يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) على أساس السماح للصحفيين 1 تقييم كيناز الذاتية والأنشطة الفوسفاتيز في الخلايا الحية. وعادة ما تتألف مثل هذه التحقيقات من المتغيرات من CFP وYFP ، تدخلت تسلسل phosphorylatable مجال الفوسفات وملزم. على الفسفرة ، والتشكل التغييرات التحقيق ، مما يؤدي الى تغيير في المسافة أو الميل بين CFP وYFP ، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق (الشكل 1). وقد نشرت تحقيقات عدة خلال العقد الماضي ، ورصد تحركات التوازن نشاط متعددة وphosphatases ، بما في ذلك مراسلي PKA 2 ، 3 PKB ، PKC 4 ، 5 PKD ، إرك 6 ، 7 JNK ، CDK 18 ، أورورا B 9 و 9 Plk1 . نظرا لتصميم وحدات ، تحقيقات إضافية من المرجح أن تظهر في 10 في المستقبل القريب.
يتأثر تطور خلال دورة الخلية signali الإجهاد11 نانوغرام المسارات. على وجه الخصوص ، وينظم دورة الخلية بشكل مختلف خلال رابط الجأش النمو بالمقارنة مع الخلايا عندما يتماثلون للشفاء من الإجهاد 12. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا من خلال دورة الخلية لذا يتطلب الحذر خاصة. هذا يصبح مشكلة خاصة عندما توظف ratiometric التصوير ، لأن المطلوب صورتين مع اشارة الى ارتفاع نسبة الضوضاء إلى تفسير صحيح للنتائج. Ratiometric الحنق وقد تم التصوير في الغالب من التغيرات في دورة الخلية تعتمد أنشطة كيناز والفوسفاتيز يقتصر على أقسام فرعية للدورة الخلية 8،9،13،14.
هنا ، نحن نناقش طريقة لرصد الحنق على أساس تحقيقات باستخدام التصوير ratiometric طوال دورة الخلية البشرية. أسلوب يعتمد على المعدات التي تتوفر لكثير من الباحثين في علوم الحياة و لا يتطلب معرفة متخصصة المجهري أو معالجة الصور.
البروتوكول
1. تقديم لجنة التحقيق إلى الخلايا
- شارك في transfect الخلايا مع التحقيق الذي تجريه الحنق على أساس المقاومة ومنح البلازميد. اختيار طريقة ترنسفكأيشن تتسم بالكفاءة في نوع الخلايا اهتمامك. U2OS للخلايا ، ومعيار أساليب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج كافية 15.
- حدد الخلايا الموجودة في المضادات الحيوية المناسبة لسبعة أيام على الأقل. هذا يثري كمية من الخلايا معربا عن التحقيق ويحد من كمية الخلايا التي تحتوي على مستويات التعبير السامة ، أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
رصد الحنق في جميع مراحل دورة الخلية تتطلب الاعتبارات التي هي أقل أهمية عند تقييم الاستجابات قصيرة الأجل للمؤثرات الخارجية. الأولى ، يتم بسهولة تقدم دورة الخلية مضطرب من جراء إشارات الإجهاد ، والتي تتطلب أن يتم الاحتفاظ الضيائية إلى الحد الأدنى. ثانيا ، يمكن لجميع الصحفيين تؤثر على العمليات الخلوية التي المعايرة من كاينيسات ، phosphatases أو مجالات التفاعل. ربما الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم ما إذا كانت ظروف تجريبية كافية لقياس طول دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام وذلك لمقارنة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
يتم اعتماد الكتاب من قبل مجلس الأبحاث السويدي ، ومؤسسة البحوث الاستراتيجية السويدية والمجتمع السويدي السرطان ، وسرطان الأطفال المجتمع السويدي ، آك Wibergs الأساس والأساس Jeanssons.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكاشف | كتالوج رقم | شركة | |
| يبوفيتش L - 15 ، أي أحمر الفينول | 21083-027 | GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة | |
| DMEM + Glutamax - I | 31966 | GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة | |
| الجنين مصل البقر (FBS) | SV30160.03 | HyClone | |
| 0.05 ٪ التربسين EDTA | SH30236.01 | HyClone | |
| البنسلين الستربتوميسين | SV30010 | HyClone | |
| DPBS | 14287 | GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة | |
| بوروميسين | P8833 | سيغما الدريخ |
المراجع
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
