مقالة منهجية

الكولسترول الدفق الفحص

DOI:

10.3791/3810

⸱

مارس 6, 2012

 ,  , 
1Baker IDI Heart and Diabetes Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم فحص الكولسترول لquantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف وقدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من خلايا وصفها مع موازنة، والكولسترول الكولسترول بين تجمعات داخل الخلايا وإطلاق الكوليسترول في الدم إلى متقبل خارج الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب الحفاظ على نسبة الكولسترول من الخلايا في حدود ضيقة جدا، وكثيرا جدا أو قليلا جدا نسبة الكولسترول في نتائج خلية في اختلال الأغشية الخلوية، وموت الخلايا المبرمج ونخر 1. يمكن للخلايا الكولسترول مصدر من تركيب الخلايا والبروتينات الدهنية من البلازما، وعلى حد سواء مصادر كافية لتلبية متطلبات تماما الخلايا للكولسترول. وينظم بإحكام عمليات تركيب الكولسترول وامتصاص وأوجه القصور من الكوليسترول هي 2 نادر. الكولسترول الزائد هو أكثر 3 المشتركة المشكلة. مع استثناء من خلايا الكبد، وبعض الخلايا درجة قشرة الكظر، والخلايا غير قادرة على تتحلل الكولسترول. خلايا ديك خياران للحد من محتواها الكولسترول: لتحويل الكولسترول إلى استرات الكوليسترول، وهو خيار مع قدرة محدودة على الحمولة الزائدة الخلايا مع استرات الكوليسترول أيضا السامة، وهروب رأس المال الكولسترول، وهو خيار مع قدرة غير محدودة على الأرجح. هروب رأس المال الكولسترول هي المواصفاتIFIC العملية التي يتم تنظيمها من قبل عدد من شركات النقل داخل الخلايا، مثل ملزم للاعبي التنس المحترفين كاسيت نقل البروتينات A1 ​​(ABCA1) وG1 (ABCG1) وB1 زبال نوع المستقبلة. ومتقبل طبيعي من الكوليسترول في بلازما عالية الكثافة (HDL) ومنظمة العفو الدولية ئي.

تم تصميم فحص الكولسترول هروب رأس المال إلى quantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف. فهو يقيس قدرة الخلايا للحفاظ على هروب رأس المال الكوليسترول و / أو قدرة على قبول يقبلون بلازما الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من الخطوات التالية. الخطوة 1: وصفها الكولسترول الخلوي من خلال إضافة إلى مصل الكوليسترول المسمى المحتوية على المديين المتوسط ​​واحتضان مع الخلايا لمدة 24-48 ساعة. ويمكن الجمع بين هذه الخطوة مع التحميل من الخلايا التي تحتوي على الكوليسترول في الدم. الخطوة 2: حضانة الخلايا في مصل الدم خالية من المتوسط ​​للتوازن الكوليسترول باللقاء بين جميع أحواض الكولسترول بين الخلايا. ويمكن الجمع بين هذه المرحلة مع تفعيل الفصل الخلويةolesterol النقل. الخطوة 3: حضانة الخلايا مع متقبل خارج الخلية وتحديد الكميات من حركة الكولسترول من الخلايا التي تحمل علامات للمتقبل. إذا تم استخدام السلائف الكولسترول لتسمية الكولسترول تصنيعه حديثا، وهي الخطوة الرابعة، وتنقية من الكوليسترول، قد يكون مطلوبا.

الفحص توفر المعلومات التالية: (ط) كيف يمكن لعلاج خاص (طفرة، ضربة إلى أسفل، overexpression 1 أو علاج أ) يؤثر على قدرة الخلية إلى هروب رأس المال ونسبة الكولسترول (II) كيفية قدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول متضرر من المرض أو العلاج. وغالبا ما تستخدم هذه الطريقة في سياق البحوث القلب والأوعية الدموية، والاضطرابات الأيضية والاعصاب، والأمراض المعدية والصحة الإنجابية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد [H 3] الكوليسترول

  1. في غطاء محرك السيارة دخان، الاستغناء عن المبلغ المطلوب من [3 H] الكولسترول في أنبوب 1،5 microfuge مل (0.5 مطلوب μCi (19 kBq) لكل بشكل جيد لفحص نموذجي).
  2. إذا [3 H] معلقة الكوليسترول في التولوين، يجف عليه تماما مع غاز N2 وresuspend مع الإيثانول بنسبة 100٪ لتركيز النهائي من 1 μCi (37 kBq / ميكرولتر. دوامة ويخلط جيدا.

2. خلايا الطلاء ووسمها نسبة الكولسترول في الدم الخلوية

وقد تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام أنواع الخلايا التالية: حيدات الإنسان 4،5، THP-1-الضامة الإنسان الوحيدات 6،7،8، RAW 264.7 الضامة الفئران 5،9،10،11، خلايا هيلا 12، الإنسان الوريد السري البطانية الخلايا (HUVEC)، BHK-21 خلايا 9، الخلايا الليفية الإنسان والفأر 13،14، HepG2 الخلايا سرطانة الكبد البشري 15 و، في صيغة معدلة، من الصفائح الدموية <سوب> 16.

  1. Resuspend الخلايا واحصروهم. خلايا لوحة في 12-جيدا لوحات في كثافة 0.2x10 النهائي من 6 خلايا لكل بئر في المتوسط ​​0.9 مل كاملة. وسوف تستمر الخلايا تنمو وستصل إلى 0.8x10 6 خلايا لكل بئر بحلول موعد التجربة هروب رأس المال. عن الخلايا التي لا تفرق، مثل خلايا متمايزة THP-1، يجب أن تكون كثافة بذر 0.8x10 6 خلايا لكل بئر. إذا باستخدام 6 - لوحات أو 24 أيضا، مزدوجة أو نصف عدد الخلايا لكل بئر على التوالي. وينبغي أن عدد الآبار تكون كافية لقرارات quadruplicate لكل حالة تجريبية.
  2. إذا كان مطلوبا تمايز الخلايا THP-1، إضافة سلطة النقد الفلسطينية (نهائي تركيز 0.1 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام عن 48-72 ساعة.
  3. إضافة قسامة صغيرة من وسائل الاعلام في أنبوب microfuge التي تحتوي على [3 H] الكوليسترول في الدم.
  4. غسل وجهي أنبوب مع وسائل الإعلام قبل أن يضيف [3 H] الكولسترول في قسامة منفصلة من وسائل الإعلام كاملة (100 ميكروليتر / جيد).
    5. <لى> إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على [3 H] الكولسترول في الآبار مع الخلايا (الحجم النهائي للبئر هو 1 مل). إذا لم يكن يحتاج علاج الخلايا قبل وضع العلامات، قد يكون مطلي الخلايا في المتوسط ​​[H 3] التي تحتوي على الكوليسترول في الدم.
  5. احتضان خلايا لمدة 48 ساعة في خلية ثقافة حاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2).

3. موازنة الحضانة

  1. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 48 ساعة، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. تأكد من أنهم يتمتعون بصحة جيدة ونحن في نقطة التقاء ما يقرب من 80٪.
  2. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على [3 H] الكوليسترول في الدم. غسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني. كرر مرات غسيل 3.
  3. تحضير مصل خالية من وسائل الاعلام. إذا كان ذلك مطلوبا، تنشيط خلايا بإضافة ناهض LXR (مثل TO-901317 في 1-4 مليمول / لتر) أو مخيم (0.3 μMol / L؛ لخلايا المنشأ الماوس فقط) لمصل الدم وسائل الاعلام الحرة.
  4. إضافة 500 ميكروليتر وسائل الإعلام الحرة في المصل إلى كل بئر.
  5. احتضان لمدة 18 ساعة في الخلية الحاضنة ثقافة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2).
<ف الطبقة = "jove_title"> 4. الكولسترول الدفق الحضانة
  1. بعد 18 ساعة حضانة في مصل الدم خالية من المتوسط، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. تأكد من أنهم يتمتعون بصحة جيدة ومتموجة (الحد الأدنى 80٪ confluency).
  2. يعد حل من هروب رأس المال يقبلون الكولسترول في الدم خالية من المتوسط. أمثلة من يقبلون ما يلي:
    ئي لمنظمة العفو الدولية (برنامج عمل ألماتي-I) (تركيز نهائي 10 ميكروغرام / مل)
    عالية الكثافة (HDL) (تركيز نهائي 20 ميكروغرام / مل)
    Cyclodextrin (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل)
    البلازما (تركيز النهائي 1-2٪)
  3. غسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 250 ميكروليتر من المصل خالية من وسائل الاعلام مع يقبلون على كل بئر.
  5. ترك مجموعة واحدة من الآبار لتحديد خلفية هروب رأس المال (هروب رأس المال إلى وسائل الإعلام الحرة في المصل مع NO متقبل)
  6. احتضان خلايا لمدة 2 ساعة في خلية ثقافة حاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2). قد مدة حضانة هروب رأس المال تختلف من 30 دقيقة إلى 8 ساعات إذا لزم الأمر.

5. تجهيز ساmples

  1. بعد 2 ساعة حضانة فحص الخلايا تحت المجهر.
  2. جمع وسائل الاعلام الى 1،5 أنابيب microfuge مل. تدور في 14000 دورة في الدقيقة لدقيقة 1-10 في درجة حرارة الغرفة لازالة الحطام الخلوية.
  3. نقل 100 ميكروليتر وسائل الاعلام الى 7 مل قنينة التلألؤ. إضافة 5 ملل من إنستا جل زائد (PerkinElmer) وخليط دوامة. تخزين العينات المتبقية في 4 درجة مئوية.
  4. وضع لوحات في الثلاجة لمدة 30 دقيقة. إضافة 500 ميكروليتر درهم 2 O إلى كل بئر. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن كل الخلايا قد رفعت من قاع الآبار. إذا لا تزال ملتصقة، إما ترك لوحات مع DH 2 O في 4 آبار درجة مئوية خلال الليل أو كشط.
  5. مرة واحدة كل الخلايا قد انطلق، ماصة صعودا وهبوطا لتفتيت كتل الخلية. نقل 100 ميكروليتر إلى 7 قوارير التلألؤ مل. إضافة 5 ملل من إنستا جل زائد (PerkinElmer) وخليط دوامة. تخزين لوحات المتبقية في 4 درجة مئوية.
  6. وضع قنينة التلألؤ في عداد التلألؤ. تكوين عداد لحساب ل[H 3] فيوحدات DPM.

6. تحليل النتائج

  1. وعادة ما يتم التعبير عن معدل الكولسترول هروب رأس المال كنسبة من الكولسترول من الخلايا انتقلت إلى متقبل. وتستخدم الصيغة التالية:

figure-protocol-1

  1. يتم حساب هروب رأس المال محددة كما فرق بين هروب رأس المال في وجود أو غياب متقبل (فارغة).

figure-protocol-2

7. الجدول الزمني

figure-protocol-3

8. ممثل النتائج

ويرد مثال على نتائج تجربة هروب رأس المال نسبة الكولسترول في الشكل. 1. في هذه التجربة كانت متباينة THP-1 حيدات الإنسان في الضامة، وهروب رأس المال إلى نسبة الكولسترول يقبلون مختلفة كاناختبار. وكان هروب رأس المال الكولسترول والمتوسطة مع عدم وجود يقبلون ("فارغة") بنسبة 0.79٪، وكان يعتبر هذه القيمة بمثابة هروب رأس المال غير محددة، وكان مطروحا من القيم الأخرى. وكان هروب رأس المال البشري الكوليسترول إلى برنامج عمل ألماتي-I (تركيز نهائي 30 ميكروغرام / مل) 4.75٪. تم تضمين عينة البلازما إشارة إلى هذه التجربة لمراقبة مشتركة بين التجريبية تقلب. ويمكن استخدام عينة مرجعية لتطبيع البيانات عبر عدد كبير من التجارب، لكننا وجدنا أنه من الحكمة تكرار تجربة إذا تقلب مرتفع. وقد أجريت اختبارات على بلازما المريض (نهائي تركيز 2٪) قبل وبعد التعامل مع المريض مع الدواء. وخلص إلى أن هذا الدواء في المريض كان له أثر سلبي على قدرة بلازما هروب رأس المال لدعم الكولسترول.

ويرد مثال آخر على نتائج تجربة هروب رأس المال في الشكل. 2. في هذه التجربة تم تنشيط خام 264،7 الضامة أو تفعيلها ليس عن طريق حضانة بين عشية وضحاها مع ناهض LXR TO-901317 (تركيز النهائيتم اختبار 1 μmol / لتر) وهروب رأس المال الكولسترول إلى نفس العينة من البلازما البشرية (2٪). وخلص إلى أن تفعيل التعبير الخلوية من نقل اي بي سي مع ناهض LXR يزيد قدرة الخلايا على اطلاق سراح الكوليسترول إلى متقبل خارج الخلية.

figure-protocol-4
الشكل 1. ويظهر هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا-1 THP إلى يقبلون مختلف. النسبة المئوية من هروب رأس المال الكوليسترول (أي نسبة الكوليسترول الموسومة انتقلت من الخلايا إلى متقبل معين) بعد الطرح من القيم الفارغة. يعني ± التنمية المستدامة من قرارات quadruplicate *، P <0.05.

figure-protocol-5
الشكل 2. انتقل هروب رأس المال من نسبة الكوليسترول في الدم 264.7 تنشيط أو تفعيل وليس مع ناهض LXR إلى البلازما البشرية. RAW من هروب رأس المال الكوليسترول (أي نسبة الكولسترول من الخلايا التي تحمل علامات للويرد متقبل المحدد) بعد الطرح من القيم الفارغة. يعني ± التنمية المستدامة من قرارات quadruplicate، * P <0.001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم الطريقة الموضحة لقياس نسبة الكوليسترول هروب رأس المال لقياس حركة الكولسترول من الخلايا الى متقبل الكوليسترول خارج الخلية. هناك اعتبارات عدة حاسم في فهم هذه المنهجية.

وضع البطاقات التعريفية وموازنة

في المنهجية الموصوفة يضاف إلى مصل الكوليسترول الموسومة المحتوية على مصل الدم. على الرغم من عدم التحقيق في التفاصيل، فمن المفترض أن يتم تضمينها ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المتعلقة بهذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (NHMRC) (526615 و 545906)، وجزئيا من خلال برنامج منظمة المؤتمر الاسلامي وحكومة فيكتوريا. DS زميل NHMRC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكواشف \ خلايا هيلا THP-1 RAW HUVEC BHK-21 HFF
كاملة وسائل الإعلام RPMI
- FCS 10٪
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 0.2٪ 		M199
- FCS 5٪
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 1٪
- HEPES 2٪ (1M)
- 7٪ نمو الخلايا البطانية الملحق (رسم القلب) 		DMEM
- FCS 10٪
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 0.2٪
حرية الإعلام في المصل RPMI
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 0.2٪ 		M199
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 1٪
- HEPES 2٪ (1M)
- الخلايا البطانية 7٪ النموالملحق الرابع (رسم القلب) 		DMEM
- 1٪ L-الجلوتامين
- بكتيريا القلم 0.2٪
مرور الطريقة 1 × التربسين تعليق كشط 1 × التربسين
نسبة مرور 03:10 01:03 01:20 01:03 01:03
تنشيط الخلية (اختياري) TO-901317
- LXR ناهض
- اضرب النهائي. 4 ميكرومتر
الكواشف الأخرى phorbol 12-13-myristate خلات (PMA)
- خلية التمايز
- اضرب النهائي. 0.1μg/ml

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
  2. Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
  3. Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
  4. Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
  5. Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
  6. Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  7. Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
  8. Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
  9. D'Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
  10. Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
  11. Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
  12. Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
  13. Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
  14. Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
  15. Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
  16. Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cholesterol EffluxCellular CholesterolABCA1 TransporterABCG1 TransporterHigh Density LipoproteinApolipoprotein A ICholesterol LabellingSerum Free IncubationAcceptor QuantitationCholesterol Purification

مقالات ذات صلة