يمكن أن الخلايا العصبية البالغين المولودين في البصلة الشمية تسيطر optogenetically Channelrhodopsin2 باستخدام الحقن ، معربا عن lentiviral في تيار الهجرة منقاري وضوئي المزمنة مع مصغرة زرع الصمام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتتم تعبئة مستمرة interneurons المحلية في البصلة الشمية من القوارض الكبار 1-3. في هذه العملية ، ودعا الخلايا العصبية الكبار ، والخلايا الجذعية العصبية في جدران البطين الوحشي تثير neuroblasts التي تهاجر لعدة مليمترات على طول تيار الهجرة منقاري (RMS) للوصول إلى وتدرج في البصلة الشمية. لدراسة الخطوات المختلفة وأثر التكامل عصبون البالغين المولودين قبل الإيجاد في دوائر حاسة الشم ، فمن الضروري تسمية انتقائي والتلاعب في نشاط هذه الخلايا العصبية معينة من السكان. تطوير التكنولوجيات الحديثة optogenetic يتيح الفرصة لاستخدام الضوء لتنشيط هذا الفوج محددة بدقة من الخلايا العصبية التي تؤثر على الخلايا العصبية المحيطة بها دون 4،5. هنا ، فإننا نقدم سلسلة من الإجراءات لفيروسي أعرب Channelrhodopsin2 (ChR2) - YFP في الفوج مقيدة زمنيا من neuroblasts في RMS قبل ان تصل الى البصلة الشمية وأصبح الكبار المولد شمال شرقurons. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض كيفية الزرع ومعايرة نموذج مصغر لLED المزمنة في تحفيز الخلايا العصبية الحية ، معربا عن ChR2.
البروتوكول
1. التجسيمي الحقن
- الفيروس المستخدمة في هذه التجارب هي التي تعاني من نقص ناقلات النسخ المتماثل lentiviral على أساس فيروس نقص المناعة البشرية للتعبير عن Channelrhodopsine2 - YFP (بروتين فلوري الصفراء) الانصهار بناء يقودها المروج synapsin 6. وقدمت بسخاء البلازميد بواسطة K. Deisseroth 'ق مجموعة أبحاث ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). ويمكن الحصول على Lentiviruses من مصادر تجارية أو المنتجة في المختبر وفقا للبروتوكولات القائمة 7. وكانت ناقلات التتر متوسط في الترتيب 10 وحدات من تنبيغ 10 / مل. يتم تخزين aliquots الفيروسية عند درجة -80 وينبغي إذابة قبل التحميل ماصة. وينبغي تجنب متعددة تجميد / الذوبان دورات. أبدا التعرض الحل الفيروس مباشرة إلى الثلج الجاف.
- إعداد الماصات الزجاج البورسليكات الزجاج باستخدام الشعيرات الدموية على مستوى ماصة مجتذب (سوتر ف-97 ماصة مجتذب). يجب أن يكون الإعداد سحب محسوبة بشكل صحيح لانتاج ماصة طويلة وجامدة. المقبل ، وخفض غيض من ماصة باستخدام مقص للحصول على معلومات سرية من 30-40 ميكرون في القطر. سحبت تخزين ماصات في مربع الغبار الحرة.
- الإعداد الثاني Nanoject microinjector مع تعليمات الشركة المصنعة لتسليم 50 NL. إعداد ماصة بواسطة الحقن مرة أخرى ملء مع الزيوت المعدنية وإدراجه في لmicroinjector المكبس. نعلق على microinjector إطار التجسيمي. فارغة جزئيا من النفط ماصة الزجاج قبل ملء مع الحل فيروس
- مع micropipette ، ونقل 2 ميكروليتر من محلول الفيروس على قطعة معقمة من Parafilm. انخفاض بلطف ماصة الزجاج في قطرة من حل الفيروس وملء مع ماصة 1-2 ميكرولتر. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في ماصة.
- تخدير ماوس مع الكيتامين ملغ / كلغ 100 و 10 ملغ / كلغ زيلازين ، مخففة في ملحي معقم. إزالة الشعر من فروة الرأس للحيوان قارض به كليبرز ، الحلاقة ، مقص ، أو كيميائية depilitory. تطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات بالتناوب الايثانول 70 ٪ وbetadine. ينبغي لجميع الأدوات الجراحية أيضا تعقيمها وتطهيرها ثم مع الايثانول 70 ٪. وضع الحيوان في إطار التجسيمي بقضبان الأذن والأنف بار ، مؤكدا ان رئيس آمنة. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف قرنية العين.
- مع مشرط ، وقطع من فروة الرأس بين العينين ما بين الأذنين. سحب الجلد جانبا لفضح الجمجمة ومرساة الجلد مع زوج من المشابك. تنظيف سطح الجمجمة. وركزت أجهزة التجسيمي مع غيض من الزجاج في bregma ماصة. ثم يتم وضع طرف في موقع الحقن (انتيرو ، مؤخره ، 3.30 ؛ ميديو ، الجانبي ، ± 0.82 ، لكل من نصفي الكرة اليمين واليسار ، على التوالي). الموقف من شريط الأنف لابد من تعديلها وفقا لحساب إحداثيات التجسيمي. في تجربتنا ، يتم ضبط شريط الأنف شيتم محاذاة ntil bregma وموقع الحقن لنفس الارتفاع.
- تحديد موقع الحقن. استخدام تدريبات عالية السرعة الجراحية ، وحفر ثقوب بعناية في الجمجمة. بإبرة حقنة عازمة على طرف مدمن مخدرات ، وإزالة بقايا العظام رقيقة لفضح جافية. تأكد من أن يتم توسيط ثقب في الموضع الصحيح. الحرص على عدم تمزق الأوعية الدموية على سطح الدماغ أثناء الحفر. إذا تمزق الأوعية الدموية ، اضغط برفق على سطح الدماغ مع القطن برعم صغير أو الأنسجة لعدة ثوان حتى توقف تدفق الدم.
- انخفاض ماصة وصفر ارتفاع ظهراني بطني عندما غيض من اللمسات ماصة على سطح الدماغ. ثم ، وانخفاض في العمق الصحيح ظهراني بطني (ظهراني بطني ، و 2.9 من سطح الدماغ) وانتظر 30 ثانية للتوازن الضغط. حقن 4 مرات 50 NL فيروس ليصبح المجموع 200 NL. انتظر 30 ثانية بين كل حقنة.
- دقيقة واحدة بعد حقن الماضي ، سحب الأنبوب ببطءTTE. كرر 1،6-1،8 نقطة لنصف الكرة الأرضية الآخر. إزالة الحيوان من جهاز التجسيمي ، وتنظيف الجرح وغرزة قطع الجلد باستخدام خيوط جراحية. السماح للحيوانات لاسترداد على لوحة ظاهرة الاحتباس قبل ان يعود الى القفص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعطاء الحيوانات من غير الستيرويدية المضادة للالتهابات والمسكنات (مثل كاربروفين 4mg/kg) مباشرة بعد 3 أيام ، وبعد الجراحة.
2. المزمنة لزرع الصمام في تحفيز optogenetic المجراة في البصلة الشمية
- حقن الحيوانات مع جزيئات lentiviral ثنائيا يتم زرعها المقبل مزمنة مع LED زرقاء مصغرة (أوسرام ، الصمام CMS 4.6W الأزرق). لحام دبابيس أدى إلى الإناث موصل كهربائي مصغر بحيث يتم وضع الرابط على الجانب الآخر من الصمام. التحقق من عدم وجود قطع كهربائية قصيرة وتحديد دبوس الإيجابية والسلبية على الموصل. اختبار الصمام من خلال توصيله إلى وحدة تحكم الحالية لLED رغم برقية المناسبة.
- لقياس و / أو تعيين السلطة المطلقة للضوء LED ، تركيب الصمام على micromanipulator وموقف الصمام في اتصال مباشر مع photodetector من السلطة متر من شدة الضوء ذروته عند 470 نانومتر. حفر ثقب صغير بقطر 3 ملم في لوحة PVC مبهمة. يلصق هذا الثقب إلى السلطة متر وبناء منحنى مستوى الطاقة الضوئية مقابل المدخلات الحالية لحساب السلطة في 2 مم.
- لقياس مدى انتشار الضوء من خلال الدماغ ، وقطع كتل من أنسجة المخ طازجة من 300 ، 500 ، 1000 ، 1500 و 2500 ميكرون في سمك 0-4 درجة مئوية ACSF باستخدام 14 vibratome. وضع قطعة من الجمجمة مع حج القحف مماثلة لتلك التي أجريت على الفئران يعيشون تحت الصمام. أولا ، وقياس قوة الضوء دون الأنسجة تركزت على الصمام. ثم ، وضع كل كتلة من الأنسجة بين LED وphotodetector من السلطة متر ، وقياس الطاقة. بناء منحنى سماكة الأنسجة مقابل جزء نسبي انتقال ، محسوبة كنسبةبين السلطة يقاس من خلال الأنسجة ودون الأنسجة.
- تخدير ماوس مع الكيتامين ملغ / كلغ 100 و 10 ملغ / كلغ زيلازين ، مخففة في ملحي معقم. تنظيف وتعقيم الصمام مع الايثانول 70 ٪. إزالة الشعر من فروة الرأس من الحيوان وتطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات بالتناوب الايثانول 70 ٪ وbetadine. ثم ضع الحيوان في إطار التجسيمي. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف قرنية العين. نعلق موصل إلى حائز التجسيمي. وينبغي تعديل الموقف من شريط الأنف حتى سطح الجمجمة فوق البصلة الشمية أفقي تماما وموازية لسطح مصغرة الصمام.
- مع مشرط ، وقطع في فروة الرأس من 3 ملم الأمامي للعيون إلى 3 ملم الخلفي الى الاسماع. سحب الجلد جانبا وتثبيته مع زوج من المشابك. كشط بعيدا الأغشية على سطح الجمجمة باستخدام شفرة حلاقة. نظيفة وجافة الجمجمة. تطبيق غطاء رقيق من مادة لاصقة cyanoacrylate الإعلانية للسماح لاحقةhesion من الاكريليك الأسنان.
- استخدام تدريبات عالية السرعة الجراحية ، وإجراء حج القحف مستطيلة (1 مم و 3 مم الذيلية الوحشي ؛ تركزت على عجزي 5.1 مم ، 0 ملم الوحشي من bregma) على بصيلات الشم. للقيام بذلك ، رقيقة بعناية حتى الجمجمة سوى طبقة رقيقة من بقايا العظام. إزالة بعناية العظام المتبقية مع مساعدة من إبرة حقنة عازمة. وينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب هذه المسألة ثقب الجافية وتمزق في الأوعية الدموية الرئيسية التي تقع بين نصفي الكرة الأرضية والحدود الذيلية من بصيلات الشم. تراكم الدم والتخثر على سطح الدماغ يحول دون تغلغل ضوء الأمثل في الأنسجة. شطف حج القحف وسطح المخ بمحلول ملحي معقم ثم الجافة الجمجمة.
- إرفاق مصغرة ادى الى الموصل. انخفاض مصغرة LED على الجزء العلوي من بصيلات الشم. وينبغي أن المحور الرئيسي للالصمام مصغرة تكون موازية للمحور منقاري - الذيلية من الفأرة ، مع تنظيف وتعقيم المياه المالحة دراي الجمجمة. آمن ثم قاده في الجمجمة مع الطبقة الأولى من الاكريليك (أي الأسمنت المتعدد الكربوكسيل) ، تليها طبقة ثانية من الاكريليك الأسنان. قد تكون هناك حاجة لإضافة اثنين من البراغي الصغيرة لإصلاح الصمام. وينبغي إدراج مسامير على الجمجمة (الخلفي لموقف LED) ومغطاة الأكريليك على حد سواء. بينما لا يزال السائل الاكريليك ، والتراجع والغراء حواف خالية من فروة الرأس على السطح من الاكريليك الأسنان. الحرص على عدم تطبيق أي الاكريليك على الموصل. بعد الاكريليك وصلابة ، وإزالة الحيوان من جهاز التجسيمي والسماح لها استرداد على لوحة ظاهرة الاحتباس قبل ان يعود الى القفص. هي معزولة في قفص الحيوانات الخاصة بهم للتعافي من عملية جراحية لسبعة أيام على الأقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعطاء الحيوانات من غير الستيرويدية المضادة للالتهابات والمسكنات (مثل كاربروفين 4mg/kg) مباشرة بعد 3 أيام ، وبعد الجراحة. وينبغي اختبار المصابيح قبل الزرع وبعد انتهاء التجارب.
- A electri الضوءيتم استخدام كابل لكال الحبل الحيوان إلى وحدة تحكم الحالية لLED بالإضافة إلى مولد النبض (ماجستير - 8) للتحكم في توقيت وشدة الصمام. كابل رقيقة تسمح بحرية كاملة في التنقل. الحرص على احترام قطبية الموصل. وقد عكس القطبية كسر الصمام.
3. ممثل النتائج :
وأعرب عن ChR2 - YFP transduced في الخلايا العصبية ما يقرب من 48 ساعة بعد الحقن ، ويظل مستقرا لعدة أشهر 7. الرقم 1 هو صورة ممثل قسم السهمي من حيوان بارافورمالدهيد الثابتة 15 يوما بعد الحقن. لاحظ العلامات الكثيفة وحجم موقع الحقن في RMS. فقد هاجر عدد كبير من الخلايا الوليد على طول RMS لاستعمار طبقات مختلفة من البصلة الشمية (الشكل 1). وأعرب عن انصهار بروتين في جميع المقصورات الخلايا العصبية ، بما في ذلك سوما ، التشعبات ، والعمود الفقري.
مصغرة LED impla ntation يسمح نطاق واسع وغير مكلفة لتحفيز البصري في منطقة واسعة من الاهتمام. غير المربوطة الحيوان إلى وحدة تحكم الصمام مع كابل كهربائي الضوء الذي يسمح بحرية كاملة في التنقل. التي ميزت نشر الضوء في أنسجة المخ وعتبة ChR2 التنشيط ، نقدر يمكن أن تسبب التنشيط الضوئية على عمق ~ 2mm وتحت سطح الصمام (الشكل 2A). لمراقبة تفعيل الفنية ChR2 - معربا عن الخلايا العصبية في الجسم الحي ، يمكن تحليل التعبير عن C - منظمات المزارعين ، وهو علامة على نشاط الخلايا العصبية ، وبعد التحفيز ضوء المتكررة (الشكل 2B). كبديل ، يمكن أن التسجيلات في المختبر من الخلايا العصبية الكهربية ، بالإضافة إلى التعبير عن ChR2 التحفيز ضوء التنسيق يتم تنفيذ 14. أخيرا ، استخدمت اثنين الفوتون استهدفت فضفاضة التصحيح تسجيلات لدراسة تفعيل الفنية ChR2 - معربا عن الخلايا العصبية القشرية التي تشبه الصمام مصغرة في الجسم الحي 9.
ntent ">
الشكل 1. ChR2 - YFP التعبير من الحقن lentiviral في تيار الهجرة منقاري. مبائر صور الممثل لقطاعات saggital من البصلة الشمية للماوس بعد 15 يوما من الحقن الفيروسة البطيئة في RMS منقاري. لاحظ وجود الخلايا العصبية متناثرة الوليد YFP المهاجرة من نهاية RMS إلى طبقات مختلفة من OB. معظم الخلايا حديثي الولادة (95 ٪) هي الخلايا الحبيبية ، والتي تكمن في سوما الحبيبة طبقة الخلية (GCL) والتشعبات arborize في طبقة ضفيري الخارجي (EPL). مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية الوليد ترحيل ما يصل الى الطبقة الأكثر سطحية من OB ، في طبقة كبيبي (GL). مقياس بار ، 100μm. أقحم ، التكبير العالية من خلية الحبيبية حديثي الولادة ، والتي تبين التعبير غشاء ChR2 - YFP في التشعبات وكذلك في العمود الفقري. مقياس بار ، 20μm.
الشكل 2. رسم تخطيطي لزرع الصمام على الجزء العلوي من البصلة الشمية والخفيف أثارت التعبير ج منظمات المزارعين في ChR2 - YFP معربا عن الخلايا الحبيبية الجديدة.
والرسم التخطيطي لزرع الصمام فوق المصابيح الشمية.
(ب) ، وصور تبين مبائر الممثل المزدوج المسمى ChR2 - YFP + ج + الخلايا الحبيبية منظمات المزارعين ساعة واحدة بعد التحفيز ضوء البصلة الشمية. وكشفت منظمات المزارعين C - التعبير باستخدام أرنب المضادة للمنظمات المزارعين ج الضد الابتدائي (Calbiochem ، 1:5000) و A568 - مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية (Invitrogen ، 1:1000). مقياس بار ، 10μm.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تزايدت في الآونة الأخيرة أدوات Optogenetic سيطرتنا على السكان العصبية انتقائية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الكبار ولدوا في نظام حاسة الشم. هنا نحن تصف كيفية إجراء الحقن التجسيمي لناقلات lentiviral معربا عن ChR2 - YFP في سكانية محددة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية. من خلال رصد دقيق لفترة ما بعد الحقن ، ونحن قادرون على تحليل ومعالجة نشاط أتراب من البالغين المولودين في الخلايا العصبية مع التقدم في العمر متجانسة نسبيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل شركة التأمين على الحياة "نوفاليس ، Taitbout" ، مدرسة قصر العلوم العصبية في باريس (ENP) ، والوكالة الوطنية للبحوث دي لا "ANR - 09 - NEUR - 004" في اطار "نيورون إيرانيت" لل FP7 البرنامج من قبل المفوضية الأوروبية ، "مؤسسة بحوث تصب لا ميديكال" ، ومؤسسة يتين ممثل ومؤسسة باستور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مادة | شركة | كتالوج رقم | |
| الكيتامين | Merial | Imalgène 1000 | |
| زيلازين | باير للرعاية الصحية | Rompum 0.2 ٪ | |
| ماصة بولير | سوتر | P - 97 | |
| زجاج الأوعية الشعرية (3.5 ") | دروموند العلمية | 3 - 000 - 203 - G / X | |
| Nanoject الثاني Microinjector | دروموند العلمية | 3-000-204 | |
| عالية السرعة حفر الجراحية | أدوات العلوم غرامة | 18000-17 | |
| الحفر الصغيرة غيض 0.7mm الصلب قطرها الأزيز | أدوات العلوم غرامة | 19008-07 | |
| LED زرقاء CMS 4.6 W | أوسرام | LBW5SN | |
| موصل كهربائي الإناث (2.54 ملم) | فيشر الكترونيك | BL5.36Z | |
| الحالية للتحكم LED (حد أقصى : 1A) | A1W Electronik | HKO - KL50 - 1000 | |
| مولد النبض | AMPI | الماجستير - 8 | |
| البصرية السلطة متر | ثور مختبرات | PM100 | |
| Cyanoacrylate لاصقة | وكتايت | 454 | |
| الأسمنت المتعدد الكربوكسيل (أول طبقة الاسمنت) | Septodont | Selfast (# 0068Q) | |
| ميتاكريليت الاسمنت (الثانية طبقة الاسمنت) | GC InternationalCorp. | Unifast طراد -- السائل (# 339292) Unifast طراد -- مسحوق (# 339114) | |
| كاربروفين | شركة فايزر | Rimadyl |
المراجع
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
