة مثل القرار النوكليوتيدات واحد. ويمكن استخدام footprinting الهيدروكسيل لتحديد النيوكليوتيدات داخل سطح التماس بين الجزيئات ، مثل الحمض النووي في البروتين (1) والجيش الملكي النيبالي المجمعات البروتين. ويمكن تحديد التوازن 3 و 4 التحولات الحركية من خلال إجراء footprinting الهيدروكسيل كدالة لsolutiعلى المتغير أو الوقت ، على التوالي. ومن السمات الرئيسية لfootprinting هو أن تقتصر على التعرض لجنة التحقيق (على سبيل المثال ، "واحد من الزلزال حركية') في نتائج موحدة لأخذ العينات من كل من البوليمر النوكليوتيدات 5

في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نستخدم المجال P4 - P6 من ribozyme رباعية لتوضيح RNA إعداد وتصميم عينة من الأيسوثرم (II) بوساطة المغنيسيوم للطي. نحن تصف استخدام معروفة الهيدروكسيل بروتوكول footprinting جذرية تتطلب H 2 O 2 (نحن نسمي هذا "peroxidative' البروتوكول) ، وقيمة ، ولكن ليس معروفا على نطاق واسع ، وهذا البديل يا المنحل يستخدم بشكل طبيعي 2 (نحن نسمي هذا "لل التأكسدي 'البروتوكول). ويقدم لمحة عامة عن تقليص البيانات وتحويلها وإجراءات التحليل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف Footprinting

  1. يعد رد فعل 10X العازلة التي تحتوي على 100 ملي كاكوديلات الصوديوم ، EDTA 1 مم ، و 1 بوكل M. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تصفية العازلة باستخدام خلات 0.2 ميكرومتر جهاز تصفية (Nalgene). ملاحظة : لا RNA الماصة مباشرة في المخزن 10X.
  2. تحضير مزيج تفاعل المعايرة لكل رد فعل على النحو المبين في الجدول 1. وينبغي أن حجم المزيج المعايرة (1X العازلة والمغنيسيوم (II) في التركيز المطلوب) أن 90 ميكرولتر ، قبل ان يضيف 10μl من الحمض النووي الريبي في المخزن 1X.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

footprinting الهيدروكسيل هو أداة قيمة لتقييم المذيب مساحة يمكن الوصول إليها من الأحماض النووية. يمكن أن يتبع تشكيل النوعي والكمي لهيكل التعليم العالي 14 بوصفها وظيفة من المعلمات مثل نوع وتركيز أيون ، ودرجة الحموضة ، درجة الحرارة ، والبروتينات ملزمة أو قابلة للطي العوامل المشتركة. تركيبة قوية لبروتوكول مستقيم إلى الأمام ، وغير مكلفة وسهولة الحصول الناتجة المذيبات والمعلومات القابلة للطي على مستوى واحد النوكليوتيدات يجعل هذا الأسلوب جذابة جدا. عادة يتم تنفيذ footprinting .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة RO1 - GM085130 والمؤسسة الوطنية للعلوم MCB0929394. نشكر الدكتور ماريون شميت لضيافتها وعلى السماح لنا الفيلم في مختبرها.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسمشركةالقط #
كاكوديلات الصوديوم (حذر! سام) سيجما ألدريتشC4945-25 جم
EDTA (0.5 م)أمبيونAM9260G
DEPC المياه المعالجةأمبيونAM9915G
أسيتات الصوديوم (3 م)أمبيونAM9740
MgCl 2< / sub> (1 م)أمبيونAM9530G
اليورياأمبيونAM9902
الصوديوم سيتراتسيجما ألدريتشW302600
الحمض النووي الريبيسيجما ألدريتشR-7876
صوديوم L-أسكورباتسيجما ألدريتشA7631-25g
Fe (NH4< / sub>) 2< / sub> (SO4< / sub>) 2< / sub> . 6 H2< / sub>OSigma-AldrichF1543-500g
RNase T1FermentasEN0541
بيروكسيد الهيدروجين (30٪)سيجما ألدريتش349887

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
  2. Celander, D. W., Cech, T. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydroxyl Radical FootprintingRNA Tertiary StructurePeroxidative ProtocolOxidative ProtocolRNA Folding IsothermsMagnesium Mediated FoldingDenaturing PAGE AnalysisBand Intensity QuantificationHill Equation FittingSolvent Accessibility Mapping

Related Articles