نحن وصفا لطريقة توعية لتعريف المنظمين تال للمرحلة الجنينية من بروتين تعبير والتوطين في C. ايليجانس باستخدام شاشة الجينومية رني المستندة إلى والتحوير المتكاملة التي تعبر عن وظيفية، والبروتين الموسومة fluorescently.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد ثبت جيم ايليجانس أن يكون نظام نموذجا قيما للاكتشاف وتوصيف وظيفي للجينات كثيرة ومسارات الجينات 1. أدوات أكثر تطورا وموارد لإجراء دراسات في هذا النظام وتسهيل اكتشاف الجينات مع استمرار الظواهر أكثر دهاء أو الأدوار.
هنا نقدم لبروتوكول المعمم نحن تكييفها لتحديد C. ايليجانس الجينات مع الظواهر تال للمرحلة الجنينية من الاهتمام باستخدام رني 2. يتم تعديل بسهولة هذا الإجراء لفحص النمط الظاهري في الاختيار، سواء من قبل بصريات ضوء أو مضان على مجهر تشريح أو مركب. هذا البروتوكول فحص تستفيد من الأصول المادية للكائن الحي والأدوات الجزيئية وجيم وقد أنتجت الأبحاث ايليجانس المجتمع. كمثال على ذلك، ونحن لشرح استخدام من التحوير المتكاملة التي تعبر عن منتج فلوري في شاشة رني لتحديد الجينات اللازمة لتوطين طبيعية من هذامنتج في مرحلة متأخرة اليرقات والكبار. أولا، استخدمنا المتاحة تجاريا مكتبة رني الجينومية مع كامل طول إدراج [كدنا]. هذه المكتبة يسهل التعرف السريع على تعدد المرشحين من قبل تخفيض رني المرشح منتج الجين. الثانية، ولدت لدينا خبير التحوير المتكاملة التي تعبر عن البروتين لدينا الموسومة fluorecently من اهتمام في خلفية رني حساسة. الثالثة، من خلال تعريض الحيوانات التي تحاك لرني، هذه الشاشة يسمح تحديد المنتجات الجينات التي لها دور حيوي الجنينية التي من شأنها أن تخفي ذلك دورا في مرحلة ما بعد الجنينية في تنظيم بروتين من الفائدة. أخيرا، هذه الشاشة يستخدم مجهر مركب مجهزة لقرار خلية واحدة.
البروتوكول
1. فحص سلالة البناء
تصميم دقيق للسلالة الفرز هو أمر حاسم لنجاح الشاشة ولقد وصفت في مكان آخر 3. بالنسبة لبعض الباحثين، وذلك باستخدام السلالة التي تعبر عن منتج مرئي من التحوير وهناك حاجة للتجربة. العديد من السلالات ايواء الجينات المحورة المتكاملة المتوفرة من الباحثين CGC أو الفردية. إذا كان المطلوب سلالة معدلة وراثيا للعرض على الشاشة ولكن غير متوفرة، يمكن بعد ذلك أنها ولدت باستخدام أسلوب نشر مثل قصف 4، والأشعة فوق البنفسجية / TMP 5، أو موس ينقول الإدراج 6. إدراج نحن من أجل تصور بروتين لدينا من الفائدة، وتسلسل GFP
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة فحص رني المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة وسريعة من المنتجات الجينات المطلوبة لالنمط الظاهري (أو المعدلة وراثيا) طبيعي تال للمرحلة الجنينية. المثال المعروض هو الشاشة عن الجينات المسؤولة عن توطين التحت خلوية من البروتين الموسومة fluorescently. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتحديد الجينات التي تؤثر على الظواهر تال للمرحلة الجنينية الأخرى ذات الاهتمام.
هذا الأسلوب يستفيد من مرشح نهج الجينات باستخدام مكتبة رني........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما يكشف.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ريك بادجيت (اكسمان معهد، جامعة روتجرز بولاية نيو جيرسي) لهدية من [كدنا] DBL-1، والدكتور كريستوفر Rongo (اكسمان معهد، جامعة روتجرز بولاية نيو جيرسي) للحصول على علامة حقن. يقوم مختبر الدكتور بارث غرانت قصف مدفع الجينات لانخفاض نسخة دمج عدد من التركيبة GFP الموسومة-1 DBL. قدمت رينيه غارسيا مختبر المساعدة التقنية أثناء إنشاء texIs100. قدمت رينيه غارسيا، Lints روبين، وHongmin المختبرات تشين نصيحة الإنتاجية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل بدء أموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والغزل مبائر القرص مع الأموال التي تقدمها الإدارة، وكلية الطب TAMHSC....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| NGM آجار | الديدان الخيطية النمو المتوسطة | المكافحة المتكاملة للآفات والعلم، وشركة | ويمكن أن تكون مستعدة بعد بروتوكول أجار NGM 25 |
| M9 متوسطة | 22mm و KH 2 PO 4، 42mM نا 2 هبو 4، 86mM كلوريد الصوديوم، 1 مم MgSO 4 | 26 | |
| أجار أجار | EMD شركة الكيماويات | 1.01614.1000 | 2٪ في الماء لوحات NGM. 4٪ في الماء لمنصات شريحة المجهر (الأوتوكلاف في البداية، والميكروويف لتذوب بعد ذلك). |
| Bacto البيبتون | بيكتون ديكنسون - Difco CP | 211677 | 0.25٪ |
| IPTG | بحث منتجات شركة الدولية | I56000-5.0 | 1 تركيز نهائي ملي |
| كربنيسيلين | بحث منتجات شركة الدولية | C46000-5.0 | 50 ميكروغرام / مل تخفيف العمل |
| LB حساء لينوكس | بيكتون ديكنسون - Difco CP | 240230 | 20 جم / لتر |
| التتراسيكلين | سيغما | 268054 | 12.5 ميكروغرام / مل تخفيف العمل |
| هيبوكلوريت الصوديوم | أي علامة تجارية | 5٪ التبييض المنزلي | استخدام التبييض الطازجة. |
| هيدروكسيد الصوديوم | أي علامة تجارية | CAS 1310-73-2 | 5 N الأوراق المالية |
| M9 المتوسطة | Wormlab وصفة كتاب | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab | 26 |
| levamisol | سيغما | 31742 | 100 ميكرون - 1 ملم تخفيف العمل |
| أزيد الصوديوم | فيشر العلمية | S227 | 10 مليمتر في تخفيف العمل M9 |
| 24 لوحة جيد | غرينر بيو واحد | 662160 | VWR موزع |
| مجهر الشرائح | أي علامة تجارية | 75 × 25 × 1 ملم | |
| زلات مجهر الغطاء | أي علامة تجارية | 22 × 22 مم No.1.5 | استخدام سماكة موصى بها من قبل الشركة المصنعة للمجهر. |
| مجمع المجهر | كارل زايس، وشركة | A1m | استخدام الأهداف والمرشحات لتلبية احتياجات التجربة. |
| وسائل الاعلام مضخة | Manostat Varistaltic مضخة | كيت نموذج # 72-620-000 | استخدام أنابيب والضبط المناسب للجهاز |
المراجع
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
