يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

21K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3337

⸱

نوفمبر 16, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology and Centre for Biomedial Genetics, Leiden University Medical Centre

في هذه المقالة

ملخص

يوصف لفحص لقياس كميا تحويل عامل النمو (TGF) - β بفعل الغزو في المواد الهلامية الكولاجين 3 الأبعاد. هذا الاختبار يستفيد من سلسلة MCF10A من خطوط الخلايا التي تمثل مراحل مختلفة من تطور مرض السرطان الثدي. ويمكن اعتماد هذه الطريقة ليتم استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى ، ويمكن استخدامها لتفعيل التحقيق المحتملين الآخرين أو مثبطات الغزو.

الملخص

TGF - β ومعارضة الأدوار في تطور سرطان الثدي عن طريق العمل كمركز الكابتة للورم في المرحلة الأولي ، ولكن تحفيز الغزو والانبثاث في 1،2 مرحلة لاحقة. علاوة على ذلك ، كثيرا ما هى overexpressed TGF - β في سرطان الثدي وتعبيرها يرتبط بسوء التشخيص والانبثاث 3،4. الآليات التي لا TGF - β يدفع الغزو مفهومة جيدا.

TGF - β يتسبب ردوده الخلوية عبر النوع الثاني TGF - β (TβRII) والنوع الأول (TβRI) المستقبلات. عند تشكيل TGF - β المعقدة التي يسببها مغايرة التغصن ، TβRII phosphorylates في TβRI. وTβRI تنشيط يبدأ في الخلايا مما يشير المسار الكنسي Smads بواسطة مستقبلات phosphorylating (R - Smads) ، أي Smad2 وSmad3. تنشيط هذه R - Smads شكل مجمعات مغايرة التغصن مع Smad4 والتي تتراكم في نواة وتنظيم النسخ للجينات الهدف 5. بالإضافة إلى د سابقامسار Smad escribed ، والنتائج في تنشيط مستقبلات تفعيل عدة مسارات أخرى غير Smad يشير ، على سبيل المثال Mitogen المنشط بروتين كيناز (MAPK) 6 مسارات.

لدراسة دور β - TGF في مراحل مختلفة من سرطان الثدي ، والتي قطعناها على أنفسنا استخدام نظام MCF10A الخلية. حولت H - RAS هذا النظام يتألف من خلايا خلدت عفويا MCF10A1 الثدي (M1) الظهارية 7 ، M1 - المشتقة MCF10AneoT (M2) ، والتي تنتج آفات مرحلة ما قبل 8 في الفئران ، وMCF10CA1a M2 المشتقة (M4) ، الذي أنشئ من M2 xenografts وأشكال سرطان الدرجة العالية ، مع القدرة على metastasize إلى 9 في الرئة. هذه السلسلة MCF10A توفر إمكانية لدراسة استجابات الخلايا مع درجات مختلفة من الأورام الخبيثة التي ليست منحازة بواسطة خلفية وراثية مختلفة.

لتحليل TGF - β بفعل الغزو ، ولدت لنا MCF10A كروي مثلي النمط embe الثقافات الخليةdded في مصفوفة 3D الكولاجين في المختبر (الشكل 1). مثل هذه النماذج البشرية تشبه الأورام في الجسم الحي من خلال إنشاء التدرج من الاوكسجين والمواد الغذائية ، مما أدى إلى خلايا نشطة والغازية على الخلايا خارج وهادئة أو حتى نخرية في الداخل من 10 كروي. كما تم عرض كروي المقايسات تستند إلى أفضل تلخيص مقاومة المخدرات من الثقافات أحادي الطبقة 11. يسمح هذا النموذج 3D MCF10 نظام لنا لتحقيق تأثير TGF - β يدل على خصائص الغازية من خلايا الثدي في مراحل مختلفة من السرطان.

البروتوكول

1. إعداد الحل methocel (500 مل)

  1. الأوتوكلاف 6 غرام من methylcellulose في زجاجة 500 مل تحتوي على مغناطيسي.
  2. حل methylcellulose في 250 مل من دون DMEM/F12 محمى المصل (60 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
  3. إضافة 250 مل من DMEM/F12 (RT) تحتوي على 10 ٪ مصل الحصان. مزيج بين عشية وضحاها (4 درجة مئوية).
  4. الحل واضح عن طريق الطرد المركزي (5000g ، 2H ، 4 درجات مئوية).
  5. اتخاذ حل واضح للغاية للزج أنبوب جديد (حوالي 90-95 ٪ من محلول المخزون).
  6. تخزين عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. ثقافة كروي

  1. يعد حل methocel 20 ٪ (10 مل و 40 methocel المتوسطة النمو مل).
  2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ، إضافة التربسين 0.1 ٪ والخلايا احتضان عند 37 درجة مئوية
  3. Resuspend الخلايا المتوسطة في النمو وعدد الخلايا.
  4. إعداد تعليق من الخلايا 000 مل في 10 في methocel 20 ٪.
  5. إضافة تعليق الخلية إلى أسفل ق 96 جولة جيدالوحات uspension (100 ميكروليتر لكل بئر).
  6. اليوم التالي ، والتحقق من تكوين كروي في لوحات تعليق. الأجسام الشبه الكروية سوف يكون جاهزا للاستخدام بعد 1-3 أيام.

3. إعداد الكولاجين

  1. إعداد على الجليد حل الكولاجين مل 8 ، 1 مل 10X PBS ، 1 مل هيدروكسيد الصوديوم 0.1 ن 0.1 و 3 قطرات N حمض الهيدروكلوريك. معرفة ما اذا كان الرقم الهيدروجيني هو 7.4 من خلال الكشف عن بعض الحل على شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني. ضبط درجة الحموضة إذا كان خارج النطاق.
  2. إضافة 50 ميكروليتر من محلول الكولاجين تحييدها في الآبار من 96 لوحة جيدا
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى توطد الكولاجين (90 دقيقة).
  4. إعداد methocel - الكولاجين يجند الحلول على الجليد : ليجند كل جزء 1 ماصة من حل الكولاجين. إضافة 20 مل من الكولاجين في نانوغرام TGF - β. بعد التخفيف مع methocel ونشر أكثر من طبقات مختلفة ، وسيكون التركيز النهائي للβ - TGF تكون 5 نانوغرام / مل ميكس بواسطة vortexing. إضافة 1 جزء من الحل ، methocel. مزيج من قبل vortexing.

4. تضمين كرويقرع

  1. مكان غيض 200 ميكروليتر الذي فقد ما يقرب من 5 ملم من الحافة قطع ، على ماصة 200 ميكروليتر. مص واحدة كروي مع ماصة والاستغناء بعناية المتوسطة في لوحة فارغة. اذا كان يراقب كروي يبقى داخل الحافة. وكروي مرئيا باعتبارها نقطة بيضاء. من دون الافراج عن المكبس ، تمتص 100 ميكروليتر الكولاجين methocel الخليط وصرف كروي في الخليط الكولاجين في الكولاجين 96 المغلفة جيدا. القيام بذلك لمدة 12 الأجسام الشبه الكروية لكل حالة.
  2. اسمحوا الكولاجين ترسيخ ما لا يقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية
  3. إزالة فقاعات الهواء مع طرف 200 ميكروليتر.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من المتوسط ​​1.6 ٪ مع المصل ومثبطات الذائبة في DMSO. لSB - 431542 إضافة 4 ميكرولتر من محلول المخزون (10 ملم) إلى 1 مل من المتوسط. بعد نشرها ، فإن التركيز النهائي للالمانع أن يكون 10 ميكرومتر. سوف TGF - β ومثبطات البقاء على مسار التجربة. التقاط صور للالأجسام الشبه الكروية تحت المجهر باستخدام التكبير 40X.
  5. بعد 48h من التحفيز و / TGF - β أو مثبطات ، والتقاط صور من الأجسام الشبه الكروية تحت المجهر باستخدام التكبير 40X.
  6. قياس مجال غزو الأجسام الشبه الكروية بعد 2 أيام ، وطرح منطقة الانطلاق. قياس مساحة كروي : افتح صورة من كروي في Adobe Photoshop Extended في (الشكل 2A) وحدد أداة التحديد السريع (الشكل 2B). ويتغير مؤشر الماوس إلى دائرة مع "زائد" (+) علامة (الشكل 2C). أثناء سحب المؤشر فوق كروي ، وسوف تعترف فوتوشوب حدود كروي. إذا تم تحديد منطقة خارج كروي ، لا يمكن استبعاد هذه المنطقة من الاختيار بالضغط على مفتاح Alt أو باستخدام أداة التحديد السلبية التي دلت على أ -- التوقيع في شريط الأدوات (). يتغير المؤشر إلى دائرة مع "ناقص" (--) توقع وعن طريق سحب المؤشر فوق المنطقة المحددة بشكل خاطئ ، تتم إزالة هذه المنطقة من الاختيار (الشكل 2D). إذا كان يمكن تحديد اللازمة ، ومناطق متعددة عن طريق الضغط على الشيخIFT الزر. لمزيد من العمل بدقة ، ويمكن تعديل حجم مؤشر الماوس عن طريق تغيير قطر الفرشاة في شريط الأدوات (2E الشكل). عندما يتم تحديد كروي كامل ، يتم حساب مساحة الاختيار عن طريق تحليل MEASURE في شريط القائمة أو عن طريق الضغط على Ctrl + Shift + M (الرقم 2F). سوف تظهر نافذة تسجيل القياس يظهر اسم الملف ومنطقة التحديد في بكسل ، وكذلك البيانات الأخرى (الشكل 2G). إذا تم قياس تحديدات متعددة ، السطر الأول يوضح مجموع جميع المجالات. وترد قياسات التحديدات الفردية في الأسطر أدناه. يمكن تصدير البيانات من جميع القياسات إلى ملف نصي ، وفتح في Excel.

5. ممثل النتائج :

تحولت H - RAS مثالا للمقايسة مع كروي (M1) خلايا الثدي العادية MCF10A1 الظهارية ، MCF10AneoT (M2) وتعطى الخلايا المشتقة من MCF10CA1a M2 (M4) في الشكل رقم 3. أظهرت الخلايا M1 الغزو ضعيفة دونالتحفيز ، ولكن أفضل بكثير غزت على التحفيز التي كتبها β - TGF. في المقابل ، تحولت RAS - M1 - M2 المشتقة غزا بالفعل بكفاءة دون إضافة مؤثرات ، وزادت هذه الحظيرة 4-5 على TGF - β العلاج. أظهرت الخلايا M4 أقوى الغزو ، سواء مع وبدون TGF - β الإضافة.

المقبل ، درسنا ما إذا كنا قد تتداخل مع TGF - β بفعل الغزو في هذا النموذج كروي باستخدام مثبطات الكيميائية. لهذا الغرض استخدمنا SB - 431542 ، والتماثلية ATP ومثبط انتقائي من النشاط كيناز من TβRI ، فضلا عن نوع IB activin مستقبلات (ActRIB) وactivin مستقبلات مثل كيناز (ALK) 7 12. كما هو متوقع ، SB - 431542 - منعت أكثر قدرة TGF β بفعل غزو M1 ، M2 و M4 الخلايا (الشكل رقم 4) ، مشيرا إلى أن غزو TGF - β المحرض هو TβRI - كيناز التابعة. بالإضافة إلى ذلك ، الغزو القاعدية من الأجسام الشبه الكروية كما أعاقت بشدة ، مما يوحي بأن غزو القاعدية أيضا ديمعلقة على β - TGF.

الشكل 1
مخطط تدفق الرقم 1. كروي للمقايسة و3D. الأولى ، هي مطلي الخلايا تحت ظروف غير ملتصقة في لوحات المعلقات على شكل حرف U. aggregrate الخلايا في الأجسام الشبه الكروية multcellular ويمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في مصفوفة الكولاجين. في هذه المصفوفة الكولاجين ، وأنهم قادرون على غزو.

الشكل 2
الشكل 2. الموسع الكمي لمنطقة الأجسام الشبه الكروية باستخدام أدوبي فوتوشوب. (أ) يتم فتح صورة كروي في أدوبي فوتوشوب الاختيار (ب) من Extendend أداة التحديد السريع (C) سحب المؤشر فوق كروي لتحديد مجال إزالة (D) كروي للمنطقة شملت استخدام wongly السلبية أداة التحديد السريع (E) تعديل حجم فرشاة أداة التحديد السريع على نحو أكثر دقة تحديد المنطقة (F) اختيارقياس الأمر لتسجيل (G) مثال لسجل القياس.

الشكل 3
الشكل 3. TGF - β بفعل غزو الأجسام الشبه الكروية من MCF10A1 خلدت عفويا (M1) (A) ، RAS - حولت MCF10AneoT (M2 (B) والمنتشر في MCF10CA1a المشتقة (M4) (C). M1 ، M2 و M4 الأجسام الشبه الكروية جزءا لا يتجزأ من في الكولاجين عولجوا من 5ng/ml β - TGF ل48h كما هو محدد. AC صور الممثل الذي اتخذ في يوم من تضمين وبعد ذلك بيومين. D الغزو كان كميا والفرق النسبي المنطقة يوم 2 تحت الصفر اليوم 0. يتم التعبير عن النتائج كما يعني ± SD مقتبس من 13.

الشكل 4أ
الشكل 4ب
هو تحول دون الرقم 4. غزو كروي بصل وTGF - β صنع بذ SB - 431542. كانت جزءا لا يتجزأ من الأجسام الشبه الكروية M1 ، M2 و M4 في الكولاجين وتعامل مع 5ng/ml β - TGF و / أو 10 ميكرومتر SB - 431542 كما هو محدد. صور الممثلة المأخوذة بعد 2 يوما (A). وكان كميا والفرق النسبي غزو المنطقة في يوم 2 تحت الصفر اليوم 0 (باء). يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SD مقتبس من 13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أنشأنا نموذجا كروي التي MCF10A1 الخلايا الخبيثة ومشتقاته في غزو مصفوفة الكولاجين بطريقة TGF - β - تعتمد. أولا ، يتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية في 96 بئرا لوحات تعليق الجولة القاع في وجود methylcellulose. بالطبع ، يمكن أن تستخدم أيضا على شكل حرف U بولي HEMA لوحات مغلفة لهذا الغرض. مطلوب على الاطلاق Methylcellulose في هذه الخطوة ، لأن الخلايا تموت في غياب methylcellulose. يضاف TGF - β مباشرة إلى مزيج الكولاجين methocel منذ وجدنا أن الخلايا استجابت بشكل جيد لأقل β - TGF عندما أضيفت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أي تعارض في المصالح.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لايواتا كين (OSI الصيدلة ، نيويورك ، الولايات المتحدة) عن الكواشف وفريد ​​ميلر (باربرا آن كارمانوس للسرطان Intitute ، ديترويت ، الولايات المتحدة الأمريكية) لخطوط الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة فهرس العدد تعليق (اختياري)
ميثيل السليلوز سيغما الدريخ M0512
PureCol المتقدمة Biomatrix 5005 - B
مؤشر الرقم الهيدروجيني الشرائط ميرك 9533
96 - جيدا تعليق
لوحات 		غرينر بيو واحد 650 185
96 - TC التصاق جيد
لوحات 		غرينر بيو واحد 655 180

المراجع

  1. Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
  2. Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
  3. Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
  4. Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
  5. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
  6. Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
  7. Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
  8. Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
  9. Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
  10. Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
  11. Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
  12. Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
  13. Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
  14. Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
  15. Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
  16. Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
  17. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
  18. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
  19. Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
  20. Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
  21. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
  22. Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
  23. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TGF Beta MCF10A TGF Beta
كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.