مقالة منهجية

النموذج الحيواني CYP2D6: كيف للحث على كسرطان الكبد في الفئران

22K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3644

⸱

فبراير 3, 2012

 ,  , 
1Pharmazentrum Frankfurt / ZAFES, Goethe University Hospital Frankfurt

في هذه المقالة

ملخص

السيتوكروم عدوى من الفئران مع اتش معربا عن مستضد ذاتي الإنسان الرئيسية 2D6 P450 (hCYP2D6) معترف بها من قبل الأمصال من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد من النوع 2 نتائج المناعة الذاتية في شكل مستمر من مرض في الكبد المناعة الذاتية بوساطة تتميز اسعة تليف والتهاب الكبد وجيل من CYP2D6 محددة استجابة مناعية.

الملخص

التهاب الكبد الذاتية هو مرض نادر ولكن يهدد الحياة الذاتية الكبد من 1،2 مرض غير معروف. في محاولات عديدة في الماضي بذلت لتوليد نموذج حيواني التي تعكس خصائص الأمراض التي تصيب البشر 3-5. ومع ذلك، في نماذج مختلفة كان الاستقراء من مرض معقد نوعا ما، وغالبا ما كان التهاب الكبد عابر فقط 3-5. ولذلك، قمنا بتطوير نموذج الفأر واضحة يستخدم مستضد ذاتي الإنسان الرئيسية في التهاب الكبد من النوع 2 المناعة الذاتية (AIH-2)، hCYP2D6 وهي بمثابة الزناد 6. اكتب 1 الكبد والكلى الأجسام المضادة الميكروسومي (LKM-1) الأجسام المضادة الاعتراف hCYP2D6 هي السمة المميزة لAIH-2 7،8. وكان تسليم hCYP2D6 إلى FVB wildtype أو C57BL / 6 الفئران عن طريق التصور اتش (AD-2D6) أن يضمن التسليم المباشر للمستضد التسبب في الكبد. وهكذا، فإن التهاب التي تلت المحلية يولد حقلا خصبا (9) لتطور لاحق من المناعة الذاتية. مكيفombination من الحقن في الوريد وداخل الصفاق من AD-2D6 هو الطريق الأكثر فعالية لإحداث ضرر طويل الأمد المناعة الذاتية للكبد (القسم 1). هنا نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية المناعة الذاتية والتي يسببها مرض الكبد في النموذج CYP2D6 وكيف يمكن تقييم الجوانب المختلفة لتلف الكبد. أولا، يتم تحديد مستويات المصل من علامات تشير إلى تدمير الكبدية، مثل aminotransferases، وكذلك التتر من hCYP2D6 الأجسام المضادة من قبل أخذ العينات retroorbitaly الدم (القسم 2). ثانيا، يتميز hCYP2D6 محددة استجابة الخلايا التائية من خلال جمع الخلايا الليمفاوية من الطحال والكبد. من أجل الحصول على الخلايا اللمفية الكبد نقي، وperfused في الكبد عن طريق برنامج تلفزيوني عن طريق الوريد البابي (قسم 3)، وهضمها في الكولاجين وتنقيته على مدى الانحدار Percoll (القسم 4). ويتم تحليل وتيرة خلايا تي hCYP2D6 محددة بواسطة التحفيز مع hCYP2D6 الببتيدات وتحديد IFNγ الخلايا المنتجة بواسطة التدفق الخلوي (القسم 5). الثالث،يتم تحديد تسلل الخلوية والمناعية بواسطة تليف الكبد من أقسام (القسم 6). مثل نظام تحليل لا بد ان تتم في عدة مرات بعد بدء المرض من أجل إثبات طبيعة المزمنة للنموذج. حجم الاستجابة المناعية التي تتسم وتيرة ونشاط من hCYP2D6 محددة T و / أو الخلايا البائية ودرجة تلف الكبد وتليف يجب أن يتم تقييمها لإجراء تقييم لاحق من العلاجات الممكنة لمنع وتأخير أو إلغاء للautodestructive عملية في الكبد.

البروتوكول

1. حقنة وريدية من 2D6-AD في الجيوب الأنفية العيون

  1. تحت ظروف معقمة، يخفف من مخزون فيروس AD-2D6 حل لتركيز 5 × 10 9 PFU / مل في RPMI والحفاظ على حل فيروس AD-2D6 على الجليد. لقد أثبتت حقن جرعتين من 5 × PFU 8 10 (عن طريق الوريد وداخل الصفاق) أن يؤدي إلى نتائج أدق من التهاب الكبد الذاتية في الفئران من سلالة FVB.
  2. تخدير الفأر مع 4٪ isoflurane في غرفة التخدير. قرصة الساق الخلفية للتأكد من أن الحيوان هو تخدير.
  3. عقد الماوس عن طريق الجزء الخلفي من الرقبة، وتشديد الجلد فضفاض من الرأس مع الابهام والاصبع الوسطى. مثل هذا، العين يبرز قليلا من قوة الجر في الجلد المجاور للعين.
  4. وضع إبرة عموديا في الموق الإنسي (تقاطع الجفون الاقرب الى الانف الحيوان)، وحقن ببطء 100 ميكروليتر حل فيروس AD-2D6. من المهم عدم تطبيق الكثير من الضغوط، إلىتجنب الضرر من السفن والقصبة الهوائية.
  5. سحب الإبرة ببطء لتجنب تسرب وإغلاق الجفون.
  6. عملت حقن جيد إذا كان هذا الحل الفيروس لا يتسرب حوض الأنف والعين تنزلق مرة أخرى إلى موقفه المبدئي.
  7. مباشرة بعد الحقن في الوريد، إجراء حقن داخل الصفاق من معيار ميكرولتر 100 الثانية من الحل فيروس AD-2D6.

بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ الحقن في الوريد عن طريق الوريد الذيل. ومع ذلك، حقن عن طريق تجويف العيون هو أسهل بكثير من أداء ويقلل من الخسائر في حل الفيروس. وقد ثبت أنه يمكن استخدام هذه التقنيات اثنين بالتبادل، وأنه على حد سواء طرق فعالة بنفس القدر 10.

ويتم رصد الفئران المصابة عن الآثار السلبية وعلامات واضحة على المعاناة والألم، مثل فقدان الشهية، وفقدان الوزن، وفقدان الحركة، وعدم العريس، خشونة الشعر، متحدبمظهر، وكذلك لعق، والعض والخدش، أو يهز منطقة معينة (أي من موقع الحقن). على الرغم من أن الفئران تعرض لأضرار جسيمة في الكبد في النموذج CYP2D6، الفئران تبدو سليمة وتظهر أي علامات الألم والمعاناة أو الإجهاد. ومع ذلك، يتم تحديد مؤشرات فشل الكبد الحاد، مثل aminotransferases المصل على أساس منتظم، أو هي جزء من التجارب التي يؤدونها. وينبغي أن مستويات الألانين المصل يو 1000> / لتر تظهر فقط كنتيجة مباشرة للعدوى الفيروس، ولكن ليس بصورة مزمنة. إذا كانت مستويات المصل الألانين هي مزمنة فوق 1000 يو / لتر (الحد حدة) وضحى الفئران.

2. فأر العين النزيف

  1. تخدير الفأر مع 4٪ isoflurane في غرفة التخدير. قرصة الساق الخلفية للتأكد من أن الحيوان هو تخدير.
  2. عقد الماوس عن طريق الجزء الخلفي من الرقبة، وتشديد الجلد فضفاض من الرأس مع الابهام والاصبع الوسطى. مثل هذا، العين يبرز قليلا من قبلوالجر على الجلد بالقرب من العين.
  3. وضع غيض من الأنابيب الشعرية في الزاوية السفلى أو الداخلية للعين، ولكن بلطف انزلق بحزم الى جانب مقلة العين إلى عين جيب وريدي. تمزق الشعيرات الدموية الوريدية، ونزف الناتجة يملأ تجويف المدارية.
  4. سحب قليلا من الأنابيب الشعرية للافراج عن معلومات سرية بحيث يتم رسمها الدم المتراكم في أنبوب.
  5. عندما يتم جمع ما يكفي من الدم، يتم سحب الأنبوب واغلق الجفون. النزيف يتوقف على انسحاب من الأنبوب وإعادة ضغط العين الطبيعي على مجمع وريدي.
  6. يتم نقل الدم في الأنابيب الشعرية إلى أنبوب Microtainer وحضنت لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  7. يتم طرد الأنبوب Microtainer في 7500 XG لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  8. وطاف يتوافق مع المصل التي يتم نقلها إلى أنبوب جديد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  9. ويمكن استخدام مصل الدم لتحديد عيار الأضداد بواسطة ELISA. إنديكاالاختصاصات من تلف الكبد مثل مستويات المصل من أنزيمات الكبد الألانين ألانين (ALT / GPT) والألانين اسبارتاتي (AST / GOT) يمكن تقييمها باستخدام شرائط الاختبار وفقا من تشخيص روش (مانهايم، ألمانيا)، وReflotron زائد محلل ( روش تشخيص، مانهايم، ألمانيا).

بدلا من ذلك، يمكن أن يتم اخذ عينات من الدم عن طريق الوريد أو عن طريق الوريد ذيل الصدغي السطحي 11.

3. الماوس الكبد نضح

ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتجنب حدوث تلوث من الخلايا الليمفاوية الكبد المعزولة بواسطة الخلايا الليمفاوية في الدم

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق جرعات قاتلة من CO 2 تليها التفكك عنق الرحم.
  2. جبل الحيوان وضع على ظهرها لمجلس الستايروفوم. استخدام الإبر 23 G يعلقون الأطراف.
  3. ترطيب وتطهير الماوس مع EtOH 70٪
  4. حوالي 1 سم بعيدا عن الأرجل الخلفية، من خلال إجراء شقالجلد وطبقة العضلات. قطع على كلا الجانبين للحيوان عامل لالحجاب الحاجز.
  5. ويمكن عندما يتم التوصل إلى الحجاب الحاجز يتم الجلد انقلبت الى الوراء.
  6. قطع الحجاب الحاجز بعيدا عن مزقت ثم قطع الوريد الأجوف.
  7. تحرك المعدة والأمعاء وجانبية، ويعرض في الوريد البابي.
  8. في الوريد البابي ادخال ابرة G 27 متصلة حقنة 5 مل مملوءة PBS الباردة. السماح لبرنامج تلفزيوني ببطء غسل الدم من الكبد.
  9. تشريح الكبد عن طريق الاستيلاء على الحجاب الحاجز وتقطيع الحجاب الحاجز بعيدا عن الجسم.
  10. نقل الكبد لطبق بيتري وإزالة الحجاب الحاجز، والمرارة وأي نوع من الأنسجة الأخرى لا تزال متصلة إلى الكبد
  11. نقل الكبد لبرنامج تلفزيوني 10 مل في أنبوب 50 مل على الجليد أو تضمينها في مجمع أكتوبر

4. عزل الخلايا الليمفاوية الكبد

  1. إعداد حلول الأوراق المالية التالية:
    • كولاجيناز الرابع الأوراق المالية (100 ملغ / مل) طن برنامج تلفزيوني. (جعل aliquots الصغيرة ومخزن في -20 درجة مئوية).
    • الدناز الأوراق المالية (25 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني. (جعل aliquots الصغيرة ومخزن في -20 درجة مئوية).
    • مزيج لمدة 1 الكبد، 9.5 مل الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني، 20 ميكرولتر كولاجيناز الرابع (100 ملغ / مل الأوراق المالية)، و 8 الدناز ميكروليتر (؛ برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2 ملغ / مل كولاجيناز الرابع، 0.02 ملغ / مل الدناز وFCS 5٪: كولاجيناز العازلة 25 ملغ / مل الأوراق المالية)، و 500 ميكروليتر FCS حرارة المعطل.
    • 35 Percoll٪؛ مزيج 175 مل Percoll، 20 مل × 10 PBS الأوراق المالية، 305 مل من برنامج تلفزيوني.
    • RPMI كاملة = RPMI التي تحتوي على 10٪ حرارة المعطل FCS، μ 100 / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل، 2 مم L-الجلوتامين.
  2. نقل الكبد perfused (انظر القسم 3) إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد في طبق بيتري على الجليد ومقطعة إلى قطع صغيرة باستخدام المقص.
  3. نقل الى مصفاة ميكرومتر الخلية 70 و السفن الشراعية الكبد من خلال الضغط مع مدقة الزجاج أو مدقة من حقنة 2 مل. إضافة بدقة 10 مل العازلة كولاجيناز الباردة والصحافة من خلال مصفاة. جمع التعليق ومرشح من خلال مصفاة مرتين أكثر.
  4. نقل إلى تعليق جديد أنبوب 50 مل على الجليد. معالجة الكبد المقبل.
  5. مزيج احتضان الكبد تعليق خلية في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، بلطف كل 15 دقيقة.
  6. الطرد المركزي في 30 XG لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. طاف نقل إلى أنبوب جديد، وترك السائل 5 مم فوق بيليه
  8. الطرد المركزي في 650 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  9. تجاهل طاف، وترك 3 مم فوق بيليه
  10. Resuspend بيليه في 20 مل العازلة Percoll
  11. الطرد المركزي في 600 XG لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  12. تجاهل وطاف بيليه resuspend بنقر الأنبوب.
  13. غسل بيليه 1 × مع برنامج تلفزيوني.
  14. غسل بيليه 1 × مع RPMI كاملة
  15. Resuspend بيليه في RPMI مل 3 استكمال وتعول الخلايا في تخفيف 01:10.
  16. Resuspend الخلايا في الخلايا ~ 7 10 / مل RPMI في استكمال ونقل أنبوب إلى جليد.

5. داخل الخلايا تلطيخ خلوى (ICCS)

5.1 تحفيز:

  1. تحضير الخلايا الليمفاوية خلايا الكبد في 10 7 ~ / مل في RPMI كاملة كما هو موضح. لوحة 100 ميكروليتر (10 6 خلايا) / إضافة إلى لوحة مسطحة 96-جيدا وهي ليست نسيج ثقافة المعالجة.
  2. إضافة 50μl RPMI إكمال تحتوي على 2μg/ml Brefeldin A ثم إضافة 50μl RPMI كاملة تحتوي على 2 ميكروغرام / مل تحفيز CYP2D6 الببتيد (أي CD4 سائد مناعيا حاتمة CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 أو سائد مناعيا CD8 حاتمة CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). مزيج من قبل pipetting.
  3. احتضان لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية (أفضل وقت التحفيز لكن حضانة بين عشية وضحاها كما يعمل بشكل جيد).

5.2. تلطيخ:

  1. إعداد حلول الأوراق المالية التالية:
    • FACS العازلة: برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ الجنين عجل Serum (FCS).
    • تثبيت / Permeabilization العازلة: FACS العازلة التي تحتوي على 0،1٪، وامتصاص العرق سابونين 4٪
    • نظام مراقبة الأصول الميدانية / سابونين العازلة غسيل: العازلة التي تحتوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية سابونين 0.1٪
    • نظام مراقبة الأصول الميدانية / PFA العازلة: FACS العازلة التي تحتوي على امتصاص العرق 1٪ (منهاج العمل)
  2. نقل الخلايا إلى لوحة microtiter V-القاع (96 أيضا) وتدور في 460 XG لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المتوسطة وصفيحة دوامة
  3. إضافة 150 العازلة ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية وأجهزة الطرد المركزي في 460 XG لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل لوحة المتوسطة ودوامة. تكرار غسل الخطوة.
  4. كتلة FCR السطح إذا لزم الأمر (عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية) مع 1 كوكتيل αCD16/32 ميكروغرام / مل (FCR كتلة) في المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 15 دقيقة في درجة مئوية (4) وغسل 2 × مع 150 العازلة تلطيخ ميكروليتر (460 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية).
  5. وصمة عار لجزيئات السطح: أي مكافحة CD8a-FITC خريطة موقع 10 ميكروغرام / مل في 50 العازلة FACS ميكرولتر لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  6. أضف 100 ميكروليتر FACSالعازلة وتدور في 460 XG لمدة 3 دقائق في درجة مئوية 4
  7. غسل الخلايا 2 × مع 150 العازلة ميكروليتر FACS (460 XG؛ 3 دقائق و 4 درجة مئوية). دوامة لوحة.
  8. إصلاح / permeabilize الخلايا مع 100 العازلة تثبيت / permeabilization ميكرولتر لمدة 10 دقيقة في RT.
  9. تدور في 460 XG لمدة 7 دقائق في درجة مئوية 4 لاحظ أنه من المهم لتمديد وقت الطرد المركزي إلى 7 دقائق، منذ تثبيت / الخطوات permeabilzation يغير الكثافة الإجمالية للخلايا. دوامة لوحة.
  10. غسل 2 × مع 150 FACS ميكروليتر / سابونين العازلة غسيل (460 XG؛ 7 دقائق و 4 درجة مئوية). دوامة لوحة.
  11. وصمة عار لجزيئات الخلايا: أي مكافحة IFNγ-PE خريطة موقع 10 ميكروغرام / مل في 50 FACS ميكروليتر / سابونين العازلة الغسيل لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  12. إضافة 100 FACS ميكروليتر / سابونين العازلة الغسيل وتدور في 460 XG لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
  13. غسل الخلايا 2 × مع 150 FACS ميكروليتر / سابونين العازلة غسيل (460 XG؛ 7 دقائق و 4 درجة مئوية). دوامة لوحة.
  14. غسل الخلايا 1 × العازلة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية (460 XG؛ 7 دقائق و 4 درجة مئوية). دوامة لوحة.
  15. خلايا Resuspend في 200 FACS ميكروليتر / PFA العازلة، ونقل إلى أنابيب، ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على البيانات من قبل التدفق الخلوي. نستخدم عادة الثاني FACSCanto أو FACSCalibur 1 دينار بحريني (العلوم البيولوجية، هايدلبرغ، ألمانيا).

6. المناعية

6.1. H & E تلطيخ لتقييم عام الكبد علم الأمراض:

  1. الكبد الحصاد، اغمس في الأنسجة تيك أكتوبر في قالب قاعدة واحدة وسريعة التجميد على الثلج الجاف.
  2. قطع 7 أقسام الأنسجة ميكرومتر الكبد باستخدام ناظم البرد لايكا التي وضعت في -17 درجة مئوية، وتركيب أبواب الأنسجة في Superfrost زائد شرائح المجهر. الشرائح مخزن في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  3. إصلاح cryosections في مرحلة ما قبل EtOH المبردة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. اسمحوا جافة لمدة 10 دقيقة.
  4. غسل 2 × في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الخطوات التالية، 6.1.5 - 6.1.13، يتم تنفيذها في درجة حرارة الغرفة).
  5. وصمة عار في حل الهيماتوكسيلين ماير لل8 دقيقة.
  6. غسل في دافئ لمدة 10 دقيقة (30 درجة مئوية) ماء الصنبور. تغيير الماء عدة مرات.
  7. شطف في الماء المقطر.
  8. شطف في EtOH 95٪ لمدة 20 ثانية.
  9. ملون مباين في حل G / Y يوزين لمدة 40 ثانية.
  10. يذوى 2 × في EtOH 95٪ لمدة 5 دقائق لكل حضانة.
  11. يذوى 2 × في EtOH 100٪ لمدة 5 دقائق لكل حضانة.
  12. مسح في × 2 الزيلين لمدة 5 دقائق لكل المقاصة.
  13. جبل في روتي-Histokitt.

6.2. المناعية لترسب الكولاجين أنا:

  1. الكبد الحصاد، وتزج في الأنسجة تيك أكتوبر في قالب قاعدة واحدة وسريعة للتجمد في الثلج الجاف.
  2. قطع 7 أقسام الأنسجة ميكرومتر الكبد باستخدام ناظم البرد لايكا التي وضعت في -17 درجة مئوية، وتركيب أبواب الأنسجة في Superfrost زائد شرائح المجهر. الشرائح مخزن في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  3. إصلاح cryosections في EtOH بارد لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. اسمحوا جافة لمدة 10 دقيقة.
  4. غسل 2 × في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. <لى> احتضان في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ H 2 O 2 و 0.1٪ صوديوم أزيد، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل 2 × في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. منع مع عدة أفيدين-البيوتين عرقلة وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
  7. منع مع FCS 10٪ في برنامج تلفزيوني (FCS / بى بى سى) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. الأجسام المضادة الأساسي هو أرنب لمكافحة فأر الضد أنا الكولاجين الذي يتم تخفيف 1:200 في 10٪ FCS / برنامج تلفزيوني. احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  9. غسل المقاطع 3 x في برنامج تلفزيوني لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. تمييع المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب الضد إلى 1:500 واحتضان مع المقاطع مقابل 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  11. غسل المقاطع 3 x في برنامج تلفزيوني لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  12. يتم الحصول على رد فعل من قبل لون حضانة متتابعة مع أفيدين-البيروكسيديز المتقارن وdiaminobenzidine-بيروكسيد الهيدروجين وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
  13. ملون مباين في لماير هوmatoxylin حل لمدة 5 دقائق، يغسل 2 × في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجبل في Aquatex.

7. ممثل النتائج

عدوى من الفئران مع AD-2D6 المرحلتين يسببها متميزة من تلف الكبد. في الأيام الأولى بعد العدوى، عدوى فيروس الكبد يسبب زيادة حادة في مستويات الألانين المصل، وهو مؤشر على وفاة الكبدية 6. هذا أولا، المرحلة الحادة تحدث مستقلة عن التعبير عن hCYP2D6 ويمكن أيضا أن لوحظ بعد إصابة مع فيروس سيطرة فارغة (AD-التحكم) أو فيروس التعبير عن بروتين أخضر مضان (AD-GFP). في المقابل، فإن المرحلة الثانية هي المناعة الذاتية التي تتوسط فيها وتعتمد على التعبير عن جزيء اثار hCYP2D6. هذه المرحلة المناعة الذاتية يحدث في غضون 2-4 أسابيع بعد العدوى، واستمرت لعدة أشهر 6.

figure-protocol-1

<ف الطبقة = "jove_content"> الشكل 1. يتم حقن CYP2D6 نموذج. Wildtype FVB أو C57BL / 6 الفئران مع جرعتين من 2D6-AD (عن طريق الوريد وداخل الصفاق). في وقت من مصلحة يتم جمعها في الكبد ومصل الدم والمقررة للتلف الكبد وتشكيل hCYP2D6 محددة الأجسام المضادة وخلايا تي.

الميزات التالية هي سمة مميزة لالتهاب الكبد في المناعة الذاتية المستمرة النامية بعد الإعلان، وعدوى 2D6 من FVB wildtype أو C57BL / 6 الفئران في النموذج CYP2D6: أولا، الكبد يظهر مورفولوجيا تغيرت aberrantly. على وجه الخصوص، وتنصهر في فصوص الكبد، وتظهر عقيدات hyperplasic منتشرة في الكبد وتليف كامل المحفظة الضخمة مرئيا (الشكل 2).

figure-protocol-2

الشكل 2. مورفولوجيا الكبد. نموذجي تلف الكبد AD-2D6 الناجم عن الكشف حتى 4 أسبوع آخر العدوى. لاحظ أن تنصهر في فصوص الكبد الفردية (النصال). تبدو متناثرة العقيدات Hyperplasic على كبد كامل (سهام). عدوى مع اتش سيطرة ليس التعبير عن hCYP2D6 له أي تأثير على مورفولوجيا الكبد.

تسلل الخلوية الثانية، واسعة ومستمرة تظهر في المناطق القريبة من المدخل ومتني من أكباد الفئران AD-2D6 المصابة ولكن ليس إعلان لمراقبة المصابين (الشكل 3A). تليف يتطور في الغالب في المنطقة تحت المحفظة مع بعض حزم الكولاجين جاحظ إلى لحمة (الشكل 3B).

figure-protocol-3


الشكل 3. علم الأنسجة في الكبد ج: H & E تلطيخ الباب أنسجة الكبد في الفئران FVB المصابين إما ضبط الإعلان أو الإعلان 2D6-في 4 أسابيع العدوى آخر. لاحظ أن عمليات التسلل كبيرة من الخلايا وحيدات النوى موجودة فقط في AD-2D6 الفئران المصابة (واحد السهام). الأسهم تشير إلى ثلاثة أضعاف أكبر عمليات التسلل الخلوية في لحمة الكبد سد بين مساحات بوابة المجاورة. (ب): تمثيل المناعية من تليف في الكبد في الأسبوع 4 بعد إصابة مع 2D6-AD أو الإعلان التحكم. وقد تلطخ المقاطع الكبد لمادة الكولاجين ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة أنا الكولاجين. لاحظ طبقة متعددة من التصرف الكولاجين تحت كبسولة الكبد (الأسهم الثلاثي) مع بعض حزم جاحظ إلى لحمة (الأسهم واحد)، ووجود مجموعات كبيرة من خلايا التسلل (النصال). يتم عرض قسمين الكبد ممثل عن كل حالة. البارات حجم: 100μm.

والسمة الثالثة هي جيل من التتر ارتفاع المضادة للCYP2D6 الأجسام المضادة، والتي لها خصوصية حاتمة مماثلة لأجسام مضادة LKM-1 6،13 الإنسان. يتم إنشاء مشاركة، hCYP2D6 محددة CD4 و CD8 خلايا تي التي يغلب منزل الى الكبد. ويمكن الكشف عن هذه hCYP2D6 محددة خلايا تي من قبل التحفيز مع immunodomiنانت hCYP2D6 الببتيدات والقياس اللاحق للتعبير IFNγ عن طريق تلطيخ خلوى داخل الخلايا (ICCS) (الشكل 4). hCYP2D6 محددة CD8 خلايا تي قتل الخلايا المستهدفة AD-2D6 المصابة في الجسم الحي 12.

figure-protocol-4

الشكل 4. الخلايا التائية hCYP2D6 محددة. تحليل تدفق cytometric من خلايا تي hCYP2D6 محددة. وقد تم عزل الخلايا الليمفاوية الكبد في الأسبوع 4 بعد الإعلان، وعدوى 2D6 وتم حفز مع CD4 إما سائد مناعيا أو CD8 hCYP2D6 حاتمة بين عشية وضحاها. تم الكشف عن جيل من IFNγ بواسطة تلطيخ خلوى داخل الخلايا وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي باستخدام كانتو FACS الثاني (دينار بحريني العلوم البيولوجية، هايدلبرغ، ألمانيا). يشار إلى أن نسبة hCYP2D6 محددة CD4 وخلايا CD8.

المناقشة

في الدراسات السابقة، وذكر في كثير من الأحيان التهاب الكبد التجريبية لتكون نماذج فقط الحالية عابرة والعديد من أمراض الكبد الذاتية تعتمد على بروتوكولات مرض الاستقراء معقدة نوعا ما (لاستعراض رؤية 3،5). على سبيل المثال، عدة نماذج استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن مستضدات هدف محدد، ونقل adoptively الهدف مستضد معين، ومعظمها TCR-المعدلة وراثيا، وخلايا تي 14،15. في كثير من الأحيان وجود عدوى إضافية مع الفيروسات livertropic أو الجراثيم أو الطفيليات هو ضروري للحث على المرض 16-18. بدلا من ذلك، يتم استخدام الحمض النووي التطعيم مع البلازميدات ترميز لمستضدات الهدف، بما في ذلك CYP2D6 19، للحث على التهاب الكبد. ومع ذلك، ثمة حاجة إلى تطعيم إضافية مع البلازميدات ترميز للمحترفين للالتهابات السيتوكينات، مثل IL-12 و 20. للأسف، مع وجود استثناءات قليلة 15،20 التهاب الكبد هو عابر فقط.

نموذج CYP2D6 6،21 يستخدم تي طريقة مباشرةس تحفز التهاب الكبد المناعي اصابة ببساطة الفئران مع اتش معربا عن hCYP2D6، ومستضد ذاتي كبير في AIH-2 7،8. تسليم CYP2D6 من قبل التركيبة اتش يضمن كلا من الاستهداف المباشر من الكبد، فضلا عن التهاب المحلية التي تروج لانهيار التسامح. من المهم أن نلاحظ مع ذلك أن كلا من عيار الفيروس، فضلا عن طريقة التعاطي أمر حاسم لهذا النموذج. من ناحية، AD-2D6 هو فيروس نقص تكرارها، وبالتالي، لا بد من عيار كافية عالية من الفيروس لتوليد كمية حرجة من المستضد داخل الكبد. من ناحية أخرى، قد يكون باهظ عيار يؤدي إلى فشل الكبد الحاد المميت. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تجلى ذلك في وقت سابق ان العدوى من الفئران بواسطة عيار عالية من اتش يؤدي إلى إنهاك وظيفي للاستجابة المناعية 22. في نموذجنا، وكنا مجموعة من العدوى عن طريق الوريد وداخل الصفاق من أجل الحصول على حد سواء تسلل مزمن الخلوية وكذلك تحويلةensive التليف. وقد لاحظنا أن العدوى عن طريق الوريد وحده لا يزال يسبب تسلل الخلوية هائلة، ولكن قد يكون متورطا لا تليف في المنطقة تحت المحفظة، مشيرا الى ان الالتهاب البريتوني نتيجة للحقن داخل الصفاق في تراكم مستمر وتحت المحفظة من الكولاجين (Hintermann وكريستين، مخطوطة في الإعداد). ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن التليف الكبدي الملاحظ هو مستضد معين، لأننا لم يكشف عن تنشيط الخلايا النجمية كبدي وترسب الكولاجين بعد الإصابة على قدم المساواة مع التتر للفيروسات من GFP-AD أو الإعلان لمراقبة 23.

نموذج CYP2D6 يعكس جوانب كثيرة من 1،2 AIH الإنسان، مثل التهاب الكبد المزمن يتميز تسلل الخلوية الثابتة، وتليف الكبد 6. وبالإضافة إلى ذلك، وجود أجسام مضادة لمكافحة CYP2D6 عالية عيار مع خصوصية حاتمة مماثلة، ونشر 13 إلى LKM-1 الأضداد الموجودة في AIH-2 المرضى يشير إلى ما قبلsence من التفاعل المشترك المناعة الذاتية المزمنة. CYP2D6 هو مستضد رئيسي في AIH-2، ولكن لم يتم التعرف عليه من قبل المرضى الذين شخصت مع AIH أكثر شيوعا من النوع 1. وبالإضافة إلى ذلك، المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الأخرى مع المسببات المناعة الذاتية، مثل التشمع الصفراوي الابتدائي (PBC) أو التهاب الأقنية الصفراوية المصلب الابتدائية (PSC)، وتوليد الأجسام المضادة السمة المميزة مع خصوصية لautoantigens الكبد متميزة وأكبادهم تظهر ملامح مرضية مختلفة تركز على الصغيرة (PBC ) أو كبير القناة الصفراوية (PSC). ومع ذلك، فإن النماذج CYP2D6 يتيح الفرصة لتحليل آليات immunopathogenic المشاركة في عمليات كبدي مزمن التهابات والتي تحدث أثناء أمراض الكبد الذاتية، لتحديد اللاعبين الرئيسيين التي تدفع تدمير المناعة الذاتية للخلايا الكبد، وتقييم التدخلات العلاجية الممكنة لعلاج هذا المرض.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من قبل فرانكفورت غوته مستشفى الجامعة ومنحة من مؤسسة البحوث الألمانية إلى جامعة كاليفورنيا

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم المعدات شركة فهرس العدد تعليقات
23G إبرة العلوم البيولوجية دينار بحريني 300800
27 ½ G إبرة VWR 612-0151
30 ½ G إبرة العلوم البيولوجية دينار بحريني 304000
ألانين شرائط الاختبار الألانين (GPT / ALT) روش تشخيص 10 745 138 202
شرائط اختبار الألانين اسبارتاتي (GOT / AST) روش تشخيص 10 745 120 202
التخدير وحدة Univentor 400 AgnTho لل
قوالب قاعدة، يمكن التخلص منها مم 37x24x10 VWR 720-0208
خلية مصفاة 70MM VWR 734-0003
ناظم البرد لايكا CM1850 الأشعة فوق البنفسجية
الشعرية أنابيب Heparinized الصياد 3123987
مجهر ينزلق Superfrost زائد منزل جلاسر J1800AMNZ
Microtainer طائرة أسرع من الصوت أنابيب العلوم البيولوجية دينار بحريني 365951
لوحات Microtiter، V-أسفل VWR 391-1924
Reflotron زائد روش تشخيص Determiniation من المصل AST / ALT
اسم سو الكاشف شركة فهرس العدد تعليقات
أرنب لمكافحة فأر المضادة للالكولاجين النوع الأول مفتش الحكومة، Chemicon AB765P
المعقدة البيروكسيديز الماعز المضادة للأرنب مفتش ناقلات (AXXORA) VC-BA-1000-MC15
FITC مترافق المضادة الضد الماوس CD8a جنوبي في مجال التكنولوجيا الحيوية 1550-1502
PE-مترافق IFNγ الماوس المضادة الضد العلوم البيولوجية دينار بحريني 554412
PE-مترافق مكافحة فأر CD16/CD32 الأجسام المضادة (FCR كتلة) العلوم البيولوجية دينار بحريني 553141
Aquatex VWR 1.08562.0050
أفيدين / بيوتين الحظر عدة المتجهات (AXXORA) VC-SP-2001-KI01
Brefeldin A سيغما B6542
كولاجيناز الرابع سيغما C5138-100MG
DAB الركيزة عدة 3'3'diaminobenzidine ناقلات (AXXORA) VC-SK-4100-KI01
الدناز سيغما DN-25
نخبة ABC الكاشف ناقلات (AXXORA) VC-PK-7100-L050
يوزين G / Y حل روث X883.1
الجنين المصل في ربلة الساق (FCS) Biochrom AG S 0115
Isofluran Forene B506
ماير الهيماتوكسيلين حل AppliChem A4840، 1000
مجمع أكتوبر ساكورا Finetek أوروبا 4583
PBS، مخزنة الفورمالديهايد بنسبة 10٪ روث A146.3
Percoll أميرشام 17-0891-01
روتي-Histokit روث 6638.1
RPMI إينفيتروجن 61870
سابونين من لحاء كلاجه سيغما S7900

المراجع

  1. Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
  2. Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
  3. Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
  4. Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
  5. Czaja, A. J. Animal models of autoimmune hepatitis. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).
  6. Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
  7. Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
  8. Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
  9. von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
  10. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).
  11. Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
  12. Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
  13. Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
  14. Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
  15. Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
  16. Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
  17. Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
  18. Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
  19. Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
  20. Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
  21. Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
  22. Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
  23. Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج التهاب الكبد المناعي الذاتيبنية الفيروس الغديتروية الكبدعزل الخلايا اللمفاويةتحليل قياس التدفق الخلويتقييم الكيمياء النسيجية المناعيةالتنقية بتدرج البيركولالهضم بالكولاجينازسحب الدم من خلف المحجر
النموذج الحيواني CYP2D6: كيف للحث على كسرطان الكبد في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.