مقالة منهجية

عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي

DOI:

10.3791/3788

⸱

أكتوبر 3, 2012

 ,  , 
1Department of Pathology, National Prion Disease Pathology Surveillance Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Neurology, National Prion Disease Pathology Surveillance Center, Case Western Reserve University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوع جديد من بروتين بريون الخلوي (بي ار بي C) وقد تم مؤخرا المحددة في العقول البشرية غير مصاب باستخدام الأساليب المذكورة هنا. ويمكن استخدام هذه الأساليب لعزل الأنواع المختلفة بي ار بي، في حين أن بعض من هم من المفيد أيضا في عزل المجاميع الأخرى من البروتين تتجمع العقول البشرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحدث المركزي في التسبب في الأمراض البريونية ينطوي على تحويل المضيف ترميز البروتين بي ار بي الخلوية بريون C المسببة للأمراض في شكل الإسوي في بي ار بي SC 1. بي ار بي C هو المنظفات للذوبان وبروتين حساسة للK (PK)-الهضم، في حين تشكل المنظفات بي ار بي برأسية غير قابلة للذوبان المجاميع ومقاومة جزئيا إلى PK 2-6. ومن المعروف أن تحويل C بي ار بي بي ار بي إلى اتفاقية استكهولم لإشراك الانتقال بتكوين لα β-حلزونية لورقة هياكل البروتين. ومع ذلك، لا تزال في مسار الجسم الحي غير مفهومة. A الذاتية مؤقت بي ار بي برأسية والمتوسطة * بي ار بي أو "بريون الصمت"، لم يتم بعد تحديدها في الدماغ غير مصاب 7.

باستخدام مزيج من النهج البيوفيزيائية والكيمياء الحيوية، وحددنا المجاميع غير قابلة للذوبان بي ار بي C (C iPrP المعينة) من أدمغة الثدييات غير مصاب ومثقف الخلايا العصبيةخلايا 8 و 9. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لهذه الأساليب، بما في ذلك في تنبيذ فائق العازلة المنظفات والترسيب السكروز التدرج خطوة، وحجم الإقصاء اللوني، iPrP تخصيب اليورانيوم بحلول البروتين الجيني 5 (g5p) التي تربط خصيصا لأشكال بي ار بي تغيير هيكليا 10، وPK المعاملة. مزيج من هذه الأساليب ليس فقط غير قابلة للذوبان يعزل بي ار بي بي ار بي برأسية والمجاميع C ولكن أيضا للذوبان بي ار بي oligomers C من دماغ الإنسان العادي. منذ بروتوكولات الموصوفة هنا قد استخدمت لعزل كل من بي ار بي برأسية من العقول المصابة وiPrP C من العقول غير مصاب، لأنها توفر لنا فرصة لمقارنة الاختلافات في الميزات الفيزيائية، السمية العصبية، والعدوى بين الأشكال الإسوية اثنين. ومثل هذه الدراسة تحسن كثيرا فهمنا لمسببات الأمراض المعدية والبروتينية. علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للC iPrP غير واضحة في الوقت الحاضر. والجدير بالذكر أن في A-ID حديثاوجدنا entified المرض البريوني البشري ووصف بنسب مختلفة البروتيني حساسة prionopathy، جديد برأسية بي ار بي أن تشارك سلوك متفاعل مناعيا وتجزئة C مع iPrP 11 و 12. وعلاوة على ذلك، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن iPrP C هو أهم الأنواع التي تتفاعل مع بروتين اميلويد β في مرض الزهايمر 13. في نفس الدراسة، تم استخدام هذه الأساليب لعزل المجاميع Abeta وoligomers في مرض الزهايمر 13، مما يدل تطبيقها على المجاميع البروتين غير بريون المشاركة في الاضطرابات العصبية الأخرى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد جناسة الدماغ والمنظفات للذوبان (S2) وغير القابلة للذوبان، الكسور (P2)

  1. تأخذ 100 ملغ المجمدة أنسجة المخ الإنسان وإضافة 100 ميكرولتر العازلة تحلل (10 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.5٪ Nonidet P-40 (NP-40)، EDTA 0.5٪، ودرجة الحموضة 7.4).
  2. التجانس على الجليد باستخدام مدقة يقودها موتور اللاسلكي، تجميده في الثلج الجاف لمدة 5 دقائق والتجانس باستخدام مدقة مرة أخرى يقودها اليدين أولا ثم من قبل السيارات، وإضافة 300 ميكرولتر العازلة تحلل أو 800 ميكرولتر (هذا هو إما ال 20 ٪ أو 10٪ جناسة الدماغ الكلي، على التوالي).
  3. أجهزة الطرد المركزي ل20٪ أو 10٪ جناسة الدماغ الكلي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمع طاف (S1) باستخدام أجهزة الطرد المركزي الفوق.
  4. نابذة فائقة السرعة S1 10٪ في 35000 دورة في الدقيقة (100،000 XG) في الدوار SW55 (بيكمان كولتر، فولرتون، CA) لمدة 1 ساعة عند C. ° 4 نقل supernatants (S2) التي تحتوي على جزء المنظفات للذوبان في أنبوب نظيفة. إعادة تعليق الكريات التي تحتوي على منظفات غير قابلة للذوبانالكسر (P2) في 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر العازلة تحلل لجعل 10 - أو 5 أضعاف إعداد المركزة.
  5. للهضم-PK، احتضان العينة مع نفس المبالغ من PK في 50 ميكروغرام / مل في C ° 37 لمدة 1 ساعة لكل من الكسور وS2 P2. إضافة الفلوريد phenylmethylsulfonyl في تركيز النهائي من 5 ملم وكميات متساوية من العازلة عينة SDS (3٪ SDS، 2 مم EDTA، β-4٪ المركابتويثانول، الجلسرين 10٪، و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 6.8) لإنهاء عملية الهضم PK. يغلي لمدة 10 دقيقة عينات وتبريدها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. انهم مستعدون لغربي النشاف.

2. الترسيب السرعة في التدرجات الخطوة السكروز

  1. احتضان 450 ميكرولتر S1 20٪ مع حجم مساو من sarkosyl 2٪ في H 2 O لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  2. إضافة 0.5 مل من كل 60٪، 30٪، 25٪، 20٪، 15٪، 10٪ والسكروز في أنبوب بيكمان بسعة 5 مل القصوى.
  3. تحميل 0.4 مل من S1 إلى أعلى تدرجات 10-60٪ الخطوة السكروز.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 48،000 دورة في الدقيقة (200،000 XG، SW55 الدوار) لمدة 1 ساعة، في 4 درجات مئوية.
  5. جمع 283 ميكرولتر كل جزء من رأس الأنبوب والحصول على 12 الكسور في المجموع.
  6. يستغرق 20 ميكرولتر من كل جزء إلى أنبوب إيبندورف جديدة، إضافة 20 ميكرولتر العازلة عينة، وتغلى لمدة 10 دقيقة.
  7. عينات بارد لمدة 4 دقائق في غطاء محرك السيارة، أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة ودوامة لهم. تحميل عينات على هلام مسبقة الصب.

3. حجم الاستبعاد اللوني

  1. استخدام الخرز Superdex 200 HR (فارماسيا، أوبسالا، السويد) في عمود × 1 30 سم لتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات من جزيئات بي ار بي.
  2. سبع علامات الكتلة الجزيئية (سيغما، وسانت لويس، MI) بما في ذلك الأزرق دكستران (2،000 كيلو دالتون)، ثايروجلوبولين (669 كيلو دالتون)، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)، β-الأميليز (200 كيلو دالتون)، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون)، الزلال ( يتم تحميل 66 كيلو دالتون)، والكربونيك الأنهيداز (29 كيلو دالتون) بشكل مستقل في تركيزات موصى بها من قبل سيجما حجم العينة في 200 ميكرولتر.
  3. حجم شطف من DEXT الزرقاءيستخدم ركض إلى تحديد حجم الفراغ (V 0 = 8.45 مل) وإجمالي حجم (V = 24 ر مل) يتم توفيرها من قبل المالك المنتج. تحسب وحدات التخزين شطف الذروة (V ه) من كروماتوغرام ومحتجزات كسور. يتم احتساب K AV، معامل قسم (تحديد السلوك العينة)، وذلك باستخدام المعادلة: K AV = (V ه - V 0) / (V ر - V 0). يتم تحديد منحنى المعايرة من قبل المتهم بالتآمر في AV K المعايير البروتين ضد MW سجل للمعايير 8.
  4. يتم تقييم الوزن الجزيئي (MW) من الأنواع المختلفة تعافى بي ار بي في أجزاء مختلفة FPLC وفقا لمنحنى المعايرة ولدت مع جل معايير الترشيح المختلفة.
  5. تضخ 200 S1 ميكرولتر العازلة تحلل في sarkosyl تحتوي على 1٪ في العمود لكل التشغيل.
  6. يتم تنفيذ اللوني في نظام FPLC (GE للرعاية الصحية) بمعدل تدفق 0.25 مل / دقيقة وجزءق من 0.25 مل يتم جمع كل باستخدام أحد هواة جمع الكسر (أمرشام العلوم البيولوجية، RediFrac).
  7. احتضان 0،125 مل كل جزء مع 0.5 الميثانول قبل المبردة في مل -20 ° C لمدة 2 ساعة.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينات في 13000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في ميكروسنتريفوج الفوق. تجاهل طاف بيليه و resuspend في 20 ميكرولتر العازلة عينة SDS على النحو المذكور أعلاه، يغلي لمدة 10 دقيقة، باردة لدرجة حرارة الغرفة، تحميلها على مادة هلامية مسبقة الصب.

4. القبض على بي ار بي من g5p

  1. الجزيء g5p (100 ميكروغرام) (يرجى تقديم Kneale بواسطة جيف الدكاترة. وMcGeehan جون من جامعة بورتسموث، المملكة المتحدة) هو مترافق إلى 7 × 10 8 tosyl تنشيط الخرز المغناطيسي من احتضان 100 ميكروغرام g5p و 350 ميكرولتر الخرز g5p في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في C ° 37 لمدة 20 ساعة. جذب g5p-الخرز إلى جدار من أنابيب إيبندورف بالقوة المغناطيسية الخارجية ثم قم بإزالة كافة الحل. غسل الخرز مع 1 مل من PBS تحتوي على0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لثلاث مرات.
  2. احتضان حبات g5p، مترافق في 1 مل من 0.2 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 تحتوي على 0،1٪ BSA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة لمنع غير محددة وملزمة وثم تغسل حبات مع 1 مل من PBS تحتوي على 0،1٪ للBSA ثلاث مرات على النحو المذكور أعلاه. إزالة الحل وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني في الخرز. حبات g5p المعدة مستقرة لمدة لا تقل عن 3 أشهر في C. ° 4
  3. يتم تنفيذ القبض على بي ار بي من g5p من احتضان 100 ميكرولتر أو الكسور S1 P2 مع 60 ميكرولتر الخرز مترافق g5p (10 ميكروغرام بروتين / 6 X 10 7 حبات) في 1 مل من العازلة ملزمة (3٪ توين-20، NP-3٪ 40 في PBS، ودرجة الحموضة 7.5).
  4. بعد الحضانة مع التناوب المستمر لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وجذبت بي ار بي التي تحتوي على الخرز g5p إلى جدار من أنابيب إيبندورف بالقوة المغناطيسية الخارجية، مما يسمح لسهولة إزالة جميع الجزيئات غير منضم في الحل.
  5. بعد ثلاثة يغسل غسيل العازلة في (2٪ توين-20 و 2٪ NP-40 في PBS، الرقم الهيدروجيني 7.5)، يتم جمع حبات g5p ويسخن في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت عينة SDS (3٪ SDS، 2 مم EDTA، الجلسرين 10٪، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8).
  6. بعد تبريد العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وطرد العينات في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وsupernatants مستعدون لغربي النشاف.

5. الغربية التنشيف

  1. تحميل عينات المغلي في المخزن المؤقت عينة SDS على 15٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك الفرقان مسبقة الصب المواد الهلامية (بيو راد) في 150 دقيقة لV 80 ~.
  2. يتم نقل البروتينات على المواد الهلامية لمدة 2 ساعة PVDF في 70V.
  3. بعد حجب الأغشية في الحليب 5٪ في تريس ملحي يحتوي 0.01٪ توين-20 (TBS-T)، وحضنت الأغشية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الابتدائي 3F4 الأجسام المضادة أحادية المنشأ أو بولكلونل (1:40،000)، 1E4 (1 : 1،000)، ومكافحة N 8 (1:6،000)، أو مضادة للC 8 (1:6،000) ليحقق في جزيء بي ار بي.
  4. بعد الحضانة مع HRP، مترافق المضادة للمفتش الماوس الأغنام في1:3000، أو حمار المضادة للأرنب مفتش في 1:3،000 نطاقات بي ار بي وتصور على فيلم كوداك باستخدام ECL بالإضافة إلى ذلك، وفقا للبروتوكول الشركة المصنعة.

6. ممثل النتائج

مقارنة عينات CJD متفرقة، تم الكشف عن كمية صغيرة من C iPrP في جزء P2 في العقول العادية على الرغم من أن تم استرداد معظم C بي ار بي في جزء S2 (الشكل 1). كما سبقت الإشارة 8، حسابات iPrP لحوالي 5-25٪ من مجموع بما في ذلك بي ار بي طول كامل والأنواع N-عضال اقتطاع.

كشفت التحاليل باستخدام الترسيب السكروز التدرج خطوة في حين تم استرداد معظم C بي ار بي من غير CJD العقول في الكسور الأعلى 1-3، كما تم الكشف عن كميات صغيرة من بي ار بي في أسفل 9-11 الكسور التي تحتوي على المجاميع الكبيرة عادة 8 (الشكل 2).

رن مجموعة متنوعة من الأنواع برأسية بي ار بيجي من مونومرات، تم عزل oligomers صغيرة إلى أكبر المجاميع عن طريق الترشيح هلام في الدماغ مع مرض كروتزفيلد جاكوب (الشكل 3A). ومع ذلك، تم الكشف أيضا على كمية صغيرة من أكبر المجاميع مع الوزن الجزيئي أكبر من 2،000 كيلو دالتون في الكسور غير قابلة للذوبان من العقول العادية (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، لم dimers وtetramers من C بي ار بي فقط في الكشف عن الكسور غير قابلة للذوبان ولكن أيضا في أجزاء القابلة للذوبان (الشكل 3B 3C و).

وبعد العلاج PK PNGase، تم الكشف عن بي ار بي استولت عليها g5p مع الأجسام المضادة ضد PrP97 1E4-105 8. ثلاثة أجزاء أساسية PK-مقاومة يسمى بي ار بي * 20، * 19 بي ار بي، وتم الكشف عن بي ار بي * 7، المهاجرة في كيلو دالتون 20 ~، ~ ​​~ كيلو دالتون 19 و كيلو دالتون 7 على التوالي (الشكل 4، اللوحة اليمنى). ومع ذلك، لم يتم اكتشاف أي بي ار بي عندما كان الضد 1E4 مسبقا حضنت مع الببتيد الاصطناعية التي لديها تسلسل IDENTكال لحاتمة 1E4 (الشكل 4، وسط لوحة)، مشيرا إلى أن فرق الكشف عنها بواسطة 1E4 هي شظايا بي ار بي. وعلاوة على ذلك، فإن الأجسام المضادة المضادة للكشف C قطعتان بي ار بي المهاجرة في مختلف كيلو دالتون 18 ~ (بي ار بي * 18) و~ 12-13 كيلو دالتون (PrP-CTF12/13)، بالإضافة إلى بي ار بي * 20 (الشكل 4، اللوحة اليمنى).

figure-protocol-1
الشكل 1. الكشف عن وC iPrP برأسية iPrP. بعد العلاج مع F PNGase في 10/1 من حجم تفاعل الكلي في C ° 37 لمدة 1 ساعة لإزالة glycans من البروتين، والكامل طول أو N-عضال معزولة اقتطاع الأنواع بي ار بي في الكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان (S2 وP2) تنبيذ فائق في عينات من المخ من التحكم العادية (CTL) وCJD متفرقة (sCJD) تم الكشف عن 3F4 مع ضد 112-PrP106 (اللوحة اليسرى)، ومكافحة N-40-ضد PrP23 (وسط لوحة)، والمضادة للC ضد بي ار بي220-231 (اللوحة اليمنى). في عينات CTL، تم الكشف عن كمية صغيرة من بي ار بي في P2، في حين أن كمية كبيرة موجودة في S2. في المقابل، تم الكشف عن أكثر من P2 بي ار بي في في S2 في عينات sCJD.

figure-protocol-2
الشكل 2. الترسيب من بي ار بي في التدرجات خطوة السكروز. تم الكشف عن الكسور في بي ار بي الفردية من 1 إلى 11 من غير CJD S1 عينة من المخ مع النشاف الغربية 3F4. على الرغم من أن تم الكشف عن معظم C بي ار بي في الكسور الأعلى 1-3، كما لوحظ كميات صغيرة من بي ار بي في أسفل الكسور 9-11. وعلاوة على ذلك، فإن نمط النطاقات من بي ار بي من أعلى وأسفل مختلفة: بي ار بي تعافى في الكسور الأعلى له الفرقة المهيمنة العلوي بينما تعافى بي ار بي في أسفل الكسور لديه أدنى الفرقة المهيمنة. تم تحميل A PK المعاملة بي ار بي برأسية كعنصر تحكم على الجانب الأيمن من لطخة.


الشكل 3. الكشف عن ذوبان وغير قابلة للذوبان oligomers C بي ار بي. تم فصل القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان بي ار بي C من العقول البشرية العادية من تنبيذ فائق وثم تعرض لترشيح الجل على التوالي. تم قياس أحجام الجزيئات الفردية من الكسور عن طريق تشغيل مجموعة من علامات الكتلة الجزيئية. (A) الأنواع برأسية بي ار بي من عينات المخ sCJD. تم الكشف عن اثنين من أعداد الأنواع بي ار بي: الكسور الترشيح هلام 49 حتي 65 وتحتوي على مونومرات oligomers الصغيرة، في حين كسور 27-33 تحتوي على المجاميع الكبيرة. تم الكشف عن الأنواع C بي ار بي من كسر للذوبان (S2) (B) وغير قابلة للذوبان جزء (P2) (C) من الضوابط العادية. تم بحثها مع الأجسام المضادة بي ار بي 3F4. تم الكشف عن Dimers (جزء 55) وtetramers (جزء 51) من بي ار بي ليس فقط في P2 ولكن أيضا في S2 من sampl الدماغ العاديES (B و C). تم الكشف عن المجاميع الكبيرة فقط في P2 من العينات العادية (C).

figure-protocol-3
الشكل 4. الكشف عن مختلف أجزاء iPrP PK-مقاومة في g5p التخصيب الاستعدادات من العقول البشرية العادية. وعولج عينات أثرى g5p مع PK وF PNGase قبل النشاف الغربية مع التحقيق 1E4 (اللوحة اليسرى)، 1E4 قبل حضنت مع الببتيد الاصطناعية التي كان لها تسلسل مطابقة للحاتمة 1E4 (وسط لوحة)، و (C المضادة لل اللوحة اليمنى). 1E4 الكشف عن ثلاث PK مقاومة للشظايا بي ار بي بي ار بي يسمى * 20، * 19 بي ار بي، وبي ار بي * 7 (اللوحة اليمنى). بعد حجب 1E4 مع الببتيد، تم الكشف عن أي بي ار بي الدقة (لوحة الأوسط)، مشيرا إلى أن الكشف عن عصابات مع 1E4 هي شظايا بي ار بي. كشفت المضادة للC بالإضافة إلى ذلك قطعتان بي ار بي PK-مقاومة يسمى بي ار بي بي ار بي * 18-CTF12 و/13، بالإضافة إلى * بي ار بي 20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مزيج من النهج ذكرت هنا غير قابلة للذوبان يعزل باستمرار بي ار بي المجاميع C وقابل للذوبان oligomers بي ار بي C من دماغ الإنسان العادي. تنبيذ فائق في 100،000 x ج لمدة ساعة واحدة هو أسلوب الكلاسيكية التي استخدمت على نطاق واسع لفصل برأسية غير قابلة للذوبان بي ار بي بي ار بي من ذوبان C 14. في حين أنه من كفاءة، واحدة من يحذر هو تجنب التلوث أثناء سحب طاف (S2) بعد الطرد المركزي. منذ الشخصي هلام من C iPrP يختلف عن ذلك من C ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ال الكتاب ممتنون للدماغ والعمود الفقري الإنسان مركز الموارد الموائع (لوس أنجلوس، CA) لتوفير عينات الدماغ العادي. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01NS062787، ومؤسسة CJD بالأمان البيولوجي، التحالف، فضلا عن مركز جامعة للشيخوخة والصحة بدعم من مؤسسة ماكجريجور وصندوق الرئيس الكمالية (كيس ويسترن ريزرف) .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
Phenylmethylsulfonyl فلوريد سيغما الدريخ P7626 72 مم في بروبانول-2
بروتين K سيغما الدريخ P2308 2 ملغ / مل في H 2 O
PNGase F نيو انغلاند Biolabs MWGF200
LE-80K نابذة فائقة السرعة، SW55 الدوار بيكمان كولتر الجزء رقم 365668، 356860
Superdex 200 HR الخرز GE للرعاية الصحية 17-1088-01
AKTA FPLC النظام GE للرعاية الصحية 18-1900-26
علامات الوزن الجزيئي سيغما الدريخ MWGF200 تباينت
Dynabeads M-280 الخرز المغناطيسي إينفيتروجن 143-01
3F4 الأجسام المضادة كوفانس SIG-39600
1E4 الأجسام المضادة خلية العلوم M1840
هلام استعداد 15٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك مسبقة الصب المواد الهلامية بيو راد 345-0020

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
  2. Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
  3. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
  4. Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
  5. Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
  6. Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
  7. Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
  8. Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
  9. Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
  10. Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
  11. Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
  12. Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
  13. Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
  14. Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
  15. Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PrP Gene 5 K PrP

مقالات ذات صلة