يمثل توصيف إبيتوپات الخلايا التائية لمسببات الأمراض التي تسبب عدوى موضعية مثل فيروس الورم الحليمي البشري تحدياً بسبب العدد المحدود للخلايا التائية في الدورة الدموية. تصف هذه الطريقة كيفية عزل الخلايا التائية النادرة وتوصيفها بدءاً من عدد صغير جداً من الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام مضاد للفيروسات، γ الإنزيم المرتبط الفحص Immunospot لوصف الرواية تي خلية الحواتم من فيروس الورم الحليمي البشري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم تطوير بروتوكول للتغلب على الصعوبات التي تواجه عزل وتوصيف الخلايا التائية النادرة المتخصصة في مسببات الأمراض، مثل فيروس الورم الحليمي البشري (HPV)، التي تسبب عدوى موضعية. تتضمن الخطوات المتبعة تحديد المنطقة (أو المناطق) من بروتينات HPV التي تحتوي على مستضدات الخلايا التائية (T-cell epitopes) من الخاضع للدراسة، واختيار الخلايا التائية المتخصصة في الببتيد بناءً على إفراز إنترفيرون-غاما (IFN-γ)، ثم تنمية وتوصيف مستنسخات الخلايا التائية (الشكل 1). كان الخاضع للدراسة 1 مريضاً تم تشخيصه مؤخراً بآفةة داخل الظهارة حرشفية عالية الدرجة عن طريق الخزعة، وخضع لإجراء الاستئصال الكهربائي العروي للعلاج في اليوم الذي جُمعت فيه الخلايا التائية1. تم تحديد منطقة داخل بروتينات E6 وE7 لفيروس الورم الحليمي البشري النوع 16 (HPV 16) تحتوي على مستضد للخلايا التائية باستخدام مقايسة البقع المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) لـ IFN-γ التي أُجريت باستخدام ببتيدات اصطناعية متداخلة (الشكل 2). لم تُستخدم البيانات المستمدة من هذه المقايسة لتحديد المنطقة التي تحتوي على مستضد الخلايا التائية فحسب، بل استُخدمت أيضاً لتقدير عدد الخلايا التائية المتخصصة في المستضد وعزلها على أساس إفراز IFN-γ باستخدام حبيبات مغناطيسية متوفرة تجارياً (طقم عزل خلايا T CD8، Miltenyi Biotec، Auburn CA). تم تخفيف الخلايا التائية المختارة المفرزة لـ IFN-γ وتنميتها بشكل فردي في وجود خليط من الخلايا المغذية المشععة من أجل دعم نمو خلية تائية واحدة لكل بئر. تم فحص مستنسخات الخلايا التائية هذه باستخدام مقايسة IFN-γ ELISPOT في وجود ببتيدات تغطي المنطقة المحددة وخلايا لمفاوية بائية مستنسخة محولة بفيروس إبشتاين-بار ذاتية المنشأ (LCLs، تم الحصول عليها كما وصف Walls وCrawford)2 وذلك لتقليل عدد خلايا مستنسخات الخلايا التائية المطلوبة. بدلاً من استخدام 1 x 105 خلية لكل بئر كما هو متبع عادة في مقايسات ELISPOT1,3، استُخدم 1,000 خلية من مستنسخات الخلايا التائية في وجود 1 x 105 من خلايا LCLs ذاتية المنشأ، مما أدى إلى تقليل عدد خلايا مستنسخات الخلايا التائية المطلوبة بشكل كبير. لم تعمل خلايا LCLs ذاتية المنشأ على تقديم المستضدات الببتيدية لخلايا مستنسخات الخلايا التائية فحسب، بل عملت أيضاً على الحفاظ على كثافة خلوية عالية في الآبار مما سمح لخلايا مستنسخات الخلايا التائية المتخصصة في المستضد بإفراز IFN-γ. وهذا يضمن الأداء الناجح لمقايسة IFN-γ ELISPOT. وبالمثل، استُخدمت مقايسات IFN-γ ELISPOT لتوصيف التسلسل الأميني الأدنى والأمثل لمستضد خلايا T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) وعنصر تقييده من الفئة الأولى لـ HLA (B58). كما أُجريت مقايسة IFN-γ ELISPOT باستخدام خلايا LCLs ذاتية المنشأ مصابة بفيروس فاكسينيا الذي يعبر عن بروتين HPV 16 E6 أو E7. أظهرت النتيجة أن مستضد الخلايا التائية E6 تمت معالجته داخلياً. كما تم إثبات التعرف المتقاطع لمستضدات الخلايا التائية المتجانسة لأنواع HPV الأخرى عالية الخطورة. يمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لوصف مستضدات الخلايا التائية CD44.
البروتوكول
من خلال إجراء مقايسة IFN-γ ELISPOT باستخدام خط خلايا CD8 T مستمد من الخاضع للدراسة 1، تبيّن أن المنطقة 46-70 من HPV 16 E6 تحتوي على إبيتوب للخلايا التائية1 (الشكل 2)، وقد تم اختيار الخلايا التائية النوعية للإبيتوب بناءً على إفراز IFN-γ قبل البدء في هذا البروتوكول (الشكل 1).
1. التخفيف المحدّد للخلايا التائية النوعية للمستضد
- قم بتحضير خليط الخلايا المغذية عن طريق دمج الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) الخيفية المشععة (4,000 rad) بتركيز 5 x 105 cells/ml، وخطوط الخلايا اللمفاوية B (LCLs) الخيفية المشععة (5,000 rad) بتركيز 5 x 104 cells/ml، والفيتوهيموجلوتينين (PHA) بتركيز 0.1 μg/ml باستخدام وسط Yssel الكامل الذي يحتوي على 1% مصل بشري مجمع. يجب التعامل مع الخلايا تحت ظروف معقمة طوال البروتوكول.
- قم بتخفيف الخلايا التائية النوعية للحاتمة المعزولة تسلسلياً (الشكل 3) باستخدام خليط الخلايا المغذية حتى يصل التركيز إلى 0.5 cell/100 μl أو 5 cells/1 ml. استخدم ما يقرب من 3 x 103 من الخلايا التائية النوعية للحاتمة.
- وزع 100 μl/well من الخلايا التائية النوعية للحاتمة المخففة في ما مجموعه من 30 إلى 60 لوحة ذات 96 بئراً ذات قاع مستدير باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- حضن الألواح في حضانة عند 37 °C، و5% CO2.
- في اليوم 5، أضف 100 μl من وسط Yssel الكامل الذي يحتوي على 20 u/ml من الإنترلوكين-2 البشري المؤتلف (rhIL-2).
- حدد بصرياً مستعمرات الخلايا التائية النامية في الألواح ذات 96 بئراً ذات القاع المستدير من خلال أحجام الكريات الكبيرة في القاع.
- في اليوم 11 إلى 14، حضر خليط خلايا مغذية جديد عن طريق دمج PBMCs خيفية مشععة (4,000 rad) بتركيز 1 x 106 cells/ml، وLCLs خيفية مشععة (5,000 rad) بتركيز 1 x 105 cells/ml، وPHA بتركيز 0.1 μg/ml باستخدام وسط Yssel الكامل. وزع خليط الخلايا المغذية الجديد هذا في لوحة ذات 24 بئراً بتركيز 1 ml/well.
- اسحب مستعمرات الخلايا التائية بشكل فردي من كل بئر باستخدام ماصة دقيقة يمكنها استيعاب حجم يصل إلى 200 μl تقريباً.
- وزع مستعمرات الخلايا التائية بشكل فردي في اللوحة ذات 24 بئراً التي تحتوي على خليط الخلايا المغذية الجديد. كرر العملية حتى يتم نقل جميع مستعمرات الخلايا التائية.
2. تحديد مستنسخات الخلايا التائية النوعية للمستضد باستخدام مقايسة ELISPOT عالية الإنتاجية للفحص (مقتبسة من طريقة وصفها Larsson et al.5)
- طلاء طبقين معقمين من أطباق ELISPOT (من نوع Multiscreen-HA؛ شركة Millipore، بـ Bedford، MA) بـ 50 μl/well من الجسم المضاد أحادي النسيلة الأولي anti-IFN-γ (النسيلة D1K، شركة Mabtech، ستوكهولم، السويد) مخففاً إلى 5 μg/ml في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) معقم وبدرجة نقاء مناسبة للزراعة النسيجية، وذلك لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة 4 °C.
- غسل الآبار بـ 150 إلى 200 μl/well من محلول PBS عن طريق الإضافة ثم التخلص منه. تكرر العملية ثلاث مرات إضافية.
- حجب الارتباط غير النوعي عن طريق إضافة 50 μl/well من مصل بشري مجمع مخفف إلى 5% باستخدام وسط RPMI 1640 لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة 37 °C، و5% CO2. يتم التخلص من أي فقاعات كبيرة عن طريق ثقبها بإبرة معقمة.
- زراعة 1 x 105 من خلايا LCLs2 ذاتية في 50 μl من وسط RPMI 1640 مع 5% مصل بشري لكل بئر.
- خلط الخلايا في كل بئر من طبق الـ 24 بئراً الذي يحتوي على نسائل الخلايا التائية باستخدام ماصة سعة 1 ml. نقل 100 μl لكل بئر إلى أنبوب Eppendorf معقم. إضافة 500 μl من وسط RPMI 1640 مع 5% مصل بشري مجمع إلى كل أنبوب Eppendorf، ثم الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 3,000 RPM لمدة 5 min.
- سحب السائل من أنابيب Eppendorf، وإضافة 110 μl من وسط RPMI 1640 مع 5% مصل بشري لكل أنبوب، وإعادة تعليق الخلايا باستخدام جهاز الـ vortex.
- زراعة 50 μl من الوسط الذي يحتوي على نسائل خلايا تائية محددة، بغض النظر عن عدد الخلايا لغرض الفرز السريع، في آبار ذات مواقع متماثلة في الطبقين. تكرر العملية لجميع نسائل الخلايا التائية. ومن خلال إلغاء خطوات عد الخلايا، يمكن اختبار عدد كبير من نسائل الخلايا التائية في وقت واحد.
- جمع الوسط المتبقي من عدة أنابيب Eppendorf، وزراعة 50 μl من كل منها في الآبار التالية ذات المواقع المتماثلة لاستخدامها كآبار تحكم إيجابية سيُضاف إليها PHA.
- إضافة 50 μl من وسط RPMI 1640 مع 5% مصل بشري مجمع إلى كل بئر سيعمل كبئر تحكم سلبي، أي الذي لا يحتوي على نسائل خلايا تائية.
- إضافة الببتيدات الموجودة في المنطقة الإيجابية (الجدول 1) بتركيز 50 μl/well لتصل إلى تركيز نهائي قدره 10 μM/peptide. يتم إذابة مخزونات الببتيد بتركيز 5mM لكل منها في 5% - 15% ثنائي ميثيل سلفوكسيد في محلول PBS بناءً على ذوبانية الببتيد. سيحتوي كل بئر على حجم إجمالي قدره 200 μl (50 μl من مادة الحجب، و50μl من خلايا LCLs، و50μl من نسائل الخلايا التائية، و50μl من الببتيدات).
- إضافة 50 μl من PHA (التركيز النهائي 10 μg/ml) إلى آبار التحكم الإيجابية.
- إضافة 50 μl من وسط RPMI 1640 مع 5% مصل بشري مجمع إلى آبار التحكم السلبية.
- الحضن طوال الليل في درجة حرارة 37 °C، و5% CO2.
- غسل الآبار بـ 150 إلى 200 μl/well من محلول PBS مع 0.05% Tween-20 عن طريق الإضافة ثم التخلص منه. تكرر العملية ثلاث مرات إضافية.
- إضافة 50 μl من محلول PBS يحتوي على 1 μg/ml من الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-IFN-γ المقترن بالبيوتين (النسيلة 7B-6، شركة Mabtech)، والحضن في درجة حرارة 37 °C، و5% CO2 لمدة 2 hr. يتم التخلص من أي فقاعات كبيرة عن طريق ثقبها بإبرة.
- قبل عشرين دقيقة من نهاية فترة الحضن التي تبلغ 2 hr، يتم تحضير بيروكسيداز الفجل الحصاني المبيوتني المرتبط بالأفيدين (طقم Vectastain Elite ABC؛ شركة Vector Laboratories, Inc.، بـ Burlingame, CA) عن طريق إضافة قطرتين من المحلول A وقطرتين من المحلول B إلى 5 ml من محلول PBS الذي يحتوي على 0.1% Tween-20.
- غسل الآبار بـ 150 إلى 200 μl/well من محلول PBS مع 0.1% Tween-20 عن طريق الإضافة ثم التخلص منه. تكرر العملية ثلاث مرات إضافية.
- زراعة 50 μl/well من بيروكسيداز الفجل الحصاني المبيوتني، والحضن في درجة حرارة 37 °C، و5% CO2 لمدة 1 hr. يتم التخلص من أي فقاعات كبيرة عن طريق ثقبها بإبرة.
- غسل الآبار بـ 150 إلى 200 μl/well من محلول PBS مع 0.1% Tween-20 عن طريق الإضافة ثم التخلص منه. تكرر العملية ثلاث مرات إضافية.
- زراعة 50 μl/well من كاشف تلوين يسمى diaminobenzidine المستقر (DAB) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min. يتم التخلص من أي فقاعات كبيرة عن طريق ثقبها بإبرة.
- غسل الآبار بـ 150 إلى 200 μl/well من الماء منزوع الأيونات عن طريق الإضافة ثم التخلص منه. تكرر العملية مرتين إضافيتين.
- ترك الطبق ليجف تماماً.
- عد البقع باستخدام مجهر تشريحي أو قارئ ELISPOT آلي (AID ELISPOT Classic Reader؛ شركة Autoimmun Diagnostika GmbH، بـ Strassberg، ألمانيا).
3. تأكيد الطبيعة المحددة للإبيتوپ لنسائل الخلايا التائية باستخدام مقايسة ELISPOT (الشكل 4)
- اختر مستنسخات الخلايا التائية (T-cell clones) ذات النمو الجيد. أجرِ مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء وضع 1 x 105 من خطوط الخلايا اللمفاوية البائية المحولة (LCLs) ذاتية المنشأ و 1 x 103 من خلايا مستنسخات الخلايا التائية في كل بئر، مع إضافة واحد من كل ببتيد من الببتيدات الثلاثة الموجودة في المنطقة (الجدول 1) بتركيز 10 μM. قم بإعداد المقايسة في مكررات ثنائية أو ثلاثية.
4. تحديد ما إذا كان الإبيتوپ يتم معالجته داخلياً (الشكل 5)
- اختر مستنسخات الخلايا التائية (T-cell clones) ذات النمو الجيد. قم بإجراء مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء أنه سيتم وضع 1 x 105 من خطوط الخلايا اللمفاوية البائية المستنبتة ذاتياً (autologous LCLs) المصابة بفيروس فاكسينيا مأشوب يعبر عن HPV 16 E6, E7 6 (قبل المقايسة) أو غير مصابة (النوع البري، سلالة WR) (بمضاعف عدوى قدره 5 لمدة 1 hr) و 1 x 103 من خلايا مستنسخ الخلايا التائية لكل بئر.
5. توصيف التسلسل الأدنى والأمثل للإبيتوپ الخاص بالخلية التائية (الأشكال 6a و6b و6c)
- اختر مستنسخات الخلايا التائية ذات النمو الجيد. أجرِ مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء أنه سيتم وضع 1 x 105 من خلايا LCLs ذاتية و 1 x 103 من خلايا مستنسخ الخلايا التائية في كل بئر، جنباً إلى جنب مع إحدى السلسلة من الببتيدات المتداخلة المكونة من 9 أحماض أمينية والتي تغطي المنطقة (الجدول 1) بتركيز 10 μM (الشكل 6a).
- أجرِ مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء أنه سيتم وضع 1 x 105 من خلايا LCLs ذاتية و 1 x 103 من خلايا مستنسخ الخلايا التائية في كل بئر، جنباً إلى جنب مع إحدى السلسلة من الببتيدات ذات الأطوال المتغيرة (الجدول 1) بتركيز 10 μM (الشكل 6b).
- أجرِ مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء أنه سيتم وضع 1 x 105 من خلايا LCLs ذاتية و 1 x 103 من خلايا مستنسخ الخلايا التائية في كل بئر، جنباً إلى جنب مع عدد قليل من الببتيدات التي يُرجح أنها تحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية الأدنى والأمثل. سيتم اختبار هذه الببتيدات بتركيزات تتراوح من 10-5 M إلى 10-10 M (الشكل 6c).
6. تحديد عنصر التقييد باستخدام مقايسة ELISPOT (الشكل 7)
- اختر مستنسخات الخلايا التائية (T-cell clones) ذات النمو الجيد. أجْرِ مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء وضع 1 x 103 من خلايا مستنسخ الخلايا التائية في كل بئر، جنباً إلى جنب مع الببتيد الأدنى والأمثل بتركيز 10 μM. كما يتم وضع مائة ألف من خلايا LCLs خيفية في كل بئر، بحيث تشترك مع الشخص الخاضع للدراسة في جزيء واحد أو جزيئين من جزيئات HLA class I.
7. دراسة التفاعل المتبادل لمستنسخات الخلايا التائية المتخصصة بالمحددات الحاتمية مع تسلسلات الأحماض الأمينية المتماثلة من أنواع أخرى من فيروس الورم الحليمي البشري HPV عالية المخاطر (الشكل 8)
- اختر مستنبتات الخلايا التائية (T-cell clones) التي تظهر نمواً جيداً. قم بإجراء مقايسة ELISPOT كما هو موضح أعلاه، باستثناء أنه سيتم وضع 1 x 103 من خلايا مستنبت الخلية التائية في كل بئر مع ببتيدات (10 μM) تحتوي على تسلسلات أحماض أمينية متجانسة من أنواع أخرى من فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) عالية الخطورة (الجدول 2). كما سيتم وضع مائة ألف من خلايا LCL ذاتية المنشأ في كل بئر، بالإضافة إلى خلايا LCL خيفية تعبر عن جزيئات HLA من الفئة الأولى المقيدة في الآبار المخصصة لها.
8. النتائج التمثيلية
كانت الحالة 1 المعروضة هنا امرأة أمريكية من أصل أفريقي تبلغ من العمر 22 عاماً، ولديها تاريخ حديث من الآفة الظهارية الحرشفية عالية الدرجة التي تم تشخيصها عن طريق الخزعة. حضرت المريضة لتخضع لإجراء الاستئصال الكهربائي العروي في اليوم الذي جُمعت فيه الخلايا التائية1. وأظهر مقايسة ELISPOT لسلالة خلايا T من نوع CD8 أنها تحتوي المنطقة 46-70 من بروتين HPV 16 E6 (يتم اختبار كل منطقة باستخدام 3 ببتيدات متداخلة بطول 15 وحدة) على إبيتوپ للخلايا التائية (الشكل 2). وكان عدد الخلايا التائية النوعية للإبيتوپ، والتي تم اختيارها بناءً على إفراز IFN-γ، هو 1.2 x 105. وبعد إجراء التخفيف المحدود (الشكل 3) على خمس الخلايا المختارة، تم حصاد 262 مستنسخاً من الخلايا التائية. ولم تُستخدم الخلايا المختارة المتبقية نظراً لنجاح المحاولة الأولى لاستنساخ الخلايا التائية. حددت مقايسة ELISPOT عالية الإنتاجية التي أُجريت على 94 من هذه المستنسخات وجود 62 مستنسخاً إيجابياً في الفحص، والتي يمكن تحديدها بسهولة في طبق ELISPOT عيانياً. ولم يتم اختبار مستنسخات الخلايا التائية المتبقية لأن مقايسة ELISPOT الأولى حددت مستنسخات الخلايا التائية النوعية للببتيد. تمت إعادة اختبار ثمانية مستنسخات إيجابية الفحص جيدة النمو باستخدام الببتيدات الثلاثة ذات الـ 15 وحدة التي تغطي المنطقة بشكل فردي (الشكل 4). كانت جميع مستنسخات الخلايا التائية إيجابية مع ببتيدات HPV 16 E6 51-65، وكان 6 من أصل 8 مستنسخات إيجابية مع ببتيد E6 46-60، ولم يكن أي من المستنسخات إيجابياً مع ببتيد E6 56-70. وأثبت الاختبار باستخدام خلايا LCL ذاتية مصابة بفيروس فاكسينيا معاد التركيب يعبر عن بروتين HPV 16 E6 أو بروتين E7 أن مستنسخات الخلايا التائية تتعرف على إبيتوپ E6 تمت معالجته داخلياً (الشكل 5). وأظهر الاختبار باستخدام سلسلة من الببتيدات المتداخلة ذات الـ 9 وحدات التي تغطي المنطقة 46-65 من HPV 16 (الجدول 1) أفضل استجابة مع ببتيد E6 53-61 (الشكل 6أ). وتم اختبار ببتيدين من نوع 10 وحدات يحتويان على ببتيد E6 53-61، وببتيدين من نوع 8 وحدات واردين في ببتيد E6 53-61، وببتيد واحد من نوع 11 وحدة يحتوي على الببتيدين ذوي الـ 10 وحدات، وكان ببتيد E6 52-61 (10 وحدات) هو التسلسل الأدنى والأمثل بشكل أكثر اتساقاً (الشكل 6ب). ومع ذلك، أظهر ببتيد E6 53-61 (9 وحدات) استجابة قوية مماثلة مع مستنسخ الخلايا التائية رقم 79. وقد اختُبر مستنسخ الخلايا التائية هذا باستخدام هذين الببتيدين بمدى تركيز أوسع، واحتفظ ببتيد E6 52-61 (10 وحدات) بإيجابيته بشكل أكثر فعالية بكثير من ببتيد E6 53-61 (9 وحدات) عند تركيزات الببتيد المنخفضة (الشكل 6ج). ولم يتم اختبار ببتيد E6 52-62 الأطول (11 وحدة) لأن الهدف كان تحديد أقصر تسلسل يظهر استجابة قوية. وبناءً على ذلك، تم تحديد أن ببتيد E6 52-61 (10 وحدات) يحتوي على التسلسل الأدنى والأمثل.
يمكن فحص جزيء HLA class I المقيد لـ CD8 T-cell epitope باستخدام مقايسة ELISPOT التي تستخدم خلايا LCL خيفية تعبر عن جزيء أو جزيئين من HLA class I المشتركة مع الشخص الخاضع للدراسة. ومع ذلك، كانت النتائج غير حاسمة بالنسبة للشخص 1 نظرًا لوجود خلفية عالية ظهرت في مقايسة ELISPOT. وقد تم لاحقًا تحديد جزيء HLA class I المقيد للشخص 1 على أنه B58 باستخدام مقايسة تحرر الكروم (البيانات غير معروضة). يوضح الشكل 7 مثالاً من شخص آخر [الشخص A الذي وجد أنه يكتشف التسلسل الأدنى والأمثل لـ E6 75-83 (KFYSKISEY) كما وصفه Wang et al.]7. يظهر إيجابية عالية مع LCL تعبر عن جزيئات B62 وCw3، بينما تظهر إيجابية الخلفية مع LCL تعبر عن Cw3. وأكدت مقايسة تحرر الكروم أن جزيء B62 كان هو العنصر المقيد للشخص A7.
تعتبر بعض مناطق جينوم HPV محفوظة جيداً، وكانت هناك تسلسلات متجانسة مع مناطق 52-61 من البروتين E6 لفيروس HPV 16 في 13 نوعاً آخر من فيروسات HPV عالية الخطورة (الجدول 2). وقد ظهر تعرف تبادلي قوي (>50% من وحدات تكوين البقع للببتيد 52-61 من E6 لفيروس HPV 16) لـ 8 من أصل 13 نوعاً من فيروسات HPV عالية الخطورة (الشكل 8).
الشكل 1. مخطط عام يوضح سلسلة التجارب التي توصّف إبيتوپ (أو إبيتوپات) جديدة للخلايا التائية. تصف هذه الورقة البروتوكول بدءاً من المربع الثالث من الأعلى.
الشكل 2. مقايسة ELISPOT أُجريت لتحديد المنطقة (أو المناطق) التي تحتوي على إبيتوپ الخلايا التائية. تم توزيع مائة ألف خلية T من نوع CD8 محفزة in vitro لكل بئر، إلى جانب ثلاثة ببتيدات متداخلة مكونة من 15 حمضاً أمينياً (بتركيز 10 μM لكل منها) تغطي كل منطقة داخل بروتينات E6 وE7 لفيروس HPV 16. أظهر هذا المثال من الشخص الخاضع للدراسة 1 وجود إبيتوپ للخلايا التائية في المنطقة 46-70 من E6. تمثل الأشرطة الأخطاء المعيارية للمتوسطات.
الشكل 3. مخطط يوضح كيفية تخفيف الخلايا التائية (T cells) النوعية للمستضد باستخدام خليط من الخلايا المغذية للوصول إلى تركيز 0.5 خلية لكل بئر.
الشكل 4. مقايسة ELISPOT أُجريت لتحديد المناطق الفرعية التي تحتوي على إبيتوپ الخلايا التائية من خلال اختبار ثلاثة ببتيدات مكونة من 15 حمضاً أمينياً بشكل فردي. أظهر هذا المثال من الخاضع للدراسة 1 وجود الإبيتوپ في المناطق الفرعية E6 46-60 و E6 51-65. تمثل الأعمدة الأخطاء المعيارية للمتوسطات.
الشكل 5. مقايسة ELISPOT أجريت لفحص ما إذا كان إبيتوپ الخلية التائية يُعرض داخلياً. أظهر هذا المثال من الخاضع للدراسة 1 أن مستنسخات الخلايا التائية قد تعرفت على إبيتوپ E6 تمت معالجته داخلياً. تمثل الأعمدة الأخطاء المعيارية للمتوسطات.
الشكل 6. اختبارات ELISPOT التي أجريت لتوصيف أقصر تسلسل ببتيدي أمثل للمستضد التائي (T-cell epitope). استُخدمت نفس المستنسخات في جميع المراحل في حال توفرها. (أ) اختبار ELISPOT أجري باستخدام ببتيدات متداخلة مكونة من 9 أحماض أمينية (9-mer). أظهر هذا المثال من الخاضع للتجربة 1 أن المستضد يوجد في المنطقة الفرعية E6 53-61. (ب) اختبار ELISPOT أجري لتحديد تسلسل الببتيد الأدنى والأمثل باستخدام ببتيدات ذات أطوال مختلفة. أظهر هذا المثال أن أقصر تسلسل ببتيدي أمثل كان بشكل أكثر اتساقاً هو الببتيد E6 52-61 يليه الببتيد E6 53-61. (ج) اختبار ELISPOT أجري لتأكيد الببتيد الذي يحتوي على التسلسل الأدنى والأمثل. حافظ الببتيد E6 52-61 على إيجابية الاستجابة عند تركيزات أقل، وتقرر أنه التسلسل الأقصر والأمثل. تمثل الأعمدة الأخطاء المعيارية للمتوسط.
الشكل 7. تحليل ELISPOT تم إجراؤه لتحديد جزيء HLA من الفئة الأولى المقيد. دعّم هذا المثال فكرة أن جزيء B62 هو عنصر التقييد لمستنسخ خلايا T CD8 الخاصة بالخاضع للاختبار A التي تتعرف على الحاتمة HPV 16 E6 75-837. تم تأكيد ذلك من خلال تحليل تحرر الكروميوم. تمثل الأعمدة الأخطاء المعيارية للمتوسطات.
الشكل 8. مقايسة ELISPOT أُجريت لتقييم التفاعلية المتقاطعة لمستنسخات الخلايا التائية النوعية للتتابع 52-61 في HPV 16 مع تتابعات مماثلة من أنواع أخرى من HPV عالية الخطورة (الجدول 2). أظهر هذا المثال من الخاضع للدراسة 1 تفاعلية متقاطعة كبيرة (>50% من الإيجابية مقارنة بـ HPV 16 52-61) في 8 من أصل 13 نوعاً آخر من HPV عالية الخطورة التي تم فحصها. تمثل الأعمدة الأخطاء المعيارية للمتوسطات.
| نمط فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) | بقايا الأحماض الأمينية* | تسلسل |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | هذا الرمز غير مفهوم أو يمثل سلسلة من الأحرف العشوائية، لذا لا يمكن ترجمته إلى العربية. يرجى تقديم النص العلمي أو التعليمي المطلوب ترجمته. |
* يظهر عدد الأحماض الأمينية بين قوسين.
الجدول 1. تسلسلات الأحماض الأمينية لببتيدات HPV 16 E6 المستخدمة لتحديد التسلسل الببتيدي المستضدي الأدنى والأمثل.
| نمط فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) | بقايا A A* | تسلسل |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | تألق ذاتي (FAF)Kالتعلم العميقالفيروس المخلوي (FV)VY |
| 31 | E6 45-54 (10) | الفلورة الذاتية (FAF)تتعلّم عميقتاللبلاب |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFأتعلم عميقتلفازVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | حمض الفوليكسيتوكين (CY)DLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | الفلورة الذاتية (FAF)سالتعلم العميقYVفي واي |
| 45 | E6 47-56 (10) | الفلورة الذاتية (FAF)ستعلّم عميقYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | Vتأجج (AF)تيك (TEIK)اللبلاب |
| 52 | E6 45-54 (10) | فلـفتتعلم عميقراللبلاب |
| 56 | E6 48-57 (10) | حمض الفوليكاعتلال الدماغ الرضحي المزمنلـKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | فVفأالتعلم العميقRلبلاب |
| 59 | E6 47-56 (10) | الفلورة الذاتية (FAF)نتعلم عميق (Deep Learning)فاللبلاب |
| 68 | E6 47-56 (10) | الفلورة الذاتية (FAF)جـتعلم عميقالفقاعة العصبية (NV)في واي |
| 73 | E6 45-54 (10) | مقياس التألق الذاتي (FAF)سDLCIVY |
* يظهر عدد الأحماض الأمينية بين قوسين.
^ تظهر بقايا الأحماض الأمينية المختلفة عن تلك الموجودة في الحاتمة HPV-16 E6 52-61 بخط عريض.
الجدول 2. تتابعات الأحماض الأمينية للببتيدات، من أنماط HPV عالية الخطورة والمتجانسة مع حاتمات خلايا T CD8 لبروتين E6 في HPV 16 في الموضع 52-61، والتي تم اختبارها لتقييم التعرف المتبادل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقليديًا، حاول علماء المناعة توصيف حاتمات الخلايا التائية الجديدة عن طريق تحفيز الخلايا التائية المعنية in vitro، وإجراء تجربة التخفيف المحدود لعزل مستنسخات الخلايا التائية النوعية للحاتمة. بعد ذلك، تم توصيف مستنسخات الخلايا التائية باستخدام مقايسة تحرر الكروم 8,9. ومع ذلك، فشلت العديد من المحاولات لأن ترددات الخلايا التائية قد تكون منخفضة جدًا بحيث لا يمكن عزلها، أو لأن عدد خلايا مستنسخات الخلايا التائية المتاحة لم يكن كافيًا لإتمام عملية التوصيف. وتتغلب الطريقة الموصوفة هنا على هذه القيود من خلال (1...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من خلال جائزة علماء الجمعية الأمريكية للسرطان (RSG-06-180-01-MBC) ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R01 CA143130 و UL1RR029884).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم عزل خلايا CD8 T cell | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| فيتوهيموجلوتينين (Phytohemagglutinin) | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| وسط Yssel’s medium | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% pooled human serum |
| صفيحة 96 بئراً ذات قاع مستدير | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| إنترلوكين-2 بشري مؤتلف (Recombinant human IL-2) | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| صفيحة 24 بئراً | Corning | 07-200-84 | |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (Phosphate-buffered saline) | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة أولي ضد IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة ضد IFN-γ مقترن بالبيوتين (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| صفيحة Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (Dimethyl Sulphoxide) | Sigma-Aldrich | D2650 | عبوة 100 ml |
| مصل بشري مجمع (Pooled Serum, human) | Atlanta Biologicals | S40510H | مثبط حرارياً |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| تويين-20 (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| طقم Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| ديامينوبنزيدين مستقر (Stable diaminobenzidine) | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| جهاز AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
المراجع
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
- Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
- Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
- Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
- Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
- Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
- Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
- Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
- Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
- Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
- Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
