مقالة منهجية

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

DOI:

10.3791/3410

⸱

يناير 27, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) على أساس السماح للصحفيين 1 تقييم كيناز الذاتية والأنشطة الفوسفاتيز في الخلايا الحية. وعادة ما تتألف مثل هذه التحقيقات من المتغيرات من CFP وYFP ، تدخلت تسلسل phosphorylatable مجال الفوسفات وملزم. على الفسفرة ، والتشكل التغييرات التحقيق ، مما يؤدي الى تغيير في المسافة أو الميل بين CFP وYFP ، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق (الشكل 1). وقد نشرت تحقيقات عدة خلال العقد الماضي ، ورصد تحركات التوازن نشاط متعددة وphosphatases ، بما في ذلك مراسلي PKA 2 ، 3 PKB ، PKC 4 ، 5 PKD ، إرك 6 ، 7 JNK ، CDK 18 ، أورورا B 9 و 9 Plk1 . نظرا لتصميم وحدات ، تحقيقات إضافية من المرجح أن تظهر في 10 في المستقبل القريب.

يتأثر تطور خلال دورة الخلية signali الإجهاد11 نانوغرام المسارات. على وجه الخصوص ، وينظم دورة الخلية بشكل مختلف خلال رابط الجأش النمو بالمقارنة مع الخلايا عندما يتماثلون للشفاء من الإجهاد 12. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا من خلال دورة الخلية لذا يتطلب الحذر خاصة. هذا يصبح مشكلة خاصة عندما توظف ratiometric التصوير ، لأن المطلوب صورتين مع اشارة الى ارتفاع نسبة الضوضاء إلى تفسير صحيح للنتائج. Ratiometric الحنق وقد تم التصوير في الغالب من التغيرات في دورة الخلية تعتمد أنشطة كيناز والفوسفاتيز يقتصر على أقسام فرعية للدورة الخلية 8،9،13،14.

هنا ، نحن نناقش طريقة لرصد الحنق على أساس تحقيقات باستخدام التصوير ratiometric طوال دورة الخلية البشرية. أسلوب يعتمد على المعدات التي تتوفر لكثير من الباحثين في علوم الحياة و لا يتطلب معرفة متخصصة المجهري أو معالجة الصور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تقديم لجنة التحقيق إلى الخلايا

  1. شارك في transfect الخلايا مع التحقيق الذي تجريه الحنق على أساس المقاومة ومنح البلازميد. اختيار طريقة ترنسفكأيشن تتسم بالكفاءة في نوع الخلايا اهتمامك. U2OS للخلايا ، ومعيار أساليب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج كافية 15.
  2. حدد الخلايا الموجودة في المضادات الحيوية المناسبة لسبعة أيام على الأقل. هذا يثري كمية من الخلايا معربا عن التحقيق ويحد من كمية الخلايا التي تحتوي على مستويات التعبير السامة ، أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخلية.
  3. (اختياري) حدد لاستنساخ مستقرة.
  4. استخدام خلايا ثابتة أو حي ، تحقق من أن كلا CFP وYFP موجودة في جميع الخلايا في النسبة تقريبا.
  5. في حالة احتواء بعض الخلايا فقط أو CFP YFP ، حدث تأشب احتمالا. يمكن أن يحدث إما أثناء إعادة التركيب نمو البكتيريا أو بعد ترنسفكأيشن لجنة التحقيق ، وربما في الحالة الأخيرة تعتمد على نوعية البلازميد. كرر ع البلازميدالجبر ويصبح خطي من قبل البلازميد ترنسفكأيشن إذا استمرت المشكلة.

2. ratiometric رصد الحنق

  1. خلايا البذور على أطباق أسفل الزجاج ، أو زلات لتركيب الغطاء في الغرفة. تأكد من أن أطباق / زلات تغطية توجد 1.5 (170 ميكرون سميكة).
  2. جبل الخلايا في النمو دون الحمراء المتوسطة الفينول على مجهر epifluorescence بمحركات مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ضمان تنظيم درجة الحموضة وسائل الإعلام ، إما عن طريق CO 2 أو باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة مثل يبوويتز - 15.
  3. التركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل. لا تبدو على الخلايا باستخدام ضوء الفلورسنت.
  4. يبدأ من خلال الحصول على صورة 12 بت أو 16 باستخدام الإثارة YFP (YFPex) ومرشحات YFP الانبعاثات (YFPem) ومرآة مناسبة مزدوج اللون. استخدام binning القصوى المتاحة التي لا يزال يسمح القرار المطلوب التحت خلوية. باستخدام binning عالية لتقليل مدة التعرض أو شدة أمر حاسم لتجنب الضيائية.
  5. أناasure أو تقدير شدة الضوضاء الخلفية وتقريبية من خلال قياس أو تقدير متوسط ​​، والحد الأدنى الخام والقيم بكسل كحد أقصى في منطقة خالية من الخلايا. تغيير وقت التعرض ومحايدة مرشحات الكثافة بحيث إشارة المتوسط ​​في الخلية هو ما يقرب من كثافة الخلفية بالإضافة إلى خمسة إلى عشرة أضعاف الفرق بين الحد الأقصى وشدة الخلفية دقيقة.
  6. تحقق من أن الصور ليست على وشك المشبعة. ينبغي للكثافة القصوى في صورة أقل من نصف النطاق الديناميكي (مثل ماكس 2000 في صورة 12 بت) للسماح لشدة الخلافات عندما تدخل خلايا الانقسام.
  7. كرر الخطوة 2،4-2،6 باستخدام الإثارة وعوامل الانبعاثات CFP YFP ومرآة مناسبة مزدوج اللون.
  8. حدد مناطق متعددة مع خلايا transfected ، باستثناء المناطق المستخدمة ل2،4-2،7 نقطة ، وضمان أقصى قدر من كثافة أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا.
  9. بدء تجربة مرور الزمن اكتساب صورتين كل 45 دقائق باستخدام YFPex -- YFPem وCFPex -- YFPem مجموعات التصفية.

3. وتحسين شروط التحقق

  1. فتح الصور التي اكتسبوها ورصد زمن دورة الخلية من الانقسام على الانقسام للخلايا التي تعبر عن لجنة التحقيق transfected.
  2. قارن دورة الخلية قياس الوقت لنشر البيانات لنوع من الخلايا المستخدمة. بدلا من ذلك ، untransfected الفيلم من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة التباين) في كل ساعة للحصول على أوقات إشارة دورة الخلية.
  3. في حالة الوقت من الانقسام الخيطي ليتوافق مع مواعيد مرجعية دورة الخلية ، انتقل إلى الخطوة 4. بدلا من ذلك ، وإعادة الحصول على صور باستخدام الصعب التعرض لمزيد من الوقت أو عدة نقاط ض المستويات وكرر الخطوة 3.
  4. transfected الفيلم في حالة من الانقسام في وقت لالانقسام لا تتوافق مع إشارة توقيت دورة الخلية ، من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة النقيض) كل ساعة تليها صورة واحدة في نهايةالتجربة لتحديد الخلايا transfected.
  5. إذا كانت الخلايا لا تزال تظهر transfected مرات أطول دورة الخلية ، كرر الخطوة 1 ولكن أقل transfect التحقيق أو تحديد لاستنساخ المستقرة التي تحتوي على كميات منخفضة جدا من التحقيق.
  6. إذا كانت الخلايا طبيعية تظهر transfected مرات دورة الخلية في غياب ضوء الفلورسنت ، وكرر الخطوة 2 ولكن أقل من التعرض عن طريق تعديل binning ، مرشحات الكثافة محايدة ، ومدة التعرض ، والوقت بين الصور.

4. تحليل الحنق

  1. يمكن إجراء التحليل من قبل معظم البرامج المخصصة لالمجهري. هنا ونحن تصف كيفية إجراء التحليل باستخدام ImageJ مجانية ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) الاستفادة من البرنامج المساعد زائد نسبة ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . HTML ).
  2. فتح الصور في ImageJ. في حالة الصور في شكل لSTAC متعدد الألوانك (على سبيل المثال Deltavision) ، فصل عن طريق تحويل القنوات الفردية الأولى هم لhyperstack : صورة لhyperstack - hyperstack المكدس والانقسام في وقت لاحق لهم باستخدام مداخن قناة واحدة : صورة - hyperstack - تقليل أبعاد
  3. مضاعفة YFPex -- مكدس YFPem به مع 3 : عملية - الرياضيات ضرب هذه الخطوة اختيارية ، والغرض منه هو زيادة وضوح بصرية للصور عن طريق ضمان أن النسب ليست في نطاق بين 0 و 1.
  4. في YFPex -- مكدس YFPem ، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في المنطقة التي تخلو من الخلايا ، ولكن هذا هو على مقربة من خلية إلى أن يقاس. قد خلايا مختلفة في نفس الصورة تتطلب مختلف المناطق ، لأن كلا من الخلفية وكثافة الإشارة عادة في مركز أقوى من الصورة.
  5. إضافة إلى مدير ROI العائد على الاستثمار : تحليل عائد الاستثمار ، الأدوات ، مدير.
  6. قياس كثافة متوسط ​​العائد على الاستثمار في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- مكدس YFPem : تحليل القياس
  7. تكرار في timepoints متعددة والتحقق من أن شدة الخلفية بالقرب من الخلية التي تهم مماثلة طوال الفيلم.
  8. ضبط القياسات لتشمل الحد الأدنى من شدة : تحليل لضبط قياسات مين وماكس قيمة الرمادي.
  9. رسم المنطقة التي تغطي معظم الاهتمام من خلية وقياس كثافة أدنى في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- YFPem المكدس. تأخذ الفرق بين الحد الأدنى من قياس كثافة وشدة الخلفية من 4.6 وتقسيمها على اثنين. يوفر هذا تقدير لقيمة بدءا قطة.
  10. فتح نسبة زائد. حدد YFPex -- YFPem وCFPex و-- YFPem المكدس. لنسبة الحنق ، حدد CFPex -- YFPem كما المكدس 1 ، لمقلوب نسبة الحنق تصور تحقيقات حيث يقلل كفاءة الحنق على الفسفرة ، حدد YFPex -- YFPem كما مكدس 1.
  11. إدراج قياس كثافة الخلفية والقيم لقطة.
  12. تعيين التحجيم من المكدس نسبة الناتج وتطبيق ش تبدو مناسبةع الجدول (طرفية) لتصور التغييرات النسبة.

5. ممثل النتائج

Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. الشكل 3 يوضح تجربة باستخدام إعدادات الضيائية الحد الأدنى كما هو موضح في القسم 2. يرجى ملاحظة أن هذا هو نتيجة ممثل الأولية والتي يمكن تعديلها أو ظروف التعرض الوقت بين الصور لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء أو قرار مؤقت. يوضح الشكل 3D أن غالبية الخلايا تتكاثر معربا عن التحقيق مع خلية دورة الزمن ما بين 20 و 25 ساعة ، مشيرا الى ان ظروف التصوير ومستويات التعبير عن التحقيق لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. وإن كان هناك ضجيج كبير ، والاتجاه نحو زيادة النشاط في Plk1 G2 وتبلغ ذروتها في 14 الانقسام مرئيا بوضوح (الشكل 3A). معالجة البيانات الخام ، والتي تعني هنا الترشيح المقدمة بوصفها kymograph (الشكل 3B) ، أو في تقدير حجم را مقلوب المتوسط يمكن تيو (الشكل 3C) تعزيز الوضوح.

figure-protocol-1
الشكل 1. مبدأ تحقيق الحنق القائم على رصد أنشطة كيناز والفوسفاتيز. ترتبط اثنين fluorophores ، CFP عادة (الأزرق) وYFP (الأخضر) ، من خلال مجال الفوسفات وملزمة (البرتقال) وتسلسل phosphorylatable (الصفراء). الفسفرة (الحمراء) يتوسط ملزمة إلى المجال الفوسفات وملزمة ، وبالتالي إحداث تغيير متعلق بتكوين جزئي في التحقيق. نتائج تغيير متعلق بتكوين جزئي في الفرق في المسافة أو التوجه fluorophores بين البلدين ، الأمر الذي يؤثر على كفاءة بين الحنق وYFP CFP. ويمكن تصور أن يكون الحنق التي CFP مثيرة ورصد الانبعاثات YFP (الخطوط المنقطة).

figure-protocol-2
الشكل 2. مخطط تخطيطي لإجراء التجارب.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
الشكل 3. Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. وتم تصوير الخلايا U2OS تعبر عن رصد المسبار الحنق المستندة Plk1 النشاط لمدة 60 ساعة 9،14 باستخدام نظام التصوير Deltavision Spectris مجهزة الهدف NA 20X الهواء 0.7 و مصباح الزئبق. وقد تم اختيار ظروف التصوير لسبب الضيائية الحد الأدنى ، كما هو مبين في المادة 2 ، وذلك باستخدام مرشحات binning 4x والكثافة المحايدة التي تمنع 99 ٪ من ضوء واردة. A ، تمثيل الألوان الزائفة مقلوب نسبة - الحنق ، بعد خلية واحدة إلى 4 الانقسامات. B ، kymograph من الخلية هو مبين في وبعد تطبيق مرشح الوسط. C ، القياس الكمي لمقلوب نسبة الحنق من الخلية هو موضح في D A. ، التراكمي دخول الإنقسامية من 50 الحنق التحقيق خلايا الإعراب ، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رصد الحنق في جميع مراحل دورة الخلية تتطلب الاعتبارات التي هي أقل أهمية عند تقييم الاستجابات قصيرة الأجل للمؤثرات الخارجية. الأولى ، يتم بسهولة تقدم دورة الخلية مضطرب من جراء إشارات الإجهاد ، والتي تتطلب أن يتم الاحتفاظ الضيائية إلى الحد الأدنى. ثانيا ، يمكن لجميع الصحفيين تؤثر على العمليات الخلوية التي المعايرة من كاينيسات ، phosphatases أو مجالات التفاعل. ربما الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم ما إذا كانت ظروف تجريبية كافية لقياس طول دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام وذلك لمقارنة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم اعتماد الكتاب من قبل مجلس الأبحاث السويدي ، ومؤسسة البحوث الاستراتيجية السويدية والمجتمع السويدي السرطان ، وسرطان الأطفال المجتمع السويدي ، آك Wibergs الأساس والأساس Jeanssons.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكاشف كتالوج رقم شركة
يبوفيتش L - 15 ، أي أحمر الفينول 21083-027 GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة
DMEM + Glutamax - I 31966 GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة
الجنين مصل البقر (FBS) SV30160.03 HyClone
0.05 ٪ التربسين EDTA SH30236.01 HyClone
البنسلين الستربتوميسين SV30010 HyClone
DPBS 14287 GIBCO ، بواسطة تقنيات الحياة
بوروميسين P8833 سيغما الدريخ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
  2. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
  3. Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
  4. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
  5. Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
  6. Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
  7. Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
  8. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
  9. Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
  10. Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
  11. Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
  12. Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
  14. Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
  15. van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
  16. Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
  17. Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET PLK1 FRET CFP YFP U2 OS ImageJ Ratio Plus

مقالات ذات صلة