مقالة منهجية

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

DOI:

10.3791/3473

⸱

سبتمبر 16, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير تقنية BiFC لاختبار التفاعل بين اثنين من البروتينات في الجسم الحي. ويتم تحقيق هذا عن طريق تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة. ويمكن بعد هذه التركيبات يشترك في تحويلها إلى benthamiana نيكوتيانا عبر التحول بوساطة الأجرعية ، والسماح للتعبير العبور من البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق 1-7. لاختبار والتحقق من تفاعلات البروتين البروتين ، يمكن استخدام BiFC مع اثنين من الخميرة مقايسة (Y2H) المختلطة. وهذا قد كشف عن التفاعلات غير المباشرة التي يمكن التغاضي عنها في Y2H. بوابة التكنولوجيا منصة عالمية تتيح للباحثين المكوك الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) في كتعبير كثيرة وتحليل النظم الفنية و8،9 ممكن. لا يمكن الحفاظ على حد سواء اتجاه القراءة والإطار دون قيد أو باستخدام أنزيمات الربط لجعل التعبير عن استعداد الحيوانات المستنسخة. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن القضاء على جميع الخطوات إعادة التسلسل لضمان تحقيق نتائج متسقة في جميع أنحاء التجارب. قمنا بإنشاء سلسلة من نواقل عبارة BiFC وY2H التي توفر للباحثين متوافق مع سهلة الاستخدام الأدوات اللازمة لأداء كل من المقايسات وBiFC Y2H 10. هنا ، علينا أن نظهر للتخفيف من استخدام نظامنا BiFC لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في N. benthamiana النباتات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير للثقافة الأجرعية

  1. الأجرعية سلالة GV3101 حولت سابقا مع متوافق عبارة BiFC ناقلات pEarleyGate201 - YC وpEarleyGate202 YN ، كل منها يحتوي على مزيج من الحكومة الإسرائيلية بناء.
  2. تلقيح لمدة 5 مل YEB (5G لحم -1 L استخراج ، 1G الخميرة -1 استخراج L ، L -1 5G ببتون ، 5G السكروز -1 L ، 2mm وMgSO 4 ، ودرجة الحموضة 7.2) ثقافة انصهار بروتين يبني BiFC تحولت مع الأجرعية اختيار المضاد الحيوي المناسب. ثقافة تنمو بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
  3. إزالة 1 مل من ثقافة إلى 1.5 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي.
  4. خلايا بيليه في 1000 ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل طاف.
  5. غسل بيليه بإضافة 1 مل من وسائل الاعلام التسلل (5 ز L -1 مد الجلوكوز ، 50 ملي زارة التربية والعلم (سيغما) ، 2 مم نا 3 ص 4 ، 0.1 ملم acetosyringone) 11. Resuspend بيليه بواسطة pipetting ، وخلايا بيليه مرة أخرى في 1000 لمدة 10 دقيقة ز.
  6. كرر الخطوة غسل مرتين أخريين.
  7. Resuspend الكرية في وسائل الاعلام تسلل 0.5 مل.
  8. قياس الامتصاصية في 600 نانومتر ، وضبط النهائي OD 600-1،0 to 1.2.
  9. قسامة مبلغ مساو من تعليق الأجرعية كل بناء جديد في أنبوب مل 1.5 ، دوامة لمدة 10 ثانية. لتسلل واحد ، و 100 ميكرولتر من كل بناء أكثر من كافية.
  10. الخليط الأجرعية جاهز الآن للتسلل.

2. تسلل

  1. وتزرع نباتات N. benthamiana عند درجة 21 ، مع 16 ساعة ضوء و 8 دورات ح الظلام. وينبغي أن تستخدم لخمس محطات لمدة ستة أسابيع من العمر للتسلل.
  2. إزالة النباتات من النمو في غرفة ومكان تحت الضوء الأبيض لمدة 1 ساعة قبل السماح infiltratring الثغور لفتح بالكامل.
  3. وضع خليط الأجرعية معلق في حقنة 1 مل توبركولين زلة طرف دون الإبرة.
  4. مكان غيض من حقنة ضد الجانب السفلي من الأوراق وخفض بلطف المكبس مع دعم مباشر على الجانب العلوي من ورقة مع إصبع واحد. فإن السائل المنتشر من خلال ورقة لأنها تملأ الفراغات الهوائية mesophyllar.
  5. تسمية المنطقة تسلل بالقلم علامة لتحديد المستقبل.
  6. عندما تسلل مع بنيات مختلفة ، للتأكد من إما تغيير القفازات أو تنظيفها مع الايثانول 70 ٪ بين عمليات التسلل. إذا كان ذلك ممكنا ، وترك مسافة واحدة بين الضلع الأوسط عينات مختلفة لمنع النشطاء من التلوث.
  7. مكان النباتات في خزانة النمو في ظل ظروف النمو الطبيعي.

3. رصد إشارة YFP المعاد

  1. استئصال جزء س 5mm 5mm من نسيج نبات داخل المنطقة تسلل
  2. تركيب العينة ، في الماء ، وعلى شريحة ميكروسكوب زجاجية تغطي عينة مع ساترة ودراسة التفاعلات باستخدام المجهر مبائر أو مضان.
  3. وينبغي رصد التعبير كل 24 ساعة من وقت تسلل تصل إلى 5 أيام في وقت لاحق فضلا عن أكثر من التعبير / الاتجار يمكن أن ينتج البروتينات الفلورية الانصهار عرض عدة مواقع مختلفة على مسار الزمن.

4. ممثل النتائج :

ويرد مثال من البروتين البروتين التفاعل اختباره من قبل مقايسة BiFC في الشكل 1. ويعتقد AtTHP1 وAtSAC3A أن تكون مكونات homolog Arabidopsis مجمع الخميرة TREX - 2. يمكن أن تتفاعل مع AtNUP1 nuclearporin وتسهيل تصدير مرنا 10. وكانت مستنسخة AtTHP1 AtSAC3A في pEarlyGate201 - YC حين تم استنساخ AtNUP1 في YN - pEarlyGate202. تحولت لاحقا الى ثوابت GV3101. وإقران يبني الثلاث للمع 3 التوليفات الممكنة (AtTHP1 + AtNUP1 ؛ AtTHP1 + AtSAC3A ؛ AtNUP1 AtSAC3A +) لعمليات التسلل. ولوحظ في إشارة YFP المعاد تحت 48 ساعة بعد LCSM التسلل. وقد لوحظت اشارات في خلايا البشرة ومحلية في محيط النووية أو البلازما النووية ، وهو ما يتسق مع التعريب شبه الخلوية لهذه البروتينات. لم الضوابط السلبية لا تظهر أي إشارة YFP.

figure-protocol-1
الشكل 1. Arabidopsis TREX - 2 مكونات الصادرات مرنا معقدة تتفاعل مع بعضها البعض. ن. تنصهر benthamiana الأوراق ، وشارك في تحويلها مع يبني من الحكومة الإسرائيلية إلى YC - pEarleyGate201 وpEarleyGate202 - YN (كما هو مبين) ، تم تصوير 48-72 ساعة بعد تسلل ، وذلك باستخدام مجهر لايكا TCS confocol SP2. وتظهر الصور كما YFP مبائر المدمجة ومشرق الميدان صور N. البشرة benthamiana خلايا نبات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC مقايسة هو أداة قوية لدراسة التفاعلات بين البروتينات. خلافا للمقايسة Y2H التقليدية ، ليس فقط BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات ، ولكنها توفر أيضا مزيدا من المعلومات من بروتين معقد مثل شبه الخلوية التوطين. أيضا ، فمن الممكن الكشف عن التفاعلات غير مباشرة ما دام يمكن جلبها البروتينات مرشح two قريبة بما فيه الكفاية من قبل شريك ثالث. مثل أي تكنولوجيا ، BiFC لها حدودها. نظرا لمتطلبات الأكسجين الجزيئي لتشكيل fluorophore ، لا يمكن أن تستخدم في BiFC اللاهوائيات تلزم ، وال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السادس نغوين لقراءة المخطوطات والمساعدة العامة المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MES hydrateSigma-AldrichM2933
1 مل حقنة توبركولين ذات طرف انزلاقيBD Biosciences309602

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
  2. Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
  3. Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
  4. Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
  5. Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
  8. Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
  9. Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
  10. Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
  11. Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
  12. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
  13. Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
  14. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationGateway CompatibleAgrobacterium Mediated TransformationNicotiana BenthamianaYeast Two HybridConfocal MicroscopyCo ImmunoprecipitationFluorescent Protein ReconstructionPlant Expression System

مقالات ذات صلة