نحن وصف مجموعة من فحوصات لتحليل مستويات التعبير من histones رابط H1. يتم قياسها كميا مرنا من الجينات H1 الفردية العشوائية النسخ العكسي التمهيدي استنادا تليها في الوقت الحقيقي PCR، في حين يتم تحقيق الكمي من البروتين histones H1 بواسطة تحليل HPLC.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
H1 هيستون رابط بربط الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات والحمض النووي رابط، وتسهيل للطي من لونين إلى أعلى هيكل النظام. H1 أمر أساسي للتنمية الثدييات (1) وينظم محددة التعبير الجيني في الجسم الحي 2-4. بين البروتينات هيستون حفظا للغاية، والأسرة من histones رابط H1 هي مجموعة غير متجانسة أكثر. وهناك أنواع فرعية H1 11 في الثدييات التي تنظم بشكل مختلف خلال التنمية وأنواع مختلفة من الخلايا. هذه الأنواع الفرعية H1 منها 5 جسدية H1S (H1A الإلكترونية)، واستبدال H1 0، 4 جرثومة فرعية الخلية H1 محددة، وH1x 5. وجود أنواع فرعية H1 المتعددة التي تختلف في تقارب الحمض النووي ملزم لونين وقدرة الضغط 6-9 توفر مستوى إضافي من تعديل وظيفة من لونين. وبالتالي، التحليل الكمي التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية، وكلاهما من مرنا والبروتينات، أمر ضروري لفهم أفضل للتنظيم العاليترتيب هيكل لونين وظيفة.
نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات تهدف لتحليل مستويات التعبير عن الأنواع الفرعية H1 الفردية (الشكل 1). ويتم قياس التعبير مرنا من مختلف الجينات البديل H1 من قبل مجموعة من حساسة للغاية وكمية النسخ المقايسات-PCR (qRT-PCR) العكسي، والتي هي أسرع وأكثر دقة وتتطلب عينات أقل بكثير بالمقارنة مع نهج بديل من تحليل لطخة الشمالية. وخلافا لمعظم غيرها من الرسائل الخلوية مرنا، mRNAs للجينات معظم هيستون، بما في ذلك غالبية الجينات H1، تفتقر إلى ذيل polyA طويل، ولكنها تحتوي على بنية الجذعية حلقة في المنطقة 3 'غير مترجمة (UTR) 10. لذلك، يتم إعداد cDNAs من مجموع بواسطة الحمض النووي الريبي النسخ العكسي باستخدام البادئات العشوائية بدلا من بنسبة ضئيلة من DT الاشعال. وتجرى فحوصات PCR الوقت الحقيقي مع الاشعال الخاصة بكل أنواع فرعية H1 (الجدول 1) للحصول على القياس الكمي للغاية من مستويات مرنا من النوع الفرعي H1 الفرديةق. ويتم تحليل التعبير عن الجينات التدبير المنزلي وضوابط للتطبيع.
يتم الحصول على الوفرة النسبية للبروتينات من كل سلالة H1 و histones الأساسية من خلال عكس اللوني المرحلة السائلة عالية الأداء (RP-HPLC) تحليل histones مجموع المستخرج من خلايا الثدييات 11-13. ووصف طريقة HPLC وشروط منح شطف هنا فصل الأمثل من أنواع فرعية H1 الماوس. عن طريق قياس الشخصية HPLC، قمنا بحساب الحصة النسبية من أنواع فرعية H1 الفردية داخل الأسرة H1، وكذلك تحديد من H1 إلى نسبة النيوكليوسومات في الخلايا.
البروتوكول
1. إعداد العينات واستخلاص الحمض النووي الريبي
- قبل استخراج الحمض النووي الريبي، ينبغي أن تزول جميع أسطح العمل والماصات مع الايثانول 70٪ وتعامل مع حل تطهير ريبونوكلياز، مثل زاب ريبونوكلياز. هذه الممارسة يقلل من فرص التلوث والتدهور ريبونوكلياز الحمض النووي الريبي. ارتداء القفازات لجميع الإجراءات.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة الماوس، وتشريح الجهاز من الاهتمام من الماوس الموت الرحيم، وغسل الفوسفات في الأنسجة الجليد الباردة مخزنة المالحة (بى بى سى: 0.13 م كلوريد الصوديوم، و 5 فوسفات ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قدمت مجموعة من فحوصات هنا تمكين تحليل شامل لمستويات التعبير عن الأنواع الفرعية الثدييات هيستون رابط. صمم بشكل صحيح qRT-PCR المقايسات توفير قياسات حساسة للغاية ودقيقة من الرسائل من أي جينات الحمض النووي الريبي هيستون H1 الثدييات. وجزء هام من qRT-PCR المقايسات لرابط جينات سلالة هيستون هو إعداد [كدنا] باستخدام التمهيدي عشوائي استنادا النسخ العكسي. مرنا من الجينات معظم هيستون، بما في ذلك معظم جينات H1، لا تحتوي على فترة طويلة بولي ذيل المقدمة في mRNAs الخلوية الأخرى. وبالتالي فإن الطر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM085261 وسرطان جورجيا التحالف المتميز جائزة الباحث (إلى YF).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| ريبونوكلياز زاب | النظم البيولوجية التطبيقية | AM9780 | |
| Trizol الكاشف | إينفيتروجن | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | إينفيتروجن | 18080-051 | |
| مطلق الايثانول | فيشر العلمية | BP2818-4 | |
| IQ SYBR الأخضر | الحيوي راد | 170-8880 | |
| RNeasy البسيطة كيت | QIAGEN | 74104 | |
| ديوكسي ريبونيوكلياز أنا | سيغما | AMP-D1 | |
| Microseal 96-جيدا لوحة PCR | الحيوي راد | MSP-9605 | |
| 'ب' Microseal الأختام لاصق | الحيوي راد | MSB-1001 | |
| سكر القصب | شركة Agros العضوية | AC40594 | |
| heptahydrate ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4 · 7H 2 O) | فيشر العلمية | BP332 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | الأمريكي Bioanalytical | AB01915 | |
| heptahydrate فوسفات الصوديوم هيدروجين (ناه 2 PO 4 · 7H2O) | فيشر العلمية | BP-330 | |
| HEPES | فيشر العلمية | BP310 | |
| كاملة المانع بروتين صغير كوكتيل قرص | روش العلوم التطبيقية | 11836153001 | |
| EDTA | سيغما | E-5134 | |
| فلوريد Phenylmethanesulfonyl (PMSF) | الأمريكي Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | الأمريكي Bioanalytical | AB01425 | |
| كلوريد البوتاسيوم (بوكل) | فيشر العلمية | BP366 | |
| تريس [aminomethane hydroxymethyl] | الأمريكي Bioanalytical | AB02000 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) | فيشر العلمية | BP214 | |
| حامض الكبريتيك (H2SO4) | VWR | VW3648-3 | |
| هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH) | شركة Agros العضوية | AC42330 | |
| برادفورد البروتين الفحص | الحيوي راد | 500-0001 | |
| الأسيتونيتريل | EMD | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic حامض (TFA) | JTBaker | 9470-01 |
المراجع
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chrom....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
