اختبار ماوس القسري السباحة

ملخص

التحقق من صحة الاختبار القسري السباحة كنهج تجريبية لتقييم فعالية مضادات الاكتئاب المحتملة في القوارض. توضع حيوانات التجارب في خزان للمياه والهروب السلوك المتصل التنقل هو كميا. ووصف إجراءات مشتركة لإصدار الماوس من هذا الاختبار.

الملخص

اختبار السباحة القسري هو اختبار القوارض السلوكية المستخدمة لتقييم العقاقير المضادة للاكتئاب والفعالية المضادة للاكتئاب من المركبات الجديدة ، والتلاعب التجريبية التي تهدف إلى تقديم أو منع الاكتئاب مثل الدول. يتم وضع الفئران في دبابة شفافة لا مفر منه أن يملأ بالماء ويتم قياس سلوكهم الهروب التنقل ذات الصلة. الاختبار القسري تسبح واضح وصريح لإجراء موثوق به ويتطلب الحد الأدنى من المعدات المتخصصة. التنفيذ الناجح لاختبار السباحة القسري يتطلب الالتزام تفاصيل إجرائية معينة والتقليل من التوتر غير المبرر للفئران. في وصف البروتوكول والفيديو المرافقة ، نجد تفسيرا لكيفية إجراء نسخة الماوس هذا الاختبار مع التركيز على المخاطر المحتملة التي قد تكون ضارة لتفسير النتائج وكيفية تجنبها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أن نفسر كيف يتم تقييم السلوكيات التي تتجلى في الاختبار.

البروتوكول

1. المواد والطريقة

1.1. وخزانات المياه

الدبابات اسطوانية (30 سم × ارتفاع 20 سم بأقطار) اللازمة لاختبار الفأرة تسبح القسري (FST) في المختبر لدينا هي التي شيدت من زجاجي شفاف ، وهذه المواد هي قادرة على الصمود في وجه حركة متكررة من الدبابات والحوادث أفضل من الزجاج. مستوى المياه هو 15 سم من القاع ويجب وضع علامة على دبابة للتأكد من أن حجم المياه غير متناسقة عبر الفئران. يجب أن يكون عدد من الدبابات بشكل مثالي على الأقل ضعف هذا العدد كما في عدد من الفئران التي يجري اختبارها في وقت واحد ، بحيث يمكن ملء خزان المياه المجموعة الثانية في حين أن المجموعة الأولى هي قيد الاستخدام. يجب أن يتم تحديد أبعاد الدبابات بطريقة الفئران لن تكون قادرة على لمس قاع الخزان ، إما بأقدامهم أو ذيولها ، وخلال اختبار السباحة. يجب على ارتفاع الخزان تكون مرتفعة بما يكفي لمنع الفئران من الهرب من الدبابة. يرجى ملاحظةالى ان قطر للدبابات وعمق المياه والمعالم الهامة التي يمكن تعديلها لتغيير سلوك الفئران (للاطلاع على تحليل مفصل لهذه القضايا انظر ^1-3).

1.2. ميزان الحرارة

ومقياس الحرارة بالأشعة تحت الحمراء مقاومة للماء هو الأفضل ، لأن القياس السريع لدرجة الحرارة يقلل من كمية الوقت اللازم لإجراء الاختبار. ومع ذلك ، فإن ميزان الحرارة الزئبقي الزجاج أيضا أن تكون كافية لهذه المهمة.

1.3. مؤقت

1.4. جهاز تسجيل الفيديو

علينا استخدام كاميرا الفيديو التي يدعمها ترايبود. منذ هذا الاختبار عادة ما ينطوي الحيوانات المتعددة التي يجري اختبارها في الوقت نفسه ، سوف يكون من الصعب العيش التهديف للغاية وليس من المستحسن. ينبغي للكاميرا الفيديو سجل في قرار عالية بما يكفي لتقديم صورة عالية الجودة التي سيتم استخدامها لاحقا لتسجيل السلوكية. دائما التأكد من وجود ما يكفي من الذاكرة التسجيل في الكاميرا قبل startinز الاختبار. علينا استخدام كاميرا الفيديو التي تسجل رقميا من دون استخدام وسائل الاعلام الميكانيكية (أي شريط فيديو) ، والسماح لنقل التكنولوجيا الرقمية من أشرطة الفيديو. إذا كانت هناك انعكاسات المفرط على الدبابات ، والتي قد تحدث في بيئات المختبرات مع الإضاءة الفلورسنت النفقات العامة ، قد تحتاج إلى استخدام مرشح استقطاب العدسة مع الكاميرا.

1.5. فواصل

في مختبرنا لدينا مجموعتين من المقسمات (35 سم × ارتفاع 22 سم بعرض 22 سم x العمق). هذه هي مستطيلة مع ثلاثة جدران وتستخدم على حد سواء والخلفية وفواصل بين الدبابات لمنع الفئران من رؤية بعضهم البعض أثناء الاختبار وتغيير سلوكها المحتمل. مجموعة واحدة يمكن أن يكون أسود اللون للحيوانات البيضاء والخفيفة ، ومجموعة أخرى يمكن أن تكون خفيفة ملونة للحيوانات داكن اللون لجعل التباين العالي. ينبغي المجرب تأكد من أن السطوح من فواصل لا تعكس بشكل مفرط بحيث يغير صور الكاميرا ، أو تقديم د الرئيسيةifferences بين مستويات الإضاءة.

1.6. الأبيض ضجيج المولدات

هناك حاجة لذلك في بيئات المختبرات التي يمكن سماع الأصوات العالية المفاجئة التي من شأنها أن باغت يحتمل الحيوانات. فإن ضجيج المولدات قناع هذه الأصوات المزعجة على فترات متقطعة. يجب أن يتم تحديد مستوى الصوت من ضجيج المولدات البيضاء ليكون فوق غيرها من الأصوات المحيطة وغير متوقعة. في غرفتنا التجريبية مستوى الضوضاء المحيطة (بدون ضجيج المولدات الأبيض المنشط) هو 60 ديسيبل. مستوى الضوضاء التام مع مولد الضوضاء البيضاء تنشيطها في الموقع حيث يتم وضع الدبابات 70-72 ديسيبل. غير أنه ينبغي الإشارة إلى أنه يتم توفير هذه الأرقام على سبيل المثال فقط ، وينبغي لكل مختبر تحديد مستويات الضوضاء الحق وفقا لبيئتها الفريدة والظروف.

1.7. تجفيف الورق ومصباح الحرارة

قبل أن تعود إلى أقفاص الحيوانات وطنهم ، فمن المهم لتجفمنهم بلطف باستخدام المناشف الورقية ومن المفيد استخدام مصباح الحرارة (درجة حرارة معينة يكون التعرض لا تتجاوز 32 درجة مئوية) لمنع انخفاض حرارة الجسم.

2. الإجراءات السلوكية

1. وينبغي أن التصميم العام التجريبية تعكس موازنة سليمة بين متغيرات محددة لتجربتك. على سبيل المثال ، في تجاربنا ، ونحن نحاول أن تمثل كل مجموعة على قدم المساواة في كل دورة FST (أي ، إذا كان هناك مجموعات العلاج الأربعة ، وسيتم تمثيل كل في كل دورة). أيضا ، يتم تناوب الفئران ، بحيث توضع كل مجموعة من الفئران المعالجة في خزان مختلفة في كل دورة.
2. مكان الكاميرا وفواصل في الموقف. يجب أن تكون الكاميرا قريبة قدر الإمكان من أجل الحصول على أعلى دقة ممكنة من الفئران.
3. وينبغي ملء خزانات مع ماء الصنبور وضعت في درجة حرارة الغرفة (23-25 ​​درجة مئوية) إلى المستوى المحدد ، والتي تم وضع علامة على جدران الخزان. إذا كان لديك منشأة لايوجد ثابت وا الساخنة / الباردةثالثا ، قد تحتاج إلى تحضير الماء الساخن و / أو الجليد لجلب الماء بسرعة إلى درجة الحرارة المناسبة. فحص درجة حرارة الماء مع الحرارة بالأشعة تحت الحمراء. بدلا من ذلك ، إذا كانت درجة حرارة المياه الساخنة والباردة في منشأة ثابتة ، يمكنك الاعتماد على خزان علامتي -- واحدة لمستوى المياه الساخنة والعلامة الثانية لإضافة الماء البارد -- الاقتراب من المباراة النهائية الصحيحة درجة حرارة الماء بسرعة.
4. بدء مولد ضوضاء بيضاء ، إذا المستخدمة ، قبل أن يتم عرض الفئران الى غرفة الاختبار. ينبغي أن يكون مستوى الضوضاء البيضاء إلا ما يكفي لإخفاء الضوضاء الخارجية. تجنب ارتفاع حجم وتأكد من يتم استخدام نفس مستوى الضوضاء البيضاء لجميع الحيوانات.
5. إحضار الحيوانات إلى غرفة الاختبار. إذا كانت الغرفة مستعمرة حيث تتواجد الحيوانات وغرفة مجاورة أو الاختبار هي قريبة جدا من بعضها البعض ، والظروف المحيطة متشابهة والاضطراب أثناء الانتقال من القفص هو الحد الأدنى ، فلا شبه تأقلمالتطوير التنظيمي سوف يكون ضروريا. خلاف ذلك ، ومكان للحيوانات في قاعة الاختبار لفترة تأقلم (عادة ما لا يقل عن ساعة واحدة). إذا كان لفترة تأقلم أمر ضروري ، وتأكد من عدم تأقلم الحيوانات تتأثر الفئران التي يجري اختبارها في نفس الوقت في نفس الغرفة. يرجى أن تدرك أنه يمكن لمست اشارات الشم والموجات فوق الصوتية من جانب حيوانات أخرى وضعت في نفس الغرفة.
6. بدء تسجيل الفيديو قبل وضع الحيوانات في خزانات المياه.
7. عقد الحيوانية ذيله ، وبرفق وببطء مكان في الماء. مرة واحدة في فئران في المياه ، والإفراج عن ببطء الذيل. عادة ، فإن استخدام هذا الإجراء منع رأس الحيوان من كونها مغمورة تحت الماء.
8. وضع الفئران في الصهاريج في الترتيب الذي سيتم تصغير عرقلة تسجيل. هذا الأمر ، بطبيعة الحال ، ينبغي أن قرر بالاشتراك مع مجموعة من موازنة وغيرها من المتطلبات الخاصة بك لتصميم تجريبي.
9. مرة واحدة كل الفئران التي هي في العد التنازلي بدء الدبابات على ساعة توقيت. طول الاختبار المعتاد للفئران ست دقائق في FST.
10. أثناء الاختبار أن تكون على يقين انك على مسافة معقولة من الحيوانات وعدم القيام بأي تحركات أو الضوضاء التي قد تكون لاحظت من قبل الحيوانات. يمكن أن الفئران تطفو بسهولة في الماء ، ومع ذلك ، إذا إما سلالة جديدة من الفئران أو مركب الجديدة التي يجري اختبارها من دون معرفة سابقة من تأثيرها على سلوك السباحة ، والمجرب وينبغي مراقبة الحيوانات عن كثب. على النقيض من الجرذان والفئران لا الغوص عادة خلال FST ، ولكن في حالة الغوص يجب إزالة الماوس من الدبابة. إذا المجرب يترك مجالا ينبغي رصد الفئران عن طريق الفيديو في حال ماوس لا يمكن الحفاظ على السباحة وتطفو على وقف السلوك والاختبار اذا لزم الامر.
11. في نهاية فترة الاختبار ستة دقائق إيقاف التسجيل. في مختبرنا ، وتبين لنا مذكرة أمام الكاميرا التي تحدد الحيوانات في نهاية جداكل تسجيل. عند استخدام هذا النهج سوف الفرد يحرز لاحقا تسجيل لا تعرف هوية من الحيوانات منذ يظهر فقط على الهوية في نهاية جدا للتسجيل. هذا يمنع أي تحديد الهوية وحفظ السجلات المشاكل التي قد تحدث في وقت لاحق تتعلق التسجيلات. بغض النظر عن استراتيجية حفظ السجلات والذي يتم استخدامه ، فإنه ينبغي أن تحدد بوضوح الحيوانات وأيضا منع الفرد التهديف في وقت لاحق من بعد اختبار معرفة مهام المجموعة.
12. إزالة الحيوانات من المياه عن طريق ذيولها في نفس الترتيب الذي وضعها في والجافة بلطف ورقة لهم مكان التجفيف والعودة الى homecage بهم.

3. تحليل السلوك

1. إصدار فأرة FST عادة ، من البداية الى النهاية ، وستة دقائق طويلة. ومع ذلك ، وعموما يتم تحليل الأخيرة فقط اربع دقائق من الاختبار. هذا يرجع إلى حقيقة أن معظم الفئران نشطة جدا في بداية FST ، و p للويمكن أن تحجب الآثار otential للعلاج خلال دقيقتين الأول.
2. نحن في مختبرنا تحميل ملفات الفيديو مباشرة من الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر والقيام التحليل على جهاز الكمبيوتر.
3. أثناء التحليل السلوكي ، ويقاس الزمن الذي يقضيه كل الفئران المتحركة. ومن ثم طرح مجموع المبلغ من وقت التنقل من 240 ثانية من الوقت اختبار وجاء بعد ذلك الوقت الجمود. في حين أنه من الممكن لقياس الوقت الجمود مباشرة ، في مختبرنا وجدنا أنه من الأسهل للكشف وقياس تحركات نشطة بدلا من عدم وجود مثل هذه الحركات.
4. وأهم جانب من جوانب التحليل السلوكي وعادة ما تكون أكبر مصدر للتقلب بين المراقبين في FST هو التحديد الصحيح من الحركات التي تحسب على الحراك الحقيقيين. تعريفنا التنفيذية من أجل التنقل في FST أي حركات أخرى من تلك الضرورية لتوازن الجسم والحفاظ على رأسه فوق الماء ⁴. الفئران تطفو عموما في الماء بسهولة ، إلا أنها لا تزال تظهر الحركات الصغيرة لتحقيق التوازن بين الحفاظ على أجسادهم ورؤوسهم فوق الماء. هذه التصرفات ليست محاولة للهروب ، وينبغي أن لا تكون كما سجل التنقل. أيضا ، بعد نوبة واحدة من التنقل ، حتى ولو متحرك في الأساس ، يمكن أن الفئران لا تزال عائمة في المياه نتيجة للزخم. هذه الحركات وينبغي أيضا ألا يكون سجل والتنقل.
5. في مختبرنا ، ونحن استخدام على الشاشة ساعة توقيت البرنامج (Xnote ساعة التوقيت ، وdnSoft مجموعة بحوث) لقياس الوقت. وتستخدم اثنين ساعات الوقف منفصل على الشاشة. ساعة توقيت first العد التنازلي من 240 ثانية ، وينبه المراقب عند فترة التحليل السلوكي الغايات. ساعة توقيت second يقيس الوقت الذي يقضيه المحمول. بعض البرامج ساعة توقيت لديه القدرة على تعيين مفاتيح لتشغيل وإيقاف وظائف ، بحيث يمكن السيطرة على الشاشة ساعات الوقف بواسطة لوحة المفاتيح. في مختبرنا ، بدلا من لوحة المفاتيح العادية ، ونحن نستخدم جهاز إدخال المعروف باسمأ "gamepad" للسيطرة على ساعات الوقف.
6. عند استخدام جهاز كمبيوتر لتحديد كمية الجمود ، وإذا كان هناك أكثر من واحد والحاضر اختبار الماوس على الشاشة ، انها فكرة جيدة لتغطية غيرها من الحيوانات (يمكنك استخدام برنامج أو نافذة أخرى جسديا تغطية الشاشة مع ورقة) ، بحيث وتحركاتهم لا يصرف المراقب.
7. إذا تم استخدام ساعة توقيت على الشاشة ، تكون معينة لتغطية جميع ولكن عشرى ميلي ثانية من ساعة توقيت. والسبب في ذلك هو منع التحيز في المراقب ، في حين لا يزال يسمح القدرة على تحديد ما إذا كان يشغل مشاهدة أو تشغيل لا. منذ المراقب ، في حين العمياء للتعيينات مجموعة من الحيوانات ، وسوف يكون فكرة عامة عن مستوى التنقل في الفئران ، قد يكون هناك بعض التحيز الذي يحدث إذا سمح لها لمعرفة المبلغ الإجمالي من الوقت المنقضي لهذا الحراك ماوس خاص قبل الانتهاء من دورة التحليل. من خلال تغطية ساعة توقيت ، وقالت انها سوف نعرف فقط ما اذا كانت ساعة الإيقاف أو إيقاف تشغيله عند أي نقطة ولكن فيلل لا يعرف إجمالي الوقت المنقضي وبالتالي لا يمكن أن تتم من قبل أي تحيز.
8. وينبغي إجراء موثوقية بين المراقب اختبار لكل مراقب جديد قبل البدء في جمع بيانات من حيوانات الاختبار. في مختبرنا ، ولكل مراقب جديد الساعات أولا بتسجيله المراقب من ذوي الخبرة. بعد الثقة المراقب مكاسب جديدة للتمييز بين الحركة من الجمود ، فهي علامة ثم مع المراقب من ذوي الخبرة ويراقب لافتا إلى أي أخطاء. بمجرد الانتهاء من هذه المرحلة بنجاح ، فإن المراقب تحليل جديد لمجموعة محددة من أشرطة الفيديو FST أن نبقي في مختبرنا لأغراض التدريب. إلا بعد الحصول على درجة عالية من الارتباط بين المراقب والمراقب مع خبرة لا بداية محقق تحليل أشرطة الفيديو FST في التجارب الفعلية. نحن أرشفة البيانات من هذه التحليلات التدريب لتشكل المعيار الداخلي للمختبر لاستخدامها في المستقبل. وقد لاحظنا الفروق بين السلالات في الطريقة التي يعبرون عن موبيlity (والجمود) السلوكيات ، ومتوسط ​​الوقت الجمود بين الجنسين. عندما يتم اختبار ماوس السلالة ، أو الجنس ، أو معدلة وراثيا نموذج جديد في المختبر من الضروري القيام مرة أخرى هذا النوع من التحليل الموثوقية.

4. ممثل النتائج

هناك اختلافات ملحوظة بين سلالات متميزة وراثيا الماوس الفطرية وoutbred من حيث الأساس الجمود والاستجابة لدواء معين ^5-11. على سبيل المثال ، حددنا الفرق المضادة للاكتئاب مثل الردود على الليثيوم في لوحة سلالات الماوس (الشكل 1) ^5. وتنشر تفاصيل التجريبي لهذه التجربة في وآخرون هل بن. ، 2011 ^5.

الشكل 1. الجمود الوقت (بالثواني) في اختبار السباحة القسري ، وخمس ساعات بعد الحقن IP واحد من المياه المالحة ، 200 ، 300 ، أو 400 ملغ / كلغ في الفطرية المختلفة وأووtbred سلالات الماوس. * : P <0.05 ، ** : P <0.01 ، *** : P <0.001 تدل على فارق كبير مقارنة مع مجموعة المالحة ، في آخر اختبار Dunnett الغرض. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. عدد الحيوانات لكل مجموعة لكل السلالة 6-8 (مستنسخة من الشكل ^5).

ليس كل سلالات الفأر هي مناسبة لFST. بعض السلالات ، مثل السويسرية أسود ، السويسري المعاهد الوطنية للصحة ، وFVB / نيوجيرسي تظهر قليلا أو الجمود تقريبا في ظل ظروف لا تحكم ، ويمثل بالتالي تأثير الكلمة (الشكل 1) ^5. عدم وجود خط الجمود يمنع الكشف عن تأثير فعال مضاد للاكتئاب التلاعب التجريبية. ومن الممكن أيضا ، في حين نادرة جدا ، أن بعض سلالات الفأر قد تتصرف aberrantly والغوص في الصهريج أثناء اختبار على الرغم من أنها يمكن أن تطفو. سلالة واحدة من هذا القبيل هو DBA/1OlaHsd (المراقبة غير منشورة في مختبرنا). سلالات من هذا القبيل ليست مناسبة لFST. بسبب هذا الخطر الغوص ، لكن األصغرل ، عند اختبار سلالة الجديدة التي لم يتم اختباره من قبل في FST ماوس أو إيواء التلاعب الجيني الرواية ، لا بد أن نلاحظ بعناية التجارب الأولية لانقاذ الفئران إذا كانوا الانخراط في السلوكيات الضارة المحتملة.

في التصميم التجريبي وصفها هنا ، والحيوانات متعددة (تصل إلى خمس سنوات) يتم اختبارها في نفس الوقت. في حين أن نستخدم فواصل منع الفئران من رؤية بعضهم البعض أثناء الاختبار ، وضجيج المولدات الأبيض يقمع الالفاظ مسموعة ، لدينا مجموعة المتابعة لا يمنع جميع الإشارات الصوتية أو الشمية من يتم إرسالها. على الرغم من المرجح نظرا لطبيعة الاختبار ، يمكن أن تؤثر هذه السلوكيات من الفئران. وأحد الحلول لهذه المشكلة يكون لاختبار الحيوانات بشكل فردي. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لديها مشاكلها الخاصة. على سبيل المثال ، عادة ، للحيوانات اختبار في كل دورة تأتي من homecage نفسه. يسمح هذا التوزيع العشوائي وموازية من المتغيرات التجريبية. اختبار الفئران الفرديةسيكون لاي يعني إزالة أحد الماوس في وقت واحد من homecage. وهذا يسبب الاجهاد المتكرر واضطراب السلم الاجتماعي في قفص بين الآخرين تركوها وراءهم. قضية أخرى هي منفردة مع اختبار لضيق الوقت. سيكون الاختبار one الماوس في وقت تمتد التجربة إلى عدة ساعات مما أدى إلى الحالة التي يتم اختبارها الفئران في أوقات مختلفة من دورة الإيقاعية. هذا قد خلق التباس الوقت من الآثار اليوم. يجب على الباحثين إبقاء هذه المسائل في الاعتبار أثناء تصميم تجاربهم.

المناقشة

تم تطوير FST (التي تسمى أحيانا Porsolt اختبار السباحة) أولا بالنسبة للفئران وبعد ذلك لتعديل الفئران بنسبة ^12،13 Porsolt وزملاؤه. بالإضافة إلى بروتوكول الموصوفة أعلاه الناجحة في المختبر لدينا ، وقد تم نشر عدد كبير من التعديلات اختبار دقيق (انظر Hascoët وبورين لاستعراض كامل ^1). وهو اختبار شائع يستخدم لتقييم فعالية العقاقير المضادة للاكتئاب وآثار مختلف التلاعب السلوكية والعصبية الحيوية في مجال البحوث الأساسية وقبل السريرية ^3،14-16. وقد وصفت بأنها جعل ...

المواد