الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

Stacy L. Gelhaus; A. Clementina Mesaros; Ian A. Blair

doi:10.3791/3399

مقالة منهجية

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

DOI:

10.3791/3399

⸱

نوفمبر 17, 2011

Stacy L. Gelhaus¹^,² , A. Clementina Mesaros¹^,² , Ian A. Blair¹^,²

¹Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , ²Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سيوضح هذا البروتوكول استخراج وتحليل الأحماض الدهنية النشطة بيولوجيا الحرة والأستريفة من الخلايا. يتم قياس الأحماض الدهنية بدقة باستخدام تخفيف النظائر المستقرة ، والكروماتوغرافيا السائلة اللولبية ، والتأين الكيميائي في الغلاف الجوي ، وقياس الطيف الكتلي لمراقبة التفاعل المتعدد (SID-LC-ECAPCI-MRM / MS).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي التمثيل الغذائي للأحماض الدهنية ، مثل حمض الأراكيدونيك (AA) وحمض اللينوليك (LA) ، إلى تكوين الدهون النشطة بيولوجيا المؤكسدة ، بما في ذلك العديد من الأيزومرات الفراغية^1،2. يمكن أن تتشكل هذه المستقلبات من الأحماض الدهنية الحرة أو الأستيرية. العديد من هذه المستقلبات المؤكسدة لها نشاط بيولوجي وقد تورطت في أمراض مختلفة بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والتنكسية العصبية والربو والسرطان^3-7. يمكن تشكيل الدهون النشطة بيولوجيا المؤكسدة إنزيميا أو عن طريق أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تشمل الإنزيمات التي تستقلب الأحماض الدهنية سيكلو أوكسيجيناز (COX) ، وزيمة الليبوكسيجيناز (LO) ، والسيتوكرومات P450 (CYPs) ^1،8. ينتج عن التمثيل الغذائي الأنزيمي تكوين متماثل انتقائي بينما تؤدي أكسدة ROS إلى تكوين الأنسجة التفاعلية للمنتجات.

بينما يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على تحليل AA- وبعض المستقلبات النشطة بيولوجيا المشتقة من LA؛ يمكن تطبيقه بسهولة على مستقلبات الأحماض الدهنية الأخرى. يتم استخراج الدهون النشطة بيولوجيا من محللة الخلية أو الوسائط باستخدام استخراج السائل السائل (L-L). في بداية عملية استخراج l-l ، تتم إضافة معايير داخلية مستقرة للنظائر لحساب الأخطاء أثناء تحضير العينة. يفسر تخفيف النظائر المستقرة (SID) أيضا أي اختلافات ، مثل قمع الأيونات ، قد تواجهها المستقلبات أثناء تحليل قياس الطيف الكتلي (MS)⁹. بعد الاستخراج ، يتم استخدام الاشتقاق باستخدام كاشف التقاط الإلكترون (EC) ، يتم استخدام بروميد خماسي فلوريل بنزيل (PFB) لزيادة حساسية الكشف^10،11. يتم استخدام مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) لزيادة انتقائية تحليل MS. قبل تحليل التصلب العصبي المتعدد ، يتم فصل الدهون باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء للمرحلة اللولبية (HPLC). تم تحسين ظروف HPLC لفصل المتماثلات والأيزومرات الفراغية المختلفة للدهون المراقبة¹². تراقب طريقة LC-MS المحددة هذه البروستاجلاندين (PGs) ، والأيزوبروستانات (isoPs) ، وأحماض hydroxyeicosatetraenoic (HETEs) ، وأحماض الهيدروكسي أوكتاديكادينويك (HODEs) ، وأحماض oxoeecosatetraenoic (oxoETEs) وأحماض oxooctadecadienoic (oxoODEs) ؛ ومع ذلك ، يمكن تحسين معلمات HPLC و MS لتشمل أي مستقلبات من الأحماض الدهنية¹³.

معظم طرق التحليل الحيوي المتاحة حاليا لا تأخذ في الاعتبار القياس الكمي المنفصل للمتماثلات. هذا مهم للغاية عند محاولة استنتاج ما إذا كانت المستقلبات قد تشكلت إنزيميا أم لا بواسطة ROS. بالإضافة إلى ذلك ، قد توفر نسب المتماثلات دليلا على مسار إنزيمي محدد للتكوين. يسمح استخدام SID بالقياس الكمي الدقيق للمستقلبات ويأخذ في الحسبان أي فقدان للعينة أثناء التحضير بالإضافة إلى الاختلافات التي حدثت أثناء التأين. يؤدي استخدام كاشف التقاط الإلكترون PFB إلى زيادة حساسية الكشف بمقدار أمرين من حيث الحجم مقارنة بطرق APCI التقليدية. بشكل عام ، هذه الطريقة ، التأين الكيميائي للضغط الجوي SI-LC-EC-هي واحدة من أكثر الطرق حساسية وانتقائية ودقة للقياس الكمي للدهون النشطة بيولوجيا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخلطات القياسية القياسية والداخلية

قبل استخراج الدهون ، يجب على المرء تحضير مزيج قياسي (SM) ومزيج قياسي داخلي (ISM). بالنسبة إلى SM ، قم بتقسيم الحجم المكافئ البالغ 1 ميكروغرام من كل معيار (إجمالي 25) المدرج في جدول الكاشف أدناه ، باستخدام حقنة معايرة ، في قارورة حجمية سعة 10 مل. جفف المعايير تحت النيتروجين وأعد تكوينها في 10 مل من الأسيتونيتريل (ACN). سيكون التركيز النهائي للمزيج القياسي 100 بيكوغرام / ميكرولتر ، قسمها إلى 1 مل من الحصص وتخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة.
من هذا المزيج القياسي ، يمكن إجراء 6 تخفيفات قياسية لما مجموعه 7 معايير معايرة (1 بيكوغرام / ميكرولتر ، 2 بيكوغرام / ميكرولتر ، 5 بيكوغرام / ميكرولتر ، 10 بيكوغرام / ميكرولتر ، 20 بيكوغرام / ميكرولتر ، 50 بيكوغرام / ميكرولتر ، و 100 بيكوغرام / ميكرولتر). يجب تشغيل هذه المعايير مع كل دفعة من العينات المعدة لتطوير منحنى المعايرة المستخدم في التحليل الكمي.
بالنسبة ل ISM ، قم بتقسيم الحجم المكافئ البالغ 1 ميكروغرام من كل IS (إجمالي 14) المدرج في جدول الكاشف أدناه في قارورة حجمية سعة 10 مل ، باستخدام حقنة معايرة ، وجففها تحت النيتروجين. أعد تكوين ISM في 10 مل من ACN وقسمها إلى 1 مل من الحصص الصغيرة. يجب أن يكون التركيز النهائي ل ISM 100 بيكوغرام / ميكرولتر. هناك ما يكفي من ISM لمعالجة 1000 عينة.
قم بتخزين SM و ISM عند -80 درجة مئوية.

2. مجموعة الوسائط والخلية

لكل لوحة 10 سم من الخلايا الملتصقة (~ 1 × 10⁷) ، اجمع 3 مل من الوسائط في أنبوب طرد مركزي زجاجي سعة 10 مل. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). أضف 1 مل من PBS إلى اللوحة وكشط الخلايا من اللوحة وأنبوب في أنبوب طرد مركزي زجاجي ثان سعة 10 مل. في هذه المرحلة ، قد يتم تخزين الخلايا والوسائط إذا لم يستمر الإجراء في هذا الوقت. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل أو عند -20 درجة مئوية لمدة تقل عن أسبوع واحد.

3. استخراج الدهون من الوسائط

تم العثور على الدهون النشطة بيولوجيا الحرة في وسائط الخلية ويمكن استخراجها بسهولة من خلال إجراء استخراج L-L من خطوة واحدة. إلى الوسائط المجمعة (2.1) ، أضف 10 ميكرولتر من ISM. في هذا الوقت ، يجب تسمية 8 أنابيب طرد مركزي زجاجية إضافية سعة 10 مل # 0-7 لمعايير المعايرة. أضف 3 مل من PBS إلى كل من هذه الأنابيب ثم أضف 10 ميكرولتر من SM المناسب إلى الأنابيب 1-7 (1-7 من 1.1).
اسمح ل ISM بالتوازن في كل معيار معايرة وعينة لمدة 10 دقائق ثم أضف 5 مل من ثنائي إيثيل الأثير. ثم يتم وضع العينات ومعايير المعايرة في شاكر على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الاهتزاز ، يتم طرد جميع معايير المعايرة والعينات عند 1935 × جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور ، انقل المرحلة العليا (العضوية) إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد سعة 10 مل وجففه تحت النيتروجين.

4. استخراج الدهون من محللة الخلايا

قم بتدوير عينات الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الزجاجية عند 1935 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ؛ أضف 2 مل من PBS إلى كل أنبوب ، ودوامة لفترة وجيزة. قم بإزالة 25 ميكرولتر من العينة لقياس كمية البروتين. سيتم استخدام البروتين الكلي لتطبيع محللة الخلية.
بعد ذلك ، انقل نصف خليط المحللة / PBS إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي منفصل سعة 10 مل. أضف 2 مل إضافي من PBS مع 10 ميكرولتر من ISM لكل عينة. اتبع عملية استخراج l-l الموضحة للوسائط في 3.2 و 3.3. سيتم استخدام هذا الاقتباس لقياس الدهون الحرة في الخلايا وتجنب التحلل القلوي للدهون ، مثل البروستاجلاندين. لن يخضع هذا الحصة للخطوتين 4.3 و 4.4 الموضحة أدناه.
الخطوة الأولى من عملية استخراج الدهون الأستيرية l-l إضافة 5 مل من CHCl₃ / MeOH (2: 1) لكل عينة. يتم وضع العينات في شاكر على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة. بعد الاهتزاز ، يتم طرد العينات عند 1935 × جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور ، انقل الطبقة السفلية (العضوية) من استخراج l-l إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد سعة 10 مل وجفف العينة تحت النيتروجين.
يجب تصبن الدهون الأستيرية قبل القياس الكمي. بمجرد أن تجف العينات ، أضف 0.5 مل من 0.4N KOH في 80٪ MeOH إلى كل أنبوب. ثم يتم تحضين العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6 باستخدام حمض حمض الهيدروكلوريك المركز (~ 30 ميكرولتر). أضف 10 ميكرولتر من ISM إلى كل عينة. باقي الإجراء هو نفسه استخراج الدهون من الوسائط ويمكن اتباعه في 3.2 و 3.3.
إذا تم تشغيل عمليات الاستخراج هذه في وقت واحد مع عينات الوسائط ، فيمكن استخدام نفس معايير المعايرة لتطوير منحنى المعايرة ؛ ومع ذلك ، إذا تم تشغيل هذه العينات في وقت آخر ، فيجب أيضا معالجة معايير المعايرة كما هو موضح في 3.1-3.3.

فئة

5. اشتقاق خماسي فلوريل بنزيل بروميد (PFB)

إلى العينات المجففة ومعايير المعايرة ، أضف 100 ميكرولتر من ثنائي كلورو الميثان اللامائي (CH₂Cl₂) متبوعا ب 100 ميكرولتر من 20٪ (حجم / حجم) N ، N-diisopropylethylamine في CH₂Cl₂ اللامائي ، وأخيرا 100 ميكرولتر من 20٪ (حجم / حجم) PFB في CH₂Cl₂ اللامائية.
بعد إضافة كواشف الاشتقاق ، يتم دوامة العينات ، وتحضينها عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وتجفيفها تحت النيتروجين. يمكن تخزين العينات ومعايير المعايرة عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم تحليلها على الفور أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

فئة

6. التوازن المستقر التخفيف اللوني السائل اللولبي التقاط الإلكترون الضغط الجوي تحليل الطيف الكتلي للتأين الكيميائي (SID-LC-ECAPCI-MS)

يتم إعادة تشكيل العينات المجففة ومعايير المعايرة في 100 ميكرولتر من الهكسان / الإيثانول (97: 3). يمكن بعد ذلك نقل العينة بأكملها إلى قارورة HPLC مع إدراج. ضع العينات في جهاز أخذ العينات التلقائي المبرد (4 درجات مئوية) وقم بإنشاء قائمة عينات للتحليل.
بعد ذلك ، قم بإعداد طرق HPLC و MS باستخدام المعلمات الموضحة في الجدول 1 والجدول 2 أدناه. يحتوي الجدول 3 على معلومات مركبة محددة ، بما في ذلك انتقال MRM وطاقة الاصطدام (CE) لكل دهون بالإضافة إلى وقت الاحتفاظ المقدر من تحليل Waters 2695 / Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. يتم تحديد CE عن طريق ضبط كل دهون فردية أثناء تطوير الطريقة.
يتم استخدام عمود Chiralpak AD-H (4.6 × 250 مم ، 5 μ) يتم تسخينه إلى 30 درجة مئوية لفصل الطور العادي. المرحلة المتنقلة الأولية هي 98٪ هكسان و 2٪ ميثانول / إيزوبروبانول (1: 1). بعد فصل HPLC ، يضاف الميثانول بعد العمود (0.75 مل / دقيقة) لتجنب الترسب على إبرة كورونا التي قد تسبب انخفاضا في الحساسية. يتم تعيين MS في وضع الأيونات السالبة باستخدام مصدر APCI. إذا كان المصدر بحاجة إلى التغيير من ESI إلى APCI ، فتأكد من إدخال إبرة كورونا.
العينة الأولى التي يجب تشغيلها هي دائما هكسانة فارغة. سيؤدي ذلك إلى موازنة العمود والكشف أيضا عما إذا كان هناك أي تلوث على العمود قد يتداخل مع معيار المعايرة وتحليل العينة.
يجب أن تكون العينات التالية التي يتم تشغيلها هي العينات القياسية للمعايرة بالترتيب من 0-7 (زيادة تركيز SM). وستستخدم هذه المعايير لإنشاء منحنى معايرة يحتوي على نسبة المساحة القياسية/مساحة مثبت الصور على المحور y والتركيز أو الكتلة القياسية على المحور السيني. من معادلة y = mx + b المشتقة من هذا المخطط ، يمكن استخدام نسبة مساحة العينة / مساحة IS (y) لتحديد كمية العينة (غير المعروفة) أو التركيز (x).
يمكن تطبيع كمية الدهون النشطة بيولوجيا الموجودة في الوسائط إلى الحجم الكلي للوسائط ويمكن تطبيع كمية الدهون الموجودة في محللة الخلية إما إلى العدد الإجمالي للخلايا / الصفيحة أو كمية البروتين / اللوحة الإجمالية. يجب اتخاذ تدابير خلال 4.1 من البروتوكول لضمان عد الخلايا أو تحديد البروتين كميا.

7. النتائج التمثيلية:

تمثل المخططات الكروماتوغرافية في الشكل 1 ملف تعريف الدهون المستهدف. تظهر اللوحة الأولى (الشكل 1 أ) 13 و 9-HODE جنبا إلى جنب مع 13 و 9-oxoODE المقابلة ، المشتقة من حمض اللينوليك. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر أيضا 15-oxoETE ، المستقلب المؤكسد ل 15-HETE في اللوحة الثانية. تظهر اللوحتان السفليتان 20-HETE و 20-HETE-IS، [²H₆] -20-HETE. يوضح الشكل 1 ب الفصل والتحولات الفريدة المحددة للأيزومرات الفراغية HETE الناتجة عن الأكسدة الأنزيمية ل AA أو بواسطة ROS. الشكل 1C هو تمثيل ل PGs و isoPs و LTB₄. بعض المعايير لا تحتوي على IS deuterated متاح تجاريا. لذلك ، يتم استخدام مثبت الصور المشابه في وقت الاستبقاء للقياس الكمي. على سبيل المثال ، يتم استخدام [²H₈] -12 (S) -HETE لتحديد أنواع 11-HETE و 8-HETE بالإضافة إلى 12 (R) -HETE و 12 (S) -HETE.

من الكروماتوغرامات التمثيلية ، من الواضح أن هناك تحولا بسيطا في الاحتفاظ بمثبت الصور الممزق مقارنة بالمعيار غير المسمى. هذا التحول إلى وقت احتفاظ لاحق هو نتيجة لتفاعل الديوتيريوم مع عمود الطور الطبيعي. الديوتيريوم أكثر قطبية من الهيدروجين. لذلك ، هناك تفاعل أقوى مع المرحلة العادية للعمود. إذا كان هذا الفصل يحدث باستخدام عمود طور معكوس ، فسيكون التحول إلى وقت احتفاظ سابق حيث سيكون للجزء الأكثر قطبية تفاعل أضعف مع المرحلة المعكوسة.

figure-protocol-1
الشكل 1. هذا الشكل هو مثال تمثيلي لتحليل الدهون المستهدفة. يوضح الشكل 1 أ إجمالي كروماتوجرامات الأيونات (TIC) للعديد من المستقلبات المؤكسدة LA و AA بما في ذلك 13-oxoODE و 9-oxoODE في اللوحة الأولى ، و 15-oxoETE في اللوحة الثانية ، و 13-HODE و 9-HODE (اللوحات 3 و 5) و 20-HETE (اللوحة 7). تحتوي HODEs و 20-HETE على مثبت صورة مزيف مقابل في اللوحة أدناه (4 ، 6 ، 8). تظهر TICs في الشكل 2 ب الفصل والتحولات الفريدة للأيزومرات الفراغية HETE المشتقة من AA. الشكل 2C هو تمثيل ل PGs و isoPs و LTs. تم تحسين طاقة الاصطدام (CE) ، وتحولات MRM ، ووقت الاستبقاء (RT ، دقيقة) باستخدام Waters 2695 LC مقترنا ب Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra وهي مدرجة في الجدول 3 لكل مركب.

الوقت (دقيقة) ٪ أ ٪ ب 0 98 2 3 98 2 11 96.4 دولار 3.6 [إ] 15 92 8 27 92 8 30 50 50 38 50 50 39 98 2 45 98 2 الجدول 1. ظروف تدرج HPLC لفصل الدهون في المرحلة اللولبية الطبيعية. المذيب A هو 100٪ من الهكسان والمذيب B هو الميثانول / الأيزوبروبانول (1: 1). معلمة قياس الطيف الكتلي اعداد مصدر APCI طريقة أيون سالب طول الطريقة 40 دقيقة عرض مسح MRM 0.002 [م/ز] وقت مسح MRM 0.15 ثانية عرض ذروة MRM 0.70 FWHM عدسة أنبوبية 164 فولت المصدر CID 10 فولت Q2 غاز الاصطدام 1.5 وحدة درجة حرارة المرذاذ 450 درجة مئوية درجة حرارة الشعيرات الدموية 250 درجة مئوية تيار التفريغ 0 ميكروأمبير غمد ضغط الغاز 25 وحدة ضغط اجتياح الأيونات 3 وحدات ضغط الغاز الإضافي 5 وحدات

الجدول 2. المذكورة أعلاه هي معلمات قياس الطيف الكتلي المحسنة لقياس الدهون النشطة بيولوجيا. هذه المعلمات مأخوذة من Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

مركب انتقال CE (eV) RT (دقيقة) 13-أوكسو أود 293.03 → 113.10 21 9.9 9-oxoODE 293.03 → 113.10 21 17.9 15-أوكسو إيتي إي تي 317.05 → 113.18 18 8.1 13 (ص) - هود 295.03 → 195.12 18 12.5 13 (ق) - هود 295.03 → 195.12 18 14.8 [²ح₄] -13 (ق) -هود 299.03 → 198.12 18 14.9 9 (ص) - هود 295.03 → 171.10 18 13.7 9 (ق) - هود 295.03 → 171.10 18 21.2 [²ح₄] -9 (ق) -هود 299.03 → 172.12 18 21.2 20-HETE 319.03 → 289.10 18 12.4 ب [²ح₆]-20-HETE 325.03 → 295.10 18 12.4 ب 5 (ص) -HETE 319.04 → 115.04 16 15.7 دولار 5 (S) -HETE 319.04 → 115.04 16 16.2 ب [²ح₈]-5 (ق) -HETE 327.04 → 116.04 16 16.4 [إك] 12 (ص) -HETE 319.04 → 179.11 14 11.7 [إ] 12 (S) -HETE 319.04 → 179.11 14 12.3 [م] [²ح₈]-12 (ق) -HETE 327.13 → 184.11 14 12.5 15 (ص) -HETE 319.04 → 219.12 13 12.4 ب 15 (ق) -HETE 319.04 → 219.12 13 15.9 [²ح₈] -15 (ق) -HETE 327.03 → 226.12 13 16.1 11 (ص) -HETE 319.04 → 167.11 16 11.1 11 (ق) -HETE 319.04 → 167.11 16 12.5 8 (ص) -HETE 319.04 → 155.09 16 11.7 [إ] 8 (S) -HETE 319.04 → 155.09 16 12.6 LTB4 335.03 → 195.10 18 32.0 [²ح₄] -LTB₄ 339.03 → 197.10 18 32.0 PGE₂ 351.03 → 271.15 18 31.2 [₂ح⁴] -PGE₂ 355.03 → 275.15 18 31.2 التشخيص الوراثي قبل_{الزرع 2} 351.03 → 271.15 25 32.5 [²ح₄] -PGD₂ 355.03 → 275.15 25 32.5 8-iso-PGE ₂ 351.03 → 271.15 18 37.4 [إ] 11β-PGF₂ 353.03 → 193.11 25 27.6 [إك] [²ح₄] -11β-PGF₂ 357.03 → 197.11 25 27.6 [إك] PGF_2α 353.03 → 193.11 25 33.1 [²ح₄] -PGF_2α 357.03 → 197.11 25 33.1 8-iso-PGF_2α 353.03 → 193.11 25 34.4 ب [²ح₄]-8-iso-PGF_2α 357.03 → 197.11 25 34.4 ب الجدول 3. يسرد هذا الجدول المركبات المكتشفة في إجمالي الكروماتوغرامات الأيونية في الشكل 1A-C. يوفر العمود الثاني الانتقال المستخدم ل MRM / MS ، ويسرد العمود الثالث طاقة الاصطدام (CE ، eV) ويسرد العمود الأخير وقت الاستبقاء (RT ، دقيقة). تم تحسين المعلمات باستخدام وحدة فصل Waters 2695 مقترنة ب Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر المعايير والمعايير الداخلية المستخدمة في هذا البروتوكول تمثيلا لطريقة الدهون المستهدفة. تم استخدام وحدة فصل Waters 2695 و Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra لتحليل LC-MS ويمكن العثور على إعدادات المعلمات المثلى في الجدولين 1 و 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم بروتوكول الاستخراج هذا للخلايا الملتصقة ، ولكن يمكن تعديله لأنواع الخلايا الأخرى بالإضافة إلى المصفوفات البيولوجية الأخرى بما في ذلك البول والدم والأنسجة. تتوفر العديد من معايير الدهون تجاريا ويمكن دمجها في هذا التحليل. بالنسبة لإجر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معظم طرق التحليل الحيوي الحالية المتاحة لقياس الدهون النشطة بيولوجيا ليست واسعة النطاق لأنها لا تشمل كروماتوغرافيا الطور الطبيعي اللولبية أو SID. تعتبر المرحلة اللولبية الطبيعية LC أمرا بالغ الأهمية لفصل المتماثلات والقدرة على التمييز بين التمثيل الغذائي بوساطة الإنزيم أو ROS. يضمن استخدام SID أن الخطأ البشري أو المضاعفات التي تنشأ أثناء الاستخراج أو التحليل تؤخذ في الاعتبار أثناء القياس الكمي. هذه المكونات المضافة جنبا إلى جنب مع ECAPCI-MRM تجعل هذه الطريقة الأكثر حساسية وانتقائية متاحة لتحليل الدهون النشطة بيولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5-oxo-6E ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic-6،8،9،11،12،14،15-d7 حمض	كايمان الكيميائية	334250	[^{2< / sup>H_{7< / sub>] -5-ox &# 8211 ؛ TE المعيار الداخلي}}
5S-hydroxy-6E ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic-5،6،8،9،11،12،14،15-d8 حمض	كايمان الكيميائية	334230	[^{2< / sup>H_{8< / sub>] -5 (S< / em>) -HETE المعيار الداخلي}}
12S-hydroxy-5Z ، 8Z ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic-5 ، 6،8،9،11،12،14،15-d8 حمض	كايمان الكيميائية	334570	[^{2< / sup>H_{8< / sub>] -12 (S< / em>) -HETE المعيار الداخلي}}
15S-hydroxy-5Z ، 8Z ، 11Z ، 13E-eicosatetraenoic-5،6،8،9،11،12،14،15-d8 حمض	كايمان الكيميائية	334720	[^{2< / sup>H_{8< / sub>] -15 (S< / em>) -HETE المعيار الداخلي}}
20-hydroxy-5Z ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic-16،16،17،17،18،18-d6 حمض	كايمان الكيميائية	390030	[^{2< / sup>H_{6< / sub>] -20-HETE المعيار الداخلي}}
9S-hydroxy-10E ، 12Z-octadecadienoic-9،10،12،13-d4 حمض	كايمان الكيميائية	338410	[^{2< / sup>H_{4< / sub>]-9 (S< / em>) -HODE المعيار الداخلي}}
13S-hydroxy-9Z ، 11E-octadecadienoic-9،10،12،13-d4 حمض	كايمان الكيميائية	338610	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -13 (S) -HODE المعيار الداخلي}}
9 & alpha ؛ 11 & alpha ؛ 15S-trihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic-17،17،18،18،19،19،20،20،20-d4 حمض	كايمان الكيميائية	316010	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -PGF_{2α < / فرعي> المعيار الداخلي}}}
9 &alpha ؛ ، 11 & alpha ؛ ، 15S-trihydroxy- (8 &# 946 ;)-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic-3،3،4،4-d4 حمض	كايمان الكيميائية	316350	[_{2H_{4< / sub>] -8-iso-PGF2a المعيار الداخلي< / sub>}}
9 &alpha ؛ 11 & # 946 ؛ .، 15S-trihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic-3،3،4،4-d4 حمض	كايمان الكيميائية	10008989	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -11 & # 946 ؛ -PGF_{2< / sub> المعيار الداخلي}}}
9 & ألفا ؛ 15S - ثنائي هيدروكسي -11 - أوكسو - البروستا-5Z ، 13E-dien -1-oic -17 ، 17،18،18،19،19،20،20،20،20-d4 حمض	كايمان الكيميائية	312010	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -PGD_{2< / sub> المعيار الداخلي}}}
9-oxo-11 & alpha ؛ 15S-dihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic-17،17،18،18،19،19،20،20،20،20،20-d4 حمض	كايمان الكيميائية	314010	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -PGE< فرعي>2< / فرعي> المعيار الداخلي}}
5S ، 12R-dihydroxy-6Z ، 8E ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic-6،7،14،15-d4 حمض	كايمان الكيميائية	320110	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -LTB_{4< / sub> المعيار الداخلي}}}
9 & alpha ؛ ، 11،15S-trihydroxy-thromba-5Z ، 13E-dien-1-oic-3،3،4،4-d4 حمض	كايمان الكيميائية	319030	[^{2< / sup>H_{4< / sub>] -TxB_{2< / sub> المعيار الداخلي}}}
5-oxo-6E ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34250	5-ox &# 8211 ؛ TE Standard
12-oxo-5Z ، 8Z ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34580	12-ox &# 8211 ؛ TE Standard
15-oxo-5Z ، 8Z ، 11Z ، 13E-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34730	15-ox &# 8211 ؛ TE Standard
5R-hydroxy-6E ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34225	5 (R< / em>) -HETE Standard
5S-hydroxy-6E ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34230	5 (S< / em>) -HETE Standard
8R-hydroxy-5Z ، 9E ، 11Z ، 14Z-eecosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34350	8 (R< / em>) -HETE Standard
8S-hydroxy-5Z ، 9E ، 11Z ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34360	8 (S< / em>) -HETE Standard
11R-hydroxy-5Z ، 8Z ، 12E ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34505	11 (R< / em>) -HETE Standard
11S-hydroxy-5Z ، 8Z ، 12E ، 14Z-eecosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34510	11 (S< / em>) -HETE Standard
12R-hydroxy-5Z ، 8Z ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34560	12 (R< / em>) -HETE Standard
12S-hydroxy-5Z ، 8Z ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34570	12 (S< / em>) -HETE Standard
15R-hydroxy-5Z ، 8Z ، 11Z ، 13E-e-eicosatetraenoic	حمض كايمان الكيميائية	34710	15 (R< / em>) -HETE Standard
15S-hydroxy-5Z ، 8Z ، 11Z ، 13E-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	34720	15 (S< / em>) -HETE Standard
20-hydroxy-5Z ، 8Z ، 11Z ، 14Z-eecosatetraenoic acid	Cayman Chemical	90030	20-HETE Standard
9R-hydroxy-10E ، 12Z-octadecadienoic acid	كايمان كيميكال	38405	9 (R< / em>) -HODE Standard
9S-hydroxy-10E ، 12Z-octadecadienoic acid	Cayman Chemical	38410	9 (S< / em>) -HODE Standard
13R-hydroxy-9Z ، 11E-octadecadienoic acid	Cayman Chemical	38605	13 (R< / em>) -HODE Standard
13S-hydroxy-9Z ، 11E-octadecadienoic acid	Cayman Chemical	38610	13 (S< / em>) -HODE Standard
9 & alpha ؛ 11 & ، 15S-trihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	16010	PGF _{2 & < / فرعي> المعيار}
9 &alpha ؛ ، 11 & alpha ؛ ، 15S-trihydroxy- (8 & # 946;)-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	16350	8-iso< / em>-PGF2 & alpha ؛ المعيار
9 & alpha ؛ ، 11 & # 946 ؛ ، 15S-trihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	16520	11 & # 946 ؛ -PGF _{2< / sub> المعيار}
9 & alpha ؛ ، 15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	12010	PGD_{2< / sub> المعيار}
9-oxo-11 & alpha ؛ ، 15S-dihydroxy- (8 & # 946;)-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	14350	8-iso< / em>-PGE_{2< / sub> المعيار}
9-oxo-11 & alpha ؛ 15S-dihydroxy-prosta-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	14010	PGE_{2< / sub> المعيار}
5S ، 12R-dihydroxy-6Z ، 8E ، 10E ، 14Z-eicosatetraenoic acid	Cayman Chemical	20110	LTB_{4< / sub> قياسي}
9 & alpha ؛ ، 11،15S-trihydroxythromba-5Z ، 13E-dien-1-oic acid	Cayman Chemical	19030	TxB _{2< / sub>}
الملحي القياسي للفوسفات	المخزن GIBCO ، بواسطة Life Technologies	14190
ثنائي إيثيل الأثير	سيجما ألدريتش	346136
ثنائي كلورو ميثان	أكروس عضوي	61030-1000	لامائي
< م> N ، N < / em > ثنائي الأيزوبروبيل إيثيل أمين	سيجما ألدريتش	387649
خماسي فلوريل بنزيل بروميد	سيجما ألدريتش	101052
حمض الهيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	320331
هيدروكسيد البوتاسيوم	فلوكا	00650
أسيتونيتريل	فيشر العلمي	A996-4
ميثانول	فيشر Scientific	A454-4
الكلوروفورم	فيشر العلمي	366927
الهكسان	فيشر العلمي	H303-4
الأيزوبروبانول	فيشر Scientific	A464-4
مختبرات	الإيثانول	2716
ووتر	فيشر Scientific	W7-4
باستور بيبيتس	فيشر العلمي	13-678-200
10 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاجية	Kimble Chase	73785-10	غطاء لولبي
أغطية برغي	Kimble Chase	73802-13415
Chiralcel ADH Column	Chiral Technologies	19325
قوارير HPLC	Waters	60000751CV
HPLC إدراج	Waters	WAT094171

المحلول ديكون فينول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

البروتوكول

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة