مقالة منهجية

وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

13.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/3824

⸱

أبريل 19, 2012

 , 
1Department of Genetics, Development and Cell Biology, Neuroscience Program, Iowa State University

في هذه المقالة

ملخص

تم وصف طريقة لعزل خلايا الشبكية واحد، والتضخيم لاحق من cDNAs بهم. وحيدة الخلية transcriptomics يكشف عن درجة من عدم التجانس الحالي الخلوي في الأنسجة والجينات تكشف علامة جديدة للسكان الخلية نادر. ويمكن تعديل البروتوكول المرافق لتتناسب مع العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.

الملخص

السكان درجة عالية من التخصص، ولكنها صغيرة جدا من الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من الأنسجة. وكان تحديد خلية من نوع علامات وبرامج محددة التعبير الجيني للخلية فرعية نادرة للغاية تحديا باستخدام معيار كامل الأنسجة النهج. التنميط الجيني التعبير من الخلايا الفردية تسمح للوصول لم يسبق لها مثيل إلى أنواع الخلايا التي تشكل إلا نسبة ضئيلة من مجموع النسيج 1-7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة البرامج التعبير الجيني الذي يتم التعبير عن عابر في أعداد صغيرة من الخلايا خلال التحولات التنموية الحيوية 8.

هذه مسألة التنوع الخلوية تنشأ مرارا وتكرارا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث الوصلات العصبية يمكن أن يحدث بين خلايا مختلفة تماما 9. العدد الدقيق للأنواع الخلايا متميزة ليس معروفا على وجه التحديد، ولكن لم يقدر أنه قد يكون هناك ما يصل الى 1000 من أنواع مختلفة في القشرة أناtself 10. قد تكون وظيفة (ق) من الدوائر العصبية المعقدة الاعتماد على بعض أنواع الخلايا العصبية النادرة والجينات التي تعبر عنها. من خلال تحديد علامات جديدة وتساعد على تصنيف جزيئيا الخلايا العصبية المختلفة، ونهج وحيد الخلية هو مفيدة بشكل خاص في تحليل أنواع الخلايا في الجهاز العصبي. كما قد يساعد على توضيح آليات تطوره العصبي عن طريق تحديد الجينات وأعرب تفاضلي ومسارات الجينات خلال المراحل الأولى من التنمية سلف الخلايا العصبية.

كما منديل، بسيط الوصول إليها بسهولة مع تنوع كبير الخلايا العصبية، في شبكية العين عند الفقاريات هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة عمليات التنمية الخلوية، وتمايز الخلايا العصبية وتنويع الخلايا العصبية. ومع ذلك، كما هو الحال في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي، ويمكن لهذا التنوع الخلوية يمثل مشكلة لتحديد مسارات الوراثية التي تدفع الأسلاف شبكية العين إلى اعتماد مصير خلية معينة، وخصوصا ان مبصرات قضيب يشكلون أماهjority من السكان خلايا شبكية المجموع 11. هنا نقدم تقريرا عن طريقة لتحديد هوية النصوص التي أعرب عنها في خلايا الشبكية واحد (الشكل 1). أسلوب التنميط وحيدة الخلية يسمح لتقييم حجم السكان الحالي عدم التجانس داخل الخلوية المختلفة من شبكية العين 2،4،5،12. وبالإضافة إلى ذلك، فقد كشفت هذه الطريقة مجموعة من الجينات المرشحة الجديدة التي قد تلعب دور (ق) في مصير الخلية عمليات صنع القرار التي تحدث في مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية في شبكية العين 8. مع بعض التعديلات البسيطة في البروتوكول، يمكن أن تستخدم هذه التقنية لأنسجة عديدة ومختلفة وأنواع الخلايا.

البروتوكول

1. خلية التفكك

  1. مخطط انسيابي يحدد بروتوكول يظهر هو الشكل 1. لأرقام التسويقي للكواشف خاصة لاستخدامه خلال هذا البروتوكول، يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1. تشريح شبكية العين في حمام برنامج تلفزيوني. خلال تشريح، فمن الأفضل لإزالة الجسم الزجاجي والعدسة منذ ابقائها مع شبكية العين من الممكن أن تعوق التفكك. أنها ليست دائما ذات أهمية حاسمة لإزالة كافة الظهارة الشبكية الصباغ (RPE)، وفي بعض الحالات قد يكون من المستحيل إزالته تماما. ومع ذلك، لاحد التجارب التنميط خلية من خلايا مستقبلة للضوء، ينبغي إزالة RPE. يمكن للفشل لإزالة RPE يؤدي إلى تلوث لمحات الخلية قضيب مع RPE الجينات التي أعرب عنها. وهذا هو الأرجح بسبب الاتصال بين خلايا مستقبلة للضوء وRPE لل.
    للانفصال، وحضنت كل شبكية العين الفئران البالغين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 20ميكرولتر المنشط غراء، 20 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، و 360 ميكروليتر هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع 10 HEPES ملي. وتستخدم نصائح ماصة فلتر ذات الرؤوس لجميع الخطوات في جميع أنحاء بروتوكول للحد من التلوث المحتمل. وسوف تركز غراء ووقت حضانة تختلف وفقا لعمر وطبيعة النسيج. على سبيل المثال، أن تنأى تطوير شبكية العين معزولة في يوم ما بعد الولادة 0 (P0)، احتضان شبكية العين في 10 غراء المنشط ميكرولتر، 10 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، و 380 ميكروليتر هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع HEPES 10 ملم لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. شبكية العين من مختلف الأنواع كما تتطلب ظروف مختلفة قليلا. شبكية العين هي أرق من الدجاج شبكية العين الفأر في معظم مراحل التنمية. باستخدام 10 ميكرولتر المنشط غراء، 10 ميكرولتر سيستين 25 مم في EDTA 5 ملم، والحل هانك 380 ميكروليتر في سولت المتوازن (HBSS) تستكمل مع HEPES 10 ملم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية كافية لفصل تيذات المناظر شبكية العين.
  2. اضغط بلطف على أنبوب لإخراج أي خلايا تسويتها، يسحن ثم بلطف 10-20 مرات مع pipettor P1000. احتضان ل10 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية إذا كتل كبيرة من الأنسجة لا تزال قائمة ومن ثم إعادة يسحن، 10-20 مرة.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من الدناز أنا (10 U / ميكرولتر) واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يسحن بلطف مع pipettor P1000. والعدد الدقيق للمرة يجب أن يتم تحديد تجريبيا، ولكن يقع عادة ما بين 10-20.
  4. أجهزة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق إزالة طاف، وترك 100-200 ميكروليتر من السائل في الجزء السفلي، والاستفادة من أنبوب لإخراج بيليه. إضافة 1 مل من HBSS وresuspend وبيليه مع سحن لطيف. التنصت على أنبوب أمر بالغ الأهمية هنا كما resuspending ببساطة بيليه مع ليز العديد من الخلايا في شبكية العين. هذا صحيح لا سيما مع شبكية العين الفئران البالغين.
  5. الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق بعناية إزالة طاف وresuspend في 450 ميكروليتر من PBS تحتويجي BSA 0.1٪. من المهم أن إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن للتقليل من وجود mRNAs من الخلايا هي lysed ومنتجات أي من التفكك التي يمكن أن تحول دون ردود الفعل في المستقبل.

2. حصاد خلايا واحدة

  1. إعداد طبقين 6 سم تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1٪. لوحة الخلايا تنفصل على طبق واحد وتسمح للخلايا لتسوية ما لا يقل عن 5 دقائق. كثافة الخلية المستخدمة تعتمد إلى حد كبير على طبيعة الخلايا واحد يجري لمحة. على سبيل المثال، للخلايا نادرة جدا المسمى مع علامة فلوري مثل هذا GFP، ومطلي شبكية العين فصل كامل على صحن واحد 6 سم. للخلايا التي هي إلى حد ما أكثر وفرة، والمطلية في البداية أقل من الخلايا لجعلها أسهل للحصاد واحد (أو قريبة جدا من واحد) مع خلية micropipette الأولى.
  2. وضع لوحة من الخلايا تنفصل عن مجهر مقلوب. نستخدم نموذج IMT-2 من أوليمبوس. باستخدام بال micropipettes التي تم رسمها لاسلكي بالإنترنتشمال شرق رأس (الداخلية قطرها 0.5 ملم، القطر الخارجي 1،04 ملم) (الشكل 2)، وجنبا إلى جنب مع أنبوب الشافطة، حصاد خلية واحدة. الخلايا تدخل بسهولة في micropipette عندما يتم وضعها على مقربة من لهم على طبق. فمن الأهمية بمكان أن الأنبوب الشافطة ليست طويلة جدا ولا قصيرة جدا لالمسافة إلى مرحلة المرتبطة المجهر المقلوب (أنابيب الشافطة التي نستخدمها مع مجهر مقلوب لدينا هي 38.1 سم طويلة). إذا كان أنبوب طويل جدا، قد لا يمكن طرد الخلايا بكفاءة من micropipette في أنبوب جمع. السبب الرئيسي نستخدم القديمة IMT-2 نموذج المجهر المقلوب هو أننا قد وجدت أنه يحتوي على مسافة مثالية لمرحلة للأنابيب لدينا الجمعية الشافطة. بعد دخول micropipette، وطرد خلية (أو خلايا) على لوحة ثانية (لوحة غسيل) لضمان أن يتم حصاد واحد وخلية واحدة فقط لتحديد ملامح التعبير الجيني. على لوحة 2 غالبا ما يكون من الضروري إزالة أي خلايا غريبة مع micropipette جديدأو نقل خلية من الاهتمام إلى موقع آخر للتأكد من أنه ليس هناك سوى خلية واحدة يدخل micropipette.
  3. عندما يتم معزولة تماما خلية واحدة من الخلايا المجاورة، واستخدام micropipette جديدة لنضح الخلية من الفائدة كما في القسم 2.2، ثم طرد مباشرة في أنبوب 0،2 مل PCR يحتوي على 4،5 تحلل الخلية ميكرولتر العازلة. وطرد خلية على الجانب من الأنبوب، والحرص على عدم قطع غيض من micropipette في أنبوب. ويمكن نسج هذه العينات لفترة وجيزة في microcentrifuge مقعد العلوي أن تزج الخلية في عازلة تحلل. وعادة ما يتم هذا الغزل بعد كل خلية 5 ثم مرة أخرى في نهاية collection.Tubes التي تحتوي على الخلايا وحيدة في المنطقة العازلة تحلل يجب أن تبقى على الجليد لمدة عزل خلية واحدة. لأفضل النتائج، يتم جمع الخلايا واحد ضمن إطار لمدة ساعتين في مرحلة ما بعد تفكك. بعد هذا الوقت قد انقضى، فمن الأفضل للشروع في خطوة النسخ العكسي منذ وقت إضافي كان observإد لزيادة فرص تدهور الحمض النووي الريبي.

3. عكس النسخ

  1. تدور فترة وجيزة على العينات في minicentrifuge الفوق لضمان مغمورة جميع الخلايا واحد في خلية العازلة تحلل. لتعزيز تحلل الخلية، واحتضان العينة على 70 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. في thermocycler. تضع فورا الأنابيب مرة أخرى على الجليد.
  2. ترك الأنابيب في الثلج لمدة 2 دقيقة. لجميع الإضافات كاشف، استخدم فلتر طرف ماصة نصائح لمنع التلوث. لإجراء النسخ العكسي، إضافة 0.33 ميكروليتر مرتفع الثالث (200 U / ميكرولتر)، 0.05 ميكروليتر ريبونوكلياز المانع (40 U / ميكرولتر)، و 0.07 ميكروليتر T4 جينة بروتين 32. احتضان خليط التفاعل لمدة 50 دقيقة عند 50 درجة مئوية في thermocycler. تعطيل الإنزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومكان على الجليد.
  3. لإزالة فتيل مجانا، إضافة 0.1 الواق نوكلياز خارجية ميكروليتر (10X)، 0.8 درهم ميكرولتر 2 0 (الجزيئية أحياء الصف)، و 0.1 نوكلياز خارجية ميكرولتر أنا (20 U / ميكرولتر). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في1 thermocycler. تعطيل الإنزيم بواسطة احتضان رد الفعل في 80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ومن ثم وضع أنابيب على الجليد.

4. المخلفات واحدة خلية-PCR

  1. إضافة 6 ميكرولتر من خليط التفاعل المخلفات واستخدام thermocycler لاحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية
  2. إضافة 10 ميكرولتر من عينة الذيل إلى خليط التفاعل PCR وتنفيذ أعمال تركيب الشق الثاني والتضخيم PCR باستخدام الشروط التالية:
    1. 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    2. 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    3. 72 درجة مئوية لمدة 16 دقيقة
    4. 93 درجة مئوية لمدة 40 ثانية
    5. 67 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
    6. 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق، واضاف 6 ثوانى لكل دورة
    7. انتقل إلى الخطوة 4 34 مرة
    8. 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة
    9. عقد في 4 درجات مئوية

5. وصفها لرقائق Affymetrix

  1. التسمية 10-20 ميكروغرام من [كدنا] (تركيز النتيجة [كدنا] تضخيموعادة ما جى من خلية واحدة ~ و1 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على تهجين قوي على ميكروأرس Affymetrix. الأول، جزء من [كدنا] بإضافة 10-20 ميكرولتر من [كدنا] وحيدة الخلية إلى 8 1X ميكرولتر واحدة الإستعارة، كل العازلة و 1 ميكرولتر من المخفف (1:10 في 1X واحدة الإستعارة، كل العازلة) DNaseI في 80 ميكرولتر رد فعل. احتضان في thermocycler لمدة 13 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تعطيل وأنا الدناز لمدة 15 دقيقة في 100 درجة مئوية ومكان على الجليد.
  2. إضافة 20 ميكرولتر العازلة TDT 5X، 2.5 البيوتين ميكرولتر N6-ddATP (انزو العلوم البيولوجية)، و 1 TDT ميكروليتر (01:08 المخفف في عازلة TDT).
  3. احتضان لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. متجر في -20 درجة مئوية أو هجن فورا إلى ميكروأري Affymetrix. يتم تنفيذ التهجين باستخدام معيار بروتوكولات Affymetrix.

6. ممثل النتائج

لتقييم جودة ميكرولتر، [كدنا] 10 من [كدنا] عينة تم تحميلها على هلام الاغاروز 1٪. ويحكم على رأسها [كدنا] من قبل مجموعة حجم (500-2000 بي بي)وشدة تشويه [كدنا] (الشكل 1 والشكل 3A). في هلام المبين في الشكل 1، كل حارة أخرى يظهر تشويه [كدنا] من خلايا الشبكية معزولة E16.5. في الممرات بين إظهار مسحة الناتجة عندما يستنشق وسائل الاعلام فقط إلى إبرة وأودعت في أنبوب PCR. هذه المسارات هي أبدا خالية تماما من مسحة باهتة، لكنها لا تظهر أية نتائج عندما يتم استخدام الجينات المحددة الاشعال PCR لتضخيم الجينات منها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لشدة التشويه [كدنا] تختلف نوعا ما (قارن الشكل 1 والشكل 3A). في الممرات 3A الشكل 1، و، ز، ح، وتحتوي على مسحات [كدنا] قوية بينما الممرات ب، ج، د، ه، وإلى حد كبير هي أقل قوة.

يتم استخدام الجينات المحددة PCR كشاشة ثانوية من نوعية [كدنا] من خلية واحدة. تم عزل cDNAs في الشكل (3) من الفلورسنت خلايا عقدة شبكية العين، وكانوا بصدد إجراء تجاربد باستخدام بادئات PCR للالشبكية العقدة خلية علامات Brn3b وPax6. لهذا الفحص، تعرض 1 ميكرولتر من [كدنا] إلى PCR لمدة 30 دورات. سيكون في الوقت الحقيقي PCR كمي يكون من الأفضل فحص، ولكنها يمكن أن تكون باهظة التكلفة، وليس من الضروري لتقييم جودة مجرد [كدنا]. اختبرت كل 8 من خلايا وحيدة إيجابية لBrn3b و 6 من أصل 8 لPax6 (الشكل 3B). حتى كدنا] المسحات التي كانت أقل قوة العصابات المنتجة للBrn3b وPax6. على الرغم من هذه النتائج PCR، فمن خبرتنا أن المسحات [كدنا] مثل تلك الموجودة في الممرات ب، ج، د، ه و لم تسفر التهجين قوي على صفائف Affymetrix ويتم تجنب عموما. تم استخدام جينات محددة PCR لCRX علامة مبصرة لتحديد مستوى التلوث في cDNAs خلية واحدة (الشكل 3B). وقد تم اختيار علامة مبصرة لأن هذه الخلايا تشكل الغالبية العظمى من شبكية العين (~ 70٪)، وبالتالي، فإن أي تحلل الخلية التي وقعت على الأرجح إشراك قضيب photoreceptors. لم يكن هناك سوى مبلغ خافت من الحاضر CRX في هذه الاستعدادات حتى كدنا] بعد 30 دورات من PCR. أخيرا، يمكن استخدام هذه الشاشة PCR المستندة إلى البدء في تحديد مجموعات فرعية من نوع خاص خلية تم الحصول على cDNAs من قبل تعريضهم إلى التنميط ميكروأري كامل. هذا يمكن أن يساعد على إعطاء الأولوية لالخلايا التي يتم لمحة، وهذه هي الخطوة الأكثر كلفة في هذه العملية. على سبيل المثال، تمكنا من تحديد مجموعات فرعية من الخلايا عقدة شبكية العين عن طريق فحص لهم لحضور Tachykinin1 الجين (الشكل 3B).

من الشاشة PCR صغيرة مقرها، ويتم اختيار الخلايا واحدة خاصة بهم وcDNAs المهجنة لميكروأري Affymetrix. تتم مقارنة البيانات ميكروأري ويمكن اكتشاف أنماط باستخدام خوارزميات التجميع القياسية. تتولد Heatmaps، كما هو الحال في الشكل (4)، لتمثيل البيانات بيانيا. هناك نوعان من الاستنتاجات الرئيسية المتعلقة التنميط خلية واحدة البيانات في الشكل 4. أولا، يتم العثور على الجينات التي أعرب عنها في أنواع معينة من الخلايا بشكل حصري تقريبا في تلك الأنواع الخلية بعد يتم تنفيذ بروتوكول خلية واحدة. في معظم الحالات حيث تم العثور على جينات علامة من نوع خلية واحدة أيضا في نوع الخلية الثانية، مثل ملاحظة أن الخلايا القطبين التعبير عن بعض "قضيب" الجينات في المستويات الدنيا، ويتأكد بسهولة هذا التعبير في نوع الخلية الثانية من قبل، سواء في موطنهم تهجين أو تلطيخ الجسم المضاد. الثانية، ضمن عديم الاستطالات أكثر تنوعا وملامح خلية العقدة، والتباين في التعبير الجيني يتضح على الفور. وأعرب عن Pou4f1 فقط في حوالي 1/4 للخلايا العقدة النامية، في حين Nr4a2 وScube2 مثالين من الجينات في خلايا أعرب heterogeneously عديم الاستطالات مختلفة. في الواقع، على الجينات هو مبين في heatmap ليست سوى عينة صغيرة كما تم التعرف على عدة مئات من الجينات، وأكد كدلالة على وجود خلايا العقدة النامية أو كعلامات من مجموعات مختلفة من الخلايا عديم الاستطالات 2،4.

الطبقة = "jove_content"> figure-protocol-1
الشكل 1. مخطط لطريقة التنميط خلية واحدة. شبكية العين الأولى هي المعزولة وفصلها في الخلايا الفردية باستخدام غراء. الثانية، ويتم حصاد الخلايا واحد بإبرة الزجاج وسحبت وأودعت في أنابيب PCR. وهذه الخلايا هي lysed وكدنا] تضخيم باستخدام النسخ العكسي تليها PCR. ويتم تقييم نوعية الناتج [كدنا] على هلام الاغاروز مثل واحد هو مبين. بعد أن سلم الحمض النووي في المسار الأول، والممرات إظهار مسحة [كدنا] من خلايا مفردة (المشار إليها بواسطة الأقواس الحمراء) بالتناوب مع منتجات التضخيم من الضوابط وسائل الاعلام. وتهجين مسحات من هذه النوعية (بين قوسين باللون الأحمر) لميكروأرس Affymetrix.

figure-protocol-2
الشكل 2. يتم عزل صور الإبر والشافطة الجمعية أنبوب. الخلايا واحدة باستخدام عمل شعري منسحبت زجاج micropipette (الداخلية قطرها 0.5 ملم، القطر الخارجي 1.04 ملم) ويتم نقلها بواسطة ضغط النفخ في الشافطة. من المهم أن أنبوب الشافطة على حد سواء لفترة كافية للتلاعب بسهولة وقصيرة بما فيه الكفاية لأداء موثوق بها الخلايا الفردية. ويبين وجهة نظر عن قرب من الأنابيب الشعرية وانسحبت إلى إبرة في B.

figure-protocol-3
الشكل 3. مثال ممثل مسحات خلية واحدة [كدنا] وتقارير إتمام المشروعات جين معين. لتحديد نوعية خلية واحدة [كدنا] بعد التضخيم، تم تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة خلية واحدة على هلام الاغاروز 1٪ جنبا إلى جنب مع سيطرة سلبية (A). وينبغي أن يكون تشويه تظهر بين 500-2000 شركة بريتيش بتروليوم. ويمكن إضافية PCR القائم على الكشف عن جينات محددة تساعد على تحديد / تأكيد نوع من الخلايا التي تم عزلها ومقدار التلوث الحالي في العينة (B). الاشعال محددة لخلية العقدة الشبكية وضع العلامات Brn3bوجرى اختبار Pax6 لتأكيد هوية هذه الخلايا (الصفوف 1 و 2). لتقييم حجم التلوث مبصرة في التحضير، واستخدمت بادئات محددة لCRX علامة مبصرة (الصف 3). ويمكن أيضا مجموعات فرعية من خلايا العقدة الكشف عن هويته من خلال فحص لعلامات مثل Tachykinin1 (الصف 4).

figure-protocol-4
الشكل 4. وحيد الخلية من الجينات التعبير علامة. يتم عرض نتائج ميكروأري عن الجينات المحددة التي أعرب عنها في خلايا 22 واحد واضح في شكل heatmap. تم تحجيم شدة من الإشارات ميكروأري لتتوافق مع كثافة اللون الأحمر. أسود يشير إلى عدم وجود إشارة على ميكروأري]. تم عزل الخلية عقدة شبكية العين (RGC) السلائف تبين من النقاط الزمنية الجنينية، في حين تم عزل خلايا شبكية العين الأخرى من البالغين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عدد الآخذة في التوسع من الدراسات التي تكشف عن قوة الخلية الى خلية التغير في السكان الذين يعتقد انهم كانوا أكثر تجانسا فيما يتعلق التعبير الجيني على 6،8. في واحدة على الأقل، وقد تبين أن هذا الجين التعبير عن "الضجيج" للعب وظيفة هامة البيولوجية 13. وتحجب الخلافات التعبير الجيني بين الخلايا الفردية باستخدام التقليدية كامل النسيج الأساليب. هذه التجارب توليد الملف تعبير عن خلية "متوسط"، والتي قد لا تكون ممثلة 14. هنا نقدم وسيلة لعزل و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المراجع

  1. Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
  2. Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
  3. Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
  4. Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
  5. Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
  6. Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159(2006).
  7. Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
  8. Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588(2008).
  9. Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
  10. Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
  11. Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
  12. Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
  13. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
  14. Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
  15. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
  16. Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
  17. Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247(2004).
  18. Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
  19. Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
  20. Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
  21. McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
  22. Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  23. Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
  24. Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
  25. Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18(2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة