ونحن تصف طريقة لتوليد خلايا تي التنظيمية، والذاكرة وساذجة من متبرع الدم البشري واحد. ويمكن مقارنة Tregs الاستقطاب ثم إلى مجموعات فرعية أخرى في مجموعة متنوعة من التطبيقات الوراثية والوظيفية مع تجانس الجينية، بما في ذلك فحص قمع بالتفصيل هنا أيضا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تطوير وصيانة CD4 + التنظيمية مناعة الخلايا التائية (Tregs) المساهمة في تحمل الطرفية اللازمة للبقاء في التوازن المناعية مع الكم الهائل من مستضدات الذات وcommensal في وعلى الجسم البشري. يمكن أن الاضطرابات في التوازن بين Tregs والتهابات الخلايا التائية التقليدية يؤدي في الباثولوجيا المناعية أو السرطان. على الرغم من أن ثبت الحقن العلاجية للTregs أن تكون فعالة في الفئران نماذج من التهاب القولون 1، النوع الأول من مرض السكري 2، والتهاب المفاصل الروماتيزمي والكسب غير المشروع مقابل المضيف المرض، و 4 عدة فروق جوهرية في مجال البيولوجيا Treg الإنسان مقابل 5 الماوس وبذلك حالت دون حتى استخدام السريري. استلزم عدم توافر العدد الكافي، والنقاء، والاستقرار، وخصوصية صاروخ موجه من Tregs العلاجية منصة حيوية للتنمية البشرية على Treg التي لتحسين الظروف لتوسعها المجراة سابقا 6.
مد هنا نحنescribe وسيلة للتمايز Tregs التي يسببها (iTregs) من نفس واحدة الإنسان المانحة الدموية المحيطية والتي يمكن تقسيمها إلى أربع مراحل: عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى، واختيار المغناطيسي للخلايا CD4 + T، في خلية ثقافة المختبر، ومضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من مجموعات فرعية الخلايا التائية. منذ توقيع نسخ Treg عامل forkhead P3 مربع (FoxP3) هو عامل النسخ التنشيط التي يسببها البشر (7) ويجب عدم استخدام أي علامة أخرى فريدة من نوعها موجودا، لجنة توافقية من علامات لتحديد الخلايا التائية مع النشاط المكثف. بعد ستة أيام في الثقافة، لا يمكن ترسيم الخلايا في نظامنا إلى الخلايا التائية السذاجة، وخلايا تي الذاكرة أو iTregs على أساس التعبير النسبية من CD25 و CD45RA. كما الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة لديها متطلبات مختلفة عن الاستقطاب وplasticities 8، قبل فرز السكان تي الخلية الأولية إلى + CD45RA وCD45RO + يمكن فرعية باستخدام البريد لدراسة هذه التناقضات. بما يتفق مع الآخرين، لدينا CD25 مرحبا CD45RA - iTregs مستويات عالية من التعبير عن FoxP3 9، GITR وCTLA 4-11 وانخفاض مستويات CD127 12. بعد FACS من كل السكان، ويمكن استخدام الخلايا الناتجة في فحص القامع الذي يقيم القدرة النسبية لتأخير انتشار carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) المسمى ذاتي الخلايا التائية.
البروتوكول
1. عزلة الإنسان الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من معطف بافي
- الحصول على وحدة واحدة من معطف بوفي من المستشفى أو في مكان قريب موقع مركز الدم. مركزنا الدم يوفر لنا حول 40-60 مل من معطف بوفي لكل وحدة تم الحصول عليها من المتبرعين بالدم العادي.
- صب الدم الى مشبع 500 مل زجاجة تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة لتخفيف الغلالة الشهباء. وينبغي أن الحجم النهائي من بافي PBS معطف + يكون 250 مل.
- شغل 10 50 أنابيب مخروطية كل مل مع 20 مل من محلو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في حين نقل Treg يحمل وعدا العلاجية الهائلة في مجال مكافحة الكسب غير المشروع الرفض المناعة الذاتية وغيرها من الاضطرابات المناعية أو التهابات بوساطة، وأساليب لجيلهم كفاءة وصيانة مستقر حتى الآن لم يتم تطويرها. كما 1-5٪ فقط من تعميم خلايا تي هي Tregs، توسعها للرقابة والمفاضلة يتغلب على هذه ندرة رادعا رئيسيا لتنفيذ Tregs إلى العيادات الطبية. من ناحية أخرى، كما تعلمنا من تجربة TGN1412 13، فمن الضروري علميا وأخلاقيا إلى فهم عميق للأحداث الجزيئية التي تنسق خلية القرارات تي مصير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
والكتاب أود أن أشكر جنيفر غريبة وبومان جريج على المساعدة التي قدموها مع تحليل التدفق الخلوي والفرز. وأيد هذا العمل من قبل عدد المنح المعاهد الوطنية للصحة 2P20 RR020171 من NCRR وجامعة للأموال بدء التشغيل كنتاكي إلى وزير الخارجية؛ GIE يقر بدعم من زمالة دراسات عليا الرئاسي والزمالة الفرصة كنتاكي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| Lymphoprep | محور الدرع | 1114547 | تبقى في درجة حرارة الغرفة |
| تبريد مقاعد البدلاء أعلى جهاز طرد مركزي | إيبندورف | 5810R | |
| مشرق سطر عدادة الكريات | Hausser العلمية | 3110 | |
| CD4 + T EasySep الإنسان كيت إثراء خلية | وقف سيل تكنولوجيز | 19052 | |
| CD4 EasySep ذاكرة الإنسان + T كيت إثراء خلية | وقف سيل تكنولوجيز | 19157 | |
| CD4 EasySep السذاجة الإنسان + T كيت إثراء خلية | وقف سيل تكنولوجيز | 19155 | |
| من السهل الكبير EasySep ماجصاف | وقف سيل تكنولوجيز | 18001 | فضة |
| 5 مل البوليستيرين القاع جولة أنابيب | دينار بحريني الصقر | 352008 | |
| 15 جهاز طرد مركزي أنابيب البولي بروبيلين مل | VWR | 89004-368 | |
| 14 مل من مادة البولي بروبيلين المستديرة القاع أنابيب | دينار بحريني الصقر | 352059 | |
| 50 جهاز طرد مركزي أنابيب البولي بروبيلين مل | VWR | 89004-364 | |
| الإنسان لمكافحة الأجسام المضادة CD3 | الحيوي X خلية | BE0001-2 | استنساخ: OKT3 |
| 24 البوليستيرين خلية حسنا لوحة الثقافة | دينار بحريني الصقر | 353047 | |
| 96 نسيج القاع جولة حسنا لوحة الثقافة | جرينير بيو واحد | 650180 | |
| RPMI 1640 مع Glutamax-I والواق HEPES | Gibco | 72400 | |
| الجنين المصل البقري (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-المركابتويثانول | سيغما | M7522 | |
| المؤتلف الإنسان TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| المؤتلف الإنسان IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| البقري ألبومين المصل (BSA) | النائب Biomedicals المؤتمر الوطني العراقي. | 810531 | |
| 0.5 متر EDTA | Amresco | E177 | |
| الماوس المضادة للالإنسان CD25-PE | Miltenyi بيوتيك | 130-091-024 | استنساخ: 4E3 |
| الماوس المضادة للالإنسان CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | استنساخ: HI100 |
| الماوس المضادة للالإنسان CD127-APC | Miltenyi بيوتيك | 130-094-890 | استنساخ: MB15-18C9 |
| الدناز الثاني | Mف Biomedicals المؤتمر الوطني العراقي. | 190370 | |
| MoFlo تدفق عداد الكريات | بيكمان كولتر | ||
| FlowJo برامج | شجرة نجمة، وشركة | ||
| برامج الخلية كويست برو | العلوم البيولوجية دينار بحريني | ||
| الوليد العجل المصل | Gibco | 16010 | |
| L-الجلوتامين | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace تكاثر الخلايا CFSE كيت | إينفيتروجن | C34554 | |
| Treg الخرز المفتش قمع | Miltenyi بيوتيك | 130-092-909 | |
| البنسلين الستربتوميسين | Gibco | 15140 | |
| 40 خلية نايلون ميكرومتر الانفعالإيه | دينار بحريني الصقر | 352340 |
المراجع
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
