γ - Herpesviruses (γ - HVS) وضع الثبات مدى الحياة في البلدان المضيفة لهم. إصابة الفئران مع γ - HV68 يوفر لين العريكة وراثيا في الجسم الحي نموذج للتوصيف دورة / γHVs المرضية. يصف هذا بروتوكول الكشف والكميات من γHV68 العدوى الحادة في المراحل التالية ، وكامن العدوى عن طريق المركز ، لتشكيل لوحة المعدية ، والمقايسات qPCR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
γ - Herpesviruses (γ - HVS) جديرة بالملاحظة لقدرتها على إقامة العدوى الكامنة من الخلايا اللمفاوية 1. وقد أعاق مجموعة ضيقة من المضيف الإنسان HVS - γ ، مثل EBV وKSHV ، شديدة الإمراض دراسات مفصلة. فأري γ - هربس 68 (γHV68) سهم واسعة الشبه الجينية والبيولوجية مع الانسان γ - HVS والممرض الطبيعية من القوارض مريد 2. مثل تقييم γHV68 العدوى الفطرية سلالات من الفئران في مراحل مختلفة من العدوى الفيروسية يقدم نموذجا هاما لفهم دورة الحياة الفيروسية والمرضية خلال γ - HVS العدوى.
عند التلقيح داخل الأنف ، ونتائج الإصابة γHV68 في viremia الحادة في الرئة التي يتم حلها في وقت لاحق الى عدوى الكامنة splenocytes والخلايا الأخرى ، والتي يمكن تنشيطها في جميع أنحاء الحياة من 3،4 المضيف. في هذا البروتوكول ، فإننا سوف تصف كيفية استخدام لوحة فحص لتقييمق عيار الفيروس المعدية في الرئة الخليط على monolayers فيرو الخلية في مرحلة مبكرة (5 -- 7 أيام) من الأنف بعد الإصابة (نقطة في البوصة). بينما يتم مسح العدوى الحادة إلى حد كبير 2 -- 3 أسابيع بعد العدوى ، عدوى الكامنة γHV68 يتم تأسيس حوالي 14 نقطة في البوصة وصيانتها لاحقا في الطحال من الفئران. العدوى الكامنة عادة ما يصيب السكان صغيرة جدا من الخلايا في الأنسجة المصابة ، بحيث يبقى الفيروس نائمة ويغلق معظم التعبير الجيني لها. splenocytes خفية المصابة تنشيط الفيروس تلقائيا عند explanting في زراعة الأنسجة ، والتي يمكن تلخيصها من قبل مقايسة المعدية (IC) مركز لتحديد الحمولة الفيروسية الكامنة. لمزيد من تقدير كمية من النسخ في الجينوم الفيروسي الحاد و / أو الأنسجة المصابة خفية ، PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) يستخدم لحساسيتها ودقتها القصوى. فإن التحليلات المشتركة لنتائج الفحص qPCR والبلاك ، و / أو مقايسة IC تكشف ملامح من spatiotemporal الفيروسيةالتكرار والعدوى في الجسم الحي.
البروتوكول
وبروتوكول التالية تصف دراسة الفيروسات والتتر الأحمال الجينوم الفيروسي في دورة العدوى الكامنة وlytic γHV68 في الفئران ، والتي يمكن نظريا أن تستخدم لتقييم العدوى عن طريق الفيروسات الأخرى تقاسم حياة مماثلة لتلك التي γHV68.
1. التضخيم من γHV68
- ذوبان الجليد قارورة المجمدة للγHV68 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إضافة إلى اللقاح الفيروسي NIH3T12 أو 3T3 ثقافة خلية (~ 50 ٪ confluency) في أطباق 10 سم والثقافة الخلايا المصابة عند 37 در....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمت على نطاق واسع γHV68 نموذجا لفهم المرضية 2،4،5 γ - HVS الإنسان. في هذا البروتوكول ، وصفنا ثلاثة أساليب تستخدم بشكل روتيني ، بما في ذلك فحص لوحة عيار الفيروس المعدية ، IC مقايسة لتحميل الكامنة الفيروسية ، وqPCR لتحميل الجينوم الفيروسي ، لتقييم العدوى الحادة والكامنة γHV68 بعد التلقيح داخل الأنف في الفئران.
وقد استخدم على نطاق واسع مقايسة لوحة لتحديد عيار الفيروس في الخلايا المصابة أو الأنسجة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أن نعترف المشورة الفنية والدعم من أحد رن (جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس) وSeungmin هوانج (جامعة واشنطن). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة باكستر والمعاهد الوطنية للصحة منح (R01 R21 CA140964 وAI083841 ليانغ جيم).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم المادة | إعداد الإجراءات | ||
| Methylcellulose المتوسطة تراكب (MC) لفحص اللوحة الفيروسية |
| ||
| إصلاح / وصمة عار لفحص اللوحة المتوسطة | 0.2 ٪ (W / V) الكريستال البنفسجي في الايثانول 20 ٪. | ||
| ACK تحلل العازلة | NH 4 الكلورين 0.15M ، KHCO 3 10MM ، EDTA 0.1mM | ||
| إكمال DMEM | Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة(DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS ؛ Invitrogen) ، 2 مم L - الجلوتامين ، و 1 ٪ البنسلين ستربتومايسين (Gibco - BRL). |
الجدول رقم 1 وسائل الاعلام الخاصة المستخدمة في هذا البروتوكول
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد |
|---|---|---|
| الكيتامين | سيغما الدريخ | K2753 |
| زيلازين | سيغما الدريخ | X1251 |
| Methylcellulose | سيغما الدريخ | M0512 - 250G |
| 2 × MEM | الحياة تكنولوجيز | 11935 |
| خلية مصفاة | Faclon دينار بحريني | 352340 |
| اومني الأنسجة الخالط | OMNI الدولية | TH115 |
| DNeasy الدم والأنسجة كيت | هيئة الاستثمار القطريةالجنرال | 69504 |
| iQTM SYBRH الخضراء Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 نظام PCR الوقت الحقيقي | بيو راد | 184-5072 |
| خلية مكافحة | بيو راد | 145-0001 |
| Sorvall SA - 600 | الحرارية العلمية | 096-124022 |
الجدول 2. الكواشف والمعدات الخاصة
المراجع
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
