ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويمكن استخدام الكروموسوم البكتيري للحفاظ على ستابلي الحمض النووي الأجنبية في نطاق الضخمة قاعدة 1. الاندماج في كروموسوم تلتف حول قضايا من قبيل التكرار البلازميد والاستقرار البلازميد، عدم التوافق البلازميد، والبلازميد التباين في عدد النسخ. هذا الأسلوب يستخدم integrase في مواقع محددة من بالعاثية المتسلسلة (Φ) C31 2،3. وintegrase ΦC31 يحفز إعادة التركيب مباشرة بين موقعين DNA محددة: attB وattP (34 و BP 39، على التوالي) 4. هذا التوحد هو مستقر ولا تعود 5. A "مهبط" (LP) التي تتكون من تسلسل الجين سبكتينوميسين للمقاومة، aadA (SPR)، وهاء في تم دمج القولونية ß غلوكورونيداز الجين (uidA) يحيط بها مواقع attP في صبغيات meliloti Sinorhizobium، anthropi Ochrobactrum، والأجرعية المورمة في المنطقة بين الجينات، وأناPC مكان، ومكان تيتا، على التوالي. س. ويستخدم meliloti في هذا البروتوكول. كما تم ناقلات المانحة للتعبئة التي تحتوي على مواقع attB المرافقة أحمر فلوري ستوفير بروتين (RFP) الجينات والجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي شيدت. في هذا المثال يتم استخدام الجنتاميسين pJH110 البلازميد المقاوم. قد يتم استبدال الجين RFP 6 مع تأنشا المطلوب باستخدام SPH أنا أولا والباسيفيكي بدلا من ذلك قد تأنشا الاصطناعية يحيط بها مواقع attB تكون شبه مستنسخ في ناقلات للتعبئة مثل pK19mob 7. هو الدافع وراء التعبير عن الجينات integrase ΦC31 (المستنسخة من pHS62 8) من قبل مروج أمريكا اللاتينية والكاريبي، على نطاق واسع المضيفة للتعبئة البلازميد pRK7813 9.
ويستخدم بروتوكول التزاوج tetraparental لنقل كاسيت المانحة إلى سلالة ليرة لبنانية وبذلك يحل محل علامات في تسلسل ليرة لبنانية مع كاسيت المانحة. هذه الخلايا هي ترانS-integrants. وتتشكل عبر integrants مع كفاءة نموذجي من 0.5٪. وتوجد عادة عبر integrants ضمن المستعمرات 500-1،000 1 فحص الحساسية للمضادات الحيوية أو بواسطة فحص الأزرق والأبيض باستخدام 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D-حمض الغلوكورونيك (X-الحلاوة). هذا البروتوكول يتضمن إجراءات التزاوج واختيار لخلق وعزل عبر integrants.
البروتوكول
1. إنتاج الثقافة
- إعداد وسائل الاعلام سائل معقم: TY 10 (5 جم / لتر تريبتون (3)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 0،44 كلوريد الكالسيوم غرام / لتر يذوى)، وLB 11 (10 جم / لتر تريبتون (5)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 5 ز / كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7).
- تطعيم من مستعمرة واحدة: SmUW227 (S. meliloti LP-السلالة: سيتم وصف البناء في مكان آخر، توتر تفاصيل البناء متوفرة عند الطلب) () في 5 مل من وسائل الاعلام TY مع 50 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين. تطعيم السلالات التالية في 5 م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنية IMCE يسمح التكامل الفعال للشريط الحمض النووي واحد attB يحيط في المكان، ليرة لبنانية من سلالة هندسيا سابقا. بمجرد أن يتم استنساخ التصور المطلوب بدلا من طلب تقديم العروض لإنشاء كاسيت المانحة، وهذه التقنية لا تتطلب اللاحقة تنقية الحمض النووي، وتحول، مما يجعلها قوية للغاية. فمن الأهمية بمكان أن يتم تضمين الضوابط نمو مناسب، لتكون على يقين من أن مقاومة المضادات الحيوية ويرجع ذلك إلى خلق عبر integrants وعوامل أخرى لا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
لسميث CM مارجريت لتوفير يرجى استنساخ integrase
بتمويل من:
الجينوم كندا / الجينوم المرج
NSERC اكتشاف ومنح المشروع الاستراتيجي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| الستربتومايسين عقار طبي | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | STP101 | |
| سبكتينوميسين | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | SPE201 | |
| جنتاميسين | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | CLR201 | |
| التتراسيكلين | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | TET701 | |
| الكانامايسين | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | KAN201 | |
| الصف أجار البكتريولوجية | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | AGR001 | |
| تريبتون | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | TRP402 | |
| خلاصة الخميرة | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | YEX401 | |
| كلوريد الصوديوم | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | SOD001 | |
| كلوريد الكالسيوم | Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. | CCL444 | |
| X-الحلاوة | الذهب شركة التكنولوجيا الحيوية | G1281C1 | |
| كولاي MT616 سلالة | متوفرة عند الطلب | تستخدم أيضا خارج من مختبرنا | |
| كولاي pJC2 سلالة | في المنزل، والمتاحة حسب الطلب | ||
| كولاي pJH110 سلالة | في المنزل، والمتاحة من قبل requesتي | ||
| SmUW227 سلالة | في المنزل، والمتاحة حسب الطلب |
المراجع
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
