مقالة منهجية

وساطة رني ضربة قاضية بواسطة الجينات وTransgenesis Microinjection في نيماتودا Necromenic Pristionchus pacificus

DOI:

10.3791/3270

⸱

أكتوبر 16, 2011

 , 
1Biology Department, California State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات النموذج ، ويمكن التلاعب transgenesis ظائف الجينات في حين يمكن رني ضربة قاضية نصوص محددة مرنا 1-2. هذا البروتوكول يهدف لتوضيح التقنيات اللازمة لإدخال الحمض النووي التي تنتقل ستابلي وعابرة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل في الخيطية necromenic Pristionchus pacificus للدراسات في البيولوجيا التطورية والإنمائية ، والسلوكية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أنها غير معقولة على نحو متزايد بالنسبة للكائنات نموذج الناشئة للحصول على تسلسل الجينوم تماما ، وكذلك في العمق وظائف الجينات والتحليلات التعبير تدخل الحمض النووي الريبي وtransgenesis مستقرة. تظل محدودة في كثير من الأنواع بسبب التشريح والبيولوجيا الخلوية خاصة الجزيئية للكائن على سبيل المثال ، خارج من انواع معينة المجموعة التي تضم تاج ايليجانس انواع معينة 3 ، تنتقل ستابلي خطوط المعدلة وراثيا في انواع معينة من غير الأنواع لم يتم الإبلاغ عنها في هذه العائلة خادع (النيماتودا) ، مع استثناء من الأسطوانيات البرازية 4 و 5 Pristionchus pacificus. لتسهيل توسيع دور P. pacificus في دراسة التنمية والتطور ، والسلوك 6-7 ، ونحن هنا تصف الأساليب الحالية لاستخدام microinjection الحيوانات المعدلة وراثيا لجعل والجينات التي نهدم رني. مثل الغدد التناسلية لل P. pacificus هو syncitial وقادرة على دمج الحمض النووي والحمض النووي الريبي في البويضات عند نقلها بواسطة microinjection المباشر. خلافا جيم ايليجانس لكن مستقرة الميراث التحوير والتعبير الجسدي في P. pacificus يتطلب إضافة الحمض النووي الجيني النفس يتفاعل مع endonucleases مكملة لينتهي من الجينات المحورة المستهدفة وعلامات coinjection 5. إضافة الحمض النووي الجيني الناقل مماثل من شرط للتعبير عن التحوير في 4 و الأسطوانيات البرازية في الخلايا الجرثومية من C. ايليجانس. ومع ذلك ، فإنه ليس من الواضح ما اذا كان شرط محدد الحمض النووي للحيوانات "الجينوم الخاصة لأن P. pacificus سوما فعالة جدا في إسكات غير معقدة متعددة الجينات أو أن نسخة خارج الصبغي صفائف في P. pacificus تتطلب متواليات الجينوم لتجميع kinetochore السليم أثناء الانقسام. الهجرة البطنية من (اثنين المسلحةمزدوجة الرحم) المناسل في المخنثين يزيد من تعقيد القدرة على ضخ كل من الغدد التناسلية في الديدان الفردية 8. علينا أن نظهر أيضا استخدام microinjection ضربة قاضية لمتحولة المهيمنة (الدوارة ، tu92) عن طريق حقن المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) في الحصول على الغدد التناسلية غير المتداول F 1 النسل. خلافا جيم ايليجانس ، ولكن مثل الديدان الخيطية معظم الدول الأخرى ، P. pacificus PS312 ليس تقبلا لرني النظامية عن طريق التغذية وتمرغ وبالتالي يجب أن تدار من قبل الرنا المزدوج الجديلة microinjection في المناسل syncitial. في هذه الدراسة الحالية ، ونأمل أن تصف العملية microinjection اللازمة لتحويل المؤسسة العامة للتقاعد ، المروج EGL - 4 : : GFP مراسل الانصهار وضربة قاضية الأسطوانة المهيمنة PRL - 1 (tu92) متحولة في بروتوكول بالمعلومات بصريا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transgenesis : إعداد الحمض النووي

  1. المهيمن المشترك الحقن علامة : pRL3 [PPA - PRL - 1 (tu92)]
    والبلازميد pRL3 هو المهيمن المشترك الحقن علامة لتحديد بصريا أحداث التحول الناجح. هذا البلازميد بترميز لأليل متحولة المهيمنة (tu92) من الجين PPA PRL - 1 - ترتبط ارتباطا وثيقا sqt - 1 الجين الكولاجين في C. ايليجانس ويحول تحرك في اتجاه عقارب الساعة الى wildtype الجيبية حركات اللف على طول جسم الدودة محور 1،5. الحيوان تحول مشابه جدا للعلامة الاختيار الشعبي السائد رول - 6 (su1006) المستخدمة في C. ايليجانس على مدى السنوات ال 20 الماضية.
  2. الهدف التحوير المراسل : المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP
    يمكن ربط الجينات ذات الاهتمام transcriptionally أو translationally إلى GFP تسلسل الترميز 9. في هذه الدراسة ، والمؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4promoter : تم GFP (EGL - 4 ، المركب كيناز البروتين التابعة) الاستخدام :د لتحديد ما إذا كان جزء 2 كيلو المنبع لبدء الترجمة يمكن أن تمنح في التعبير GFP P. pacificus PS312. هذا ناقلات GFP يحتوي على المنطقة مع تعديل الترميز GFP
    الإنترونات متعددة في المؤسسة العامة للتقاعد ، RPL - 23 3 'UTR فاصل 5 قدم وانغ Xiaoyue تتكرم ورالف جيه سومر (معهد ماكس بلانك ، توبينجن وألمانيا والاتحاد الأوروبي). و
  3. الجينومية دنا : PS312
    إضافة P. wildtype مطلوب pacificus الحمض النووي الجيني PS312 للحصول على الميراث التحوير مستقرة ، ولا سيما من الحيوانات المعدلة وراثيا 1 F لذريتها 2 F 5. فإنه ليس من المؤكد حتى الآن إذا كان الحمض النووي الجيني الأشكال المعقدة صفائف الكروموسومات اضافية مع الجينات المحورة اثنين (علامة المشترك الحقن PRL - 3 والمؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : مراسل GFP) مشابهة لتلك التي لوحظت في مستقر خطوط المعدلة وراثيا في 2 F جيم ايليجانس 3. ومع ذلك ، فإن شرط الحصول على الحمض النووي والجينات المحورة الجينومية لتبادل cohesi متطابقةلقد يتدلى توحي بقوة تشكيل صفائف خارج الخلايا الصبغية مجمع المضيف يمكن التعرف على الحمض النووي للانتقال السليم (gDNA إعدادها باستخدام سيغما G1N10 الطقم).
  4. الحمض النووي الهضم
    وتستخدم أنزيمات تقييد ليصبح خطي من المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP ناقلات الحمض النووي لانتاج ويتدلى لزجة متوافق مع pRL3 علامة المشترك الحقن وgDNA PS312. مزيج من خلال استغلال ، وليس vortexing. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
pRL3 4 ميكروغرام
10xbuffer 10 ميكرولتر
PstI (10 U / ميكرولتر) 4 ميكروليتر
DH 2 O ~
المجموع : 100 ميكرولتر
المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP 4 ميكروغرام
10X العازلة 10 ميكرولتر
سالي (10 U / ميكرولتر) 4 ميكروليتر
DH 2 O ~
المجموع : 100 ميكرولتر
gDNA PS312 10 ميكروغرام
10X العازلة 10 ميكرولتر
PST الأول وأنا سال (10 U / ميكرولتر) ميكرولتر 8
DH 2 O ~
المجموع : 100 ميكرولتر

الجدول 1. الخليط لتقييد الإنزيم دايجست.

  1. الحمض النووي هطول الأمطار ، وإعداد
    1. إضافة 1:10 خلات الصوديوم (3 م 3 NaCOOCH الهيدروجيني 5.2) و2.5X حجم الإيثانول بنسبة 100 ٪ على المنتج لهضمها ، ويضاف 20 نانوغرام / ميكروليتر من الجليكوجين لرؤية بيليه أسهل.
    2. الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    3. صب وطاف بواسطة تيبينانوغرام ببطء أنبوب الطرد المركزي رأسا على عقب ومن ثم النقر على ورقة الأنسجة ، والتأكد من أن بيليه هو آمن على الزاوية السفلى من الأنبوب وخالية من الايثانول.
    4. إضافة 1 مل من الايثانول 75 ٪.
    5. تدور على الفور في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. صب وطاف قبل التحول ببطء أنبوب الطرد المركزي رأسا على عقب ومن ثم النقر على ورقة الأنسجة التأكد من أنها آمنة بيليه في الزاوية السفلى من الأنبوب وخالية من الايثانول.
    7. بيليه الجافة في اجهزة الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة فراغ لمدة 5 دقائق في 25-30 درجة مئوية ، حتى جافة وخالية تماما من الايثانول.
    8. إضافة 30 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات أو معقمة درهم 2 O وترك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لفترة وجيزة قبل الاختلاط دوامة.
    9. الجدول 2 يصف كيفية إنشاء خليط من كل حقن الحمض النووي المنقى للحقن.
    10. المحل في -20 درجة مئوية. بعد ذوبان الخليط عن طريق الحقن ، وتدور في أسفل أنبوب 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للتخلص جسيمات الحطام التي قدتسد إبرة الحقن.
المادة الوراثية تركيز
المؤسسة العامة للتقاعد ، EGL - 4P : GFP (سالي) > 5 نانوغرام / ميكروليتر (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI) > 1 نانوغرام / ميكروليتر
gDNA PS312 (PstI + سالي) > 60 نانوغرام / ميكروليتر
DH 2 O ~
المجموع : 30 ميكرولتر

الجدول 2. خليط PPA PRL - 1 - الحقن

2. الحمض النووي الريبي التدخل : في المختبر توليف الحمض النووي الريبي مزدوج تقطعت بهم السبل

  1. استخدام PCR لتضخيم الجين من الفائدة. واستخدمت RHL091 5' - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3 "(BamHI الموقع) وRHL092 5' - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3" (موقع PstI) لتضخيم الجينومية غليان 464 فرجمنة (موقف 3-466) من ناقلات pRL3 تحتوي على أليل PPA - PRL - 1 (tu92).
  2. هضم منتج PCR مع BamHI وPstI.
  3. Ligate جزء لBamHI / PstI يهضم pL4440 رني ناقلات التغذية 2.
  4. تحويل ناقلات إدراجها في الخلايا المختصة وتنمو عليها وسائل الاعلام على لوحات أمبيسيلين LB (50 ميكروغرام / مل).
  5. حدد إدراج ناقلات بنجاح PCR باستخدام بادئات T7.
  6. استخدام T7 يحيط PCR المنتجات التي تحتوي على جينات PRL - 1 لجعل المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الرنا المزدوج الجديلة) باستخدام BLOCK - IT رني توليف مجموعة (Invitrogen).
  7. تركيز الرنا المزدوج الجديلة الأفضل إذا> 200 نانوغرام / ميكروليتر ، وتصل إلى 1 ميكروغرام / ميكروليتر للحقن.
  8. المحل في -20 درجة مئوية. بعد ذوبان الخليط عن طريق الحقن ، وتدور في أسفل أنبوب 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للتخلص من جسيمات الحطام التي قد تسد إبرة الحقن.

3. Microinjection : بروتوكول لحقن الجينات المحورة و / أو الرنا المزدوج الجديلة

  1. حقن الابر
    1. مجموعة الإبرة Narishige مجتذب (نموذج # : PC - 10) درجة الحرارة :
      1. بدوره مفتاح أسفل إلى "مسخن NO.2".
      2. تحويل "مسخن NO.2 الصفة". مقبض الباب حتى لوحة يقرأ 55،0-60،0 درجة مئوية لمدة طرف مدبب إبرة ذات أطوال متباينة.
    2. أدر مفتاح أسفل الظهر إلى "الخطوة 1" (تسحب الإبرة في خطوة واحدة).
    3. تحميل إبرة في الغرفة والتأكد من أنها آمنة.
    4. اضغط على زر "ابدأ" (زر أحمر) والسماح ليتم سحبها إبرة مع جميع الأوزان (وهذا ينبغي أن إبرتين متطابقة في اتجاهين متعاكسين).
    5. إزالة الإبرة من غرفة وتخزينها في لوحة الثقافة البلاستيك المضمون في المكان قبل المباراة ، دوه لمنع الغبار من التراكم على الإبر.
  2. تصاعد الوسادات
    1. في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ، وجعل حل 2 ٪ آجار نوبل بإضافة 0.02 غرام من آجار نوبل إلى 1 مل من H 2 O. ويمكن تخزين أغار عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى عام.
    2. مزيج دقيق وآغار تذوب في كتلة لتعيين حرارة> 88 درجة مئوية.
    3. باستخدام micropipette 1 مل ، ضع قطرة من أجار السائل الكريم إلى 2 ٪ في منتصف شريحة زجاجية (فيشر ، 12 544 فهرنهايت).
    4. تتسطح عن طريق وضع شريحة أخرى من الزجاج على أعلى من الانخفاض.
    5. تكرار "الخطوة إسقاط" حتى يكون هناك طبقة من الزجاج خمس شرائح.
    6. إزالة كل شريحة زجاجية عن طريق تحريك الشرائح الزجاجية قبالة بعضهما البعض.
    7. آغار منصة جافة تتسطح على الشرائح الزجاجية في فرن الفراغ عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ليلة وضحاها (أو في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها).
    8. جعل منصات حقن وتخزين متعددة لاستخدامها في المستقبل.
  3. Microinjection في المناسل hermaphroditic

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي للP. pacificus التشريح. الخلايا الأنوية واضحة هي خلايا جرثومية الإناث (البويضات) والجزء المظلل الرمادي هو الأمعاء. ويرد واحد فقط التناسلية الأمامية القاصيولكن لاحظت المناسل two القاصي عبر بعضها البعض ظهريا قرب منتصف الجسم.

الشكل 2
الشكل 2. صور microinjection (A) غيض إبرة الحقن في التركيز مع خط اليمين المتطرف من قطعة سحبت الشعرية. عن طريق لمس طفيفة غيض من الإبرة إلى أن الحافة ، ينبغي التلميح الإبرة كسر مع الاحتفاظ نقطة حادة. (ب) والغدد التناسلية إدراج إبرة في رأس فقط فوق انحناء القناة الهضمية لحقن الأولى. (C) والغدد التناسلية إدراج إبرة في أسفل أسفل القناة الهضمية للانحناء الحقنة الثانية.

    1. تأكد من التباين ومدينة دبي للإنترنت الإعداد القص مثالية لعرض المناسل خنثى.
    2. تحميل 1،0-2،0 ميكرولتر من خليط حقن إبرة لسحب شعري.
    3. مكان الإبرة في تتلاعب microinjection ، وينبغي وضع مقاييس ضغط خزان النيتروجين إلى الظروف المثالية (10-20 رطلل0،5-1 ثانية).
    4. كسر رأس الإبرة من خلال لمس ذلك قليلا إلى حافة أنبوب شعري سحبت رقيقة توضع على شريحة (الشكل 2A).
      1. إبرة الشريحة الكسارة : أنحف جزء من شعري وسحبت توضع على شريحة زجاجية في قطرة من النفط
    5. بمجرد كسر الإبرة يمكن أن يكون في مكان وضع الخمول أثناء التقاط الدودة الخاص إلى لوحة (P. pacificus يكون نافذة لمدة 5 دقائق قبل الحقن أصل الجافة وأنهم يموتون).
    6. باستخدام لوحة كاملة من الديدان البالغة J4 يونج ، صب زيت برافين يكفي (الثقيلة) لمجرد تغطية جميع الديدان في الحديقة OP50 البكتيرية.
    7. اختيار دودة ووضعه على منصة الحقن.
    8. وضع شريحة زجاجية مع دودة على المجهر ؛ موقف التناسلية الدودة في اتجاه الإبرة والفرج بعيدا عن الإبرة (الشكل 2B ، 2C).
    9. انخفاض الإبرة إلى موضع العرض المجهر.
    10. موقف التناسلية العليا وإبرة في نفس الطائرة التنسيق (الشكل 2B).
    11. كزة الدودة بلطف ومضخة في مزيج الحقن ؛ ooctyes فصل نحو الحافة البعيدة تدل على نجاح الحقن (لتحسين التحوير أو الرنا المزدوج الجديلة التسليم ، يجب على حقن نرى موجة من التوسع في الغدد التناسلية التي لا تزال حتى يكون على مقربة من القاصي غيض).
    12. تغيير موضع إبرة لحقن لانخفاض الغدة التناسلية ، والحقن تكرار ؛ منذ لكن هذا التناسلية تحت الوتر سوف لا ينتشر من البويضات أن ينظر وبالتالي فهي أكثر صعوبة لتحقيق (الشكل 2C).
    13. دودة العادي يبحث يدل على نجاح الحقن بعد الحقن ، ينبغي ألا يكون هناك أي تلف الغدد التناسلية (جاحظ الخروج من الفرج أو انتشرت داخل تجويف الجسم).
    14. مكان إبرة الظهر في وضع الخمول.
    15. الاستعداد لانقاذ دودة.
    16. إضافة إلى انخفاض (0.5 ميكروليتر) من M9 العازلة على لوحة حيث يتم وضع دودة حقن.
    17. باستخدام بعض البكتيريا على OP50 تختار ، المس دودة مع OP50 ، وأنه ينبغي أن عصا. Wه عدم استخدام ماصة الفم.
    18. وضع لوحة على دودة مع المصنفة 50 ميكرولتر من البقع OP50 ، يمكن انقاذ 2-4 الديدان على لوحات من هذا القبيل.
  2. بعد الحقن التخزين والفرز لTransgenesis
    1. مخزن حقن الديدان (ف 0) في 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام ~ لوضع البيض ويكبر F 1.
    2. الديدان الشاشة في اليوم الرابع لتحديد النمط الظاهري (على الشاشة للبحث ، transgenesis للحيوانات المتداول معربا عن المؤسسة العامة للتقاعد ، PRL - 1 علامة المهيمنة).
    3. اختيار واحدة مستقلة F 1 'ق الحيوانات مع النمط الظاهري لوحظ أن لوحة المصنف الجديد وتخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية ، هذه الدرجة تشجع على تشكيل خطوط ثابتة من F 1' س.
    4. واحد من المستقلين F 2 خطوط 1 F. فرد F 2 خطوط متشابهة معدلات انتقال التحوير. غالبا ما نحصل> 15 خطا لكل F 2 1 تحول الحيوان F.
    5. مخزن الأجيال اللاحقة في 25 درجة مئوية.
    6. معدل انتقال بكرات ثابتة لا تزال عادة بعد جيل 4 F ، وبالتالي فمن الضروري في هذا الوقت لتحديد مستوى التعبير عن التحوير الهدف (PPA - EGL - 4P : GFP) عن كل خط على حدة. قد GFP التعبير لم تكن متطابقة مع مدى انتفاذ من النمط الظاهري الأسطوانة المهيمنة.
  3. بعد الحقن التخزين والكشف عن الظواهر رني
    1. مخزن حقن الديدان (ف 0) في 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام لوضع ~ وتنمو F 1.
    2. شاشة F 1 الديدان في اليوم الرابع لتحديد النمط الظاهري (للكشف عن النمط الظاهري رني ضربة قاضية ، والبحث عن الظواهر توغل التي قد تترافق مع فقدان النشاط الجينات المستهدفة ، في حالتنا فقدان النمط الظاهري PPA PRL - 1).
    3. في تجربتنا ، يتم فقدان النمط الظاهري ضربة قاضية غير الدوارة في 97 ٪> من 2 إلى F.

4. ممثل النتائج :

ع "> 1. النتيجة Transgenesis
جلسة حقن ف 0 F 1 مداحل F 2 ٪ المعدلة وراثيا متوسط ​​٪ بعد انتقال F 2
1 60 2 (السطر 1) 0 ٪
(السطر 2) 13 ٪ 		NA
13 ٪ ± 10
2 40 1 * (السطر 3) 0 ٪ NA
3 40 0 0 ٪ NA
4 40 1 (السطر 4) 0 ٪ NA
5 20 0 0 ٪ NA
6 40 1 (السطر 5) 26 ٪ 22 ٪ ± 10
محتوى "> * الأسطوانة الذكورية التي لم يعبر ؛ NA : لا ينطبق

. الجدول 3 نتائج PS312 حقنوا PPA - EGL - 4P : GFP (سال أنا هضمها) ، pRL3 (الدوارة) (PST أنا المهضوم) ، وgDNA PS312 (PstI سالي وهضمها).

الشكل 3
الشكل 3 (أ) wildtype (B ، C) A F 4 pRL3 مستقرة ؛ PPA - EGL - 4P : : خط عرض المعدلة وراثيا GFP تعبير رئيس GFP الخلايا العصبية.

2. نتيجة لتدخل الجيش الملكي النيبالي

الشكل 4
الشكل 4. حقن الحمض النووي الريبي PRL - 1 المسوخ تظهر ضربة قاضية للتنقل كاملة "المتداول" (A) PRL - 1 - الأسطوانة كسب من وظيفة tu92 متحولة. (ب) "ترسيتها" PRL - 1 متحولة الموقف المعرض wildtype طبيعية والحركة. (C) المصبوبة PRL - 1 (القاع) كما يعد بody من PRL - 1 متحولة (أعلى). (د) يعد الجسم من 1 PRL حقن (أسفل) هو أيضا لفترة أطول من PS312 wildtype (أعلى). ولوحظ أيضا أن يعد النمط الظاهري في الجسم ، ورول 5 (sqt - 1) رني ضربة قاضية للجيم ايليجانس N2 (لا تظهر البيانات).

لفة غير لفة
A - 1 PRL الرنا المزدوج الجديلة (200 نانوغرام / ميكروليتر) 13 21
B - 1 PRL الرنا المزدوج الجديلة (1000 نانوغرام / ميكروليتر) 9 16
مراقبة 20 2

الجدول 4 موجز PPA PRL - 1 - حقن الرنا المزدوج الجديلة. (A) [الرنا المزدوج الجديلة] = 200 نانوغرام / ميكروليتر ، (B) [الرنا المزدوج الجديلة] = 1000 نانوغرام / ميكروليتر. P = 0.0019 و 0.041 من خلال اختبار دقيق فيشر ، واثنين من الذيل ، لحقن 200 و 1000 نانوغرام / ميكرولتر ، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم العثور على P. السكان pacificus بالتعاون الوثيق مع مختلف أنواع خنفساء الجعران في جميع أنحاء العالم ، وهو نموذج الخيطية وسيطة بين الذين يعيشون بحرية والديدان الطفيلية. قوة P. pacificus باعتبارها النموذج الحي الناشئة يكمن في دمج خرائط وراثية والمادية التي تشجع على رسم الخرائط الموضعية من المسوخ معزولة عن شاشات الوراثية غير منحازة إلى الأمام (وليس فقط عن الجينات المرشحة تتميز سابقا في ايليجانس جيم) 6،10. ومع ذلك ، C. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ممتنون جدا لسومر RJ وانغ X للحصول على مساعدة microinjection ، فضلا عن التعليقات الثاقبة من المراجعين المجهولين. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح SC2GM089602.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المنتج : كتالوج # : المورد :
DMI3000 حقن المجهر DMI3000 لايكا
Microinjector مناور (محرك مباشر) Narashige مشتركة BC - 3 الكرة Tritech بحوث
إبرة بولير Narashige PC - 10 Tritech بحوث
MicroInjector ™ كل الرقمية المتعددة ضغط النظام Narashige MINJ - D Tritech بحوث
GeneElute ™ الحمض النووي الجينوم الثدييات Miniprep كيت G1N70 سيغما
pJet استنساخ عدة جت K1231 Fermentas
GeneJET البلازميد Miniprep طقم K0502 Fermentas
الحمض النووي النظافة والمكثف ™ D4005 الإنزيم بحوث
BLOCK - IT ™ رني النسخ ® TOPO طقم K3500 K3650 - 01 و 0 -1 Invitrogen
Difco ™ آجار نوبل DF0142 - 15-2 فيشر Scientifi
ميكروسكوب تغطية (1.5 -- 0.16 و 0.19mm سميكة ؛ الحجم : 50 × 45mm) 12-554 - F فيشر العلمية
الزجاج الشعيرات الدموية (خيوط) 615000 نظم AM
زيت البارافين (الثقيلة) O122 - 1 فيشر العلمية
KH 2 PO 4 P386 - 500 فيشر العلمية
غ هبو 2 4 AC20651 - 5000 فيشر العلمية
كلوريد الصوديوم BP3581 فيشر العلمية
MgSO 4 M80 - 500 فيشر العلمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
  3. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  4. Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
  5. Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
  6. Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
  7. Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
  8. Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
  11. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA RNA F1

مقالات ذات صلة