نظام ECIS / سيارات الأجرة هو الآلي، في الوقت الحقيقي فحص الكيميائي الذي يقيس الخلوية. في هذا الاختبار، وخلايا تتحرك تحت طبقة من الاغاروز للوصول إلى القطب الهدف. ويتم قياس حركة الخليوي عن ظهور المقاومة إلى 0 ميلان الحالي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حركة الخلوية في استجابة للمؤثرات الخارجية أمر أساسي لكثير من العمليات الخلوية بما في ذلك التئام الجروح، والالتهابات، واستجابة للعدوى. وهناك طريقة شائعة لقياس الكيميائي هو فحص غرفة بويدن، حيث يتم فصل الخلايا وجاذب كيميائي بواسطة غشاء مسامي. كما تهاجر الخلايا من خلال غشاء نحو جاذب كيميائي، كانوا متمسكين السفلي من الغشاء، أو الوقوع في وسائل الإعلام الأساسية، وملطخة في وقت لاحق وعدها بصريا 1. في هذه الطريقة، تتعرض الخلايا لالانحدار 1 جاذب كيميائي حاد وعابر، والتي يعتقد أن يكون تمثيل الفقراء من التدرجات وجدت في الأنسجة 2.
آخر نظام الفحص، وكيل الاغاروز الكيميائي فحص، 3، 4 حركة الخلية عبر تدابير ركيزة صلبة في الفيلم المائية التي تشكل رقيقة تحت طبقة الاغاروز. الانحدار الذي يتطور في الاغاروز ضحلة، ويعتقد أن يكون التطبيقropriate تمثيل طبيعيا التدرجات. ويمكن تقييم الكيميائي عن طريق التصوير المجهري للالمسافة المقطوعة. وعادة ما يتم تكوين كلا من الدائرة بويدن الفحص وفحص تحت الاغاروز كما المقايسات نقطة النهاية.
الآلي ECIS / سيارات الأجرة نظام يجمع بين نهج وكيل الاغاروز مع الكهربائية الاستشعار عن الممانعة الخلوي الركيزة (ECIS) 5 و 6. في هذا الاختبار، وتقع الأقطاب هدف في كل من 8 غرف. وقال كبير لمكافحة قطب كهربائي يعمل من خلال كل دائرة من الدوائر 8 (الشكل 2). يتم تعبئة كل غرفة مع الاغاروز واثنين من الآبار الصغيرة هي قطع في الاغاروز على جانبي القطب الهدف. واحد جيد مليء اختبار سكان الخلية، في حين أن الآخر يحمل مصادر جاذب كيميائي نشرها (الشكل 3). ويمكن استخدام الحالي مرت من خلال نظام لتحديد التغير في المقاومة التي تحدث باسم خلايا تمر فوق القطب الهدف. electrod الخلايا على الهدفه زيادة المقاومة للنظام 6. وبالإضافة إلى ذلك، والتقلبات السريعة في المقاومة تمثل تغيرات في تفاعلات الخلايا التي تحتوي على سطح القطب وتدل على التغيرات الجارية شكل الخلوية. لا يمكن للنظام ECIS / سيارات الأجرة قياس حركة السكان الخلية في الوقت الحقيقي على مدى فترات طويلة من الزمن، ولكن أيضا حساسة بما يكفي للكشف عن وصول خلية واحدة في القطب الهدف.
ومن المعروف Dictyostelium discoidium للهجرة في وجود حمض الفوليك التدرج 7 و 8، ويمكن ردها الكيميائي تقاس بدقة بواسطة ECIS / سيارات الأجرة 9. الكيميائي الكريات البيض، واستجابة لSDF1α والخصوم الكيميائي كما تم قياسه مع ECIS / سيارات الأجرة 10 و 11. ويرد مثال على استجابة الكريات البيض إلى SDF1α في الشكل 1.
البروتوكول
1. ECIS / سيارات الأجرة الكهربائي التحضير
- واستقر لأول مرة سطح الذهب من الصفيف القطب ECIS / سيارات الأجرة (التي تتكون من 8 غرف لكل شريحة) من خلال ما قبل المعالجة العقيمة مع السيستين 10 مليمتر في ماء منزوع الأيونات (DH 2 O) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف معقمة.
- نضح الحل السيستين من كل غرفة الكهربائي، شطف 3 مرات مع عقيم O 2 درهم، واستبدالها ب 250 ميكرو لتر من متوسط كاملة (RPMI 1640، 10٪ FBS، 25 العازلة HEPES ملم).
- ربط الكهربائي مجموعة الاتصال العلامات على صاحب مجموعة أداة لتنفيذ الاختيار الكهربائي.
- وسيتم تسليط الضوء الغرف التي ترتبط بشكل صحيح في أخضر على شاشة الكمبيوتر. إذا ما سلط الضوء على الغرف في الحمراء، أنت لم تقم بها وينبغي أن القطب إعادة المتمركزة في مجموعة حامل لإقامة اتصالات لجميع الدوائر.
- مرة واحدة وترتبط كل الدوائر، وانقر على زر "الاختيار" في وحدة تحكم البرامج لردعتلغيم المقاومة المبدئية والقيم السعة لكل غرفة. وينبغي أن تكون قيم المقاومة بين 1600 و 2000 أوم، والقيم السعة يجب أن تكون بين 5 و 6 nanofarads لمجموعة غرفة 8. إذا كانت الغرفة ليست ضمن هذه المعايير المقبولة، لا ينبغي أن الدائرة الفردية يمكن استخدامها لجمع البيانات.
- قطع القطب من صاحب مجموعة إلى إعداد الفرد غرف الاغاروز. نضح المتوسطة من الغرف وغسل كل غرفة 3 مرات مع معقم O. 2 درهم
2. إعداد الاغاروز الغرف
- في العقيمة 15 مل أنبوب البولي بروبلين مخروطي الشكل، وقياس 0.03 غرام من Seakem GTG الاغاروز وإضافة 1 مل العقيمة في برنامج تلفزيوني. استبدال غطاء أنبوب فضفاضة، وإذابة الاغاروز في الأوتوكلاف لدورة دقيقة السائل 2 (ذوبان في الميكروويف ليست فعالة لهذا الفحص). وهذا وقت قصير لا تذوب في أنبوب مخروطي الشكل. لخلايا أقل الحساسية التي لا تحتاج إلى مصل للثقافة، (على سبيل المثال Dictyostelium discoideum) 0.5٪ويمكن إجراء الاغاروز في الوسط المناسب وذابت في الميكروويف. والأوتوكلاف ضروري للخلايا التي تتطلب المصل، كما سيتم هذا التشويه والتحريف إذا ذابت في الميكروويف.
- أضف 5 مل من المتوسط RPMI كاملة تحسنت في حمام مائي (55 درجة -60 درجة مئوية) مباشرة إلى الاغاروز الساخنة، وإلى تركيز النهائي من 0.5٪ الاغاروز والماصة صعودا وهبوطا إلى مزيج بلطف.
- الماصة 300 ميكرولتر من متوسط الاغاروز ذاب في كل غرفة، استبدال ECIS / سيارات الأجرة تغطية مجموعة والسماح لهلام في درجة حرارة الغرفة.
- الماصة المتبقية الاغاروز إلى الحد الأقصى من أنبوب 15 مل لتقييم الاغاروز التبلور. وسيتم أيضا هذه الاغاروز الزائدة يمكن استخدامها في جزء (4): قطع الآبار إلى الاغاروز.
3. بناء وشحذ قنية أداة قطع حسنا
- شحذ 2 14 حقنة عادية مقياس نهاية حادة، وذلك باستخدام 5/64 "بت. تدوير غيض من قمة الحفر في كل افتتاح قنية مع تدريبات سرعة بطيئة، مما يجعل بعض لقمة الحفر يخفض حافة الداخلية بأكملها من كل مرجع قنيةening لتشكيل طليعة حاد الشكل (4A).
- حفر اثنين من الثقوب من خلال 1 "× 2" س "شبكي (الشكل 4B-D) مع 5/64" ¼ بت في الحفر الصحافة. إدراج كل شحذ قنية قياس 14 لذلك يبرز على مسافة متساوية من خلال كل ثقب شبكي.
4. قطع ويلز في الاغاروز
- تعقيم حقنة عادية قياس 14 بواسطة المشتعلة بخفة النصائح. قبل قطع الآبار في غرفة ECIS، والسماح للحقنة عادية ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، أو تهدئة حقنة عادية عن طريق لمس الاغاروز في الحد الأقصى للأنبوب 15 مل. إذا كانت درجة الحرارة من قنية عالية جدا، فإن الاغاروز تذوب كما تقطع غرفة الآبار، مما يجعل الآبار مشوه ومعيب.
- محاذاة هذا الزوج قنية فوق النقاط ذهبيتين المحيطة القطب هدف في كل غرفة (الشكل 2C و 5). إدراج قنية عموديا، من دون أي حركة أفقية، ووقف على اتصال لطيف بين قنية وعلى سطح القطب. إزالة بعناية قنية، ومرة أخرى من دون أي حركة أفقية. وضع آبار إضافية للمعارضة التدرجات الممكن أيضا مع إعادة تشكيل رقصة قنية.
- نضح بلطف المكونات الاغاروز التي خلفتها قنية، وذلك باستخدام معقم 9 "باستور ماصة، متصلة فراغ الضغط المنخفض، مع فخ الفراغ قبض الاغاروز النفايات.
- إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الاعلام RPMI كاملة لسطح كل غرفة على 37 درجة مئوية، لمدة 2 دقيقة لتشبع الاغاروز، ثم نضح بلطف وسائل الاعلام من على سطح الأرض والآبار من دون إزعاج الاغاروز.
5. تحميل ويلز
- كل بئر غير قادرة على عقد حجم من 7 ميكرولتر. إلى بئر واحدة في كل غرفة، إضافة 7 ميكرولتر من تعليق خلايا. لخلايا تي Jurkat، استخدام 2 X10 7 خلية / مل. وهذه الخلايا تستجيب إلى 7 ميكرولتر من 200 نانوغرام / مل SDF-1α المخفف في RPMI غير مكتملة، الذي يفتقر الى مصل. استخدام وسائل الإعلام كاملة وحده باعتباره تابع سلبيROL.
- بعد يتم تحميل الآبار، وعرض كل حجرة من الصفيف مع مجهر مقلوب لضمان خفض جميع الآبار وشغلها بشكل صحيح. يجب أن تكون الخلايا في داخل حدود حدود البئر. إذا تم النظر إليها على حد سواء في الآبار، أو تنتشر خارج حدود الخلية بشكل جيد، ثم شكلت فجوة تحت الاغاروز. لاحظ وضع الآبار غير صحيح حتى، كما لا يمكن أن تفسر بيانات موثوق بها عن تلك الدوائر.
6. جمع البيانات
- وضع قطب كهربائي في حامل الصفيف وإعادة ربط منصات الذهب على الصفيف الكهربائي إلى دبابيس بوجو بنابض لحامل وانقر على "الإعداد". وسيتم تسليط الضوء على الآبار التي ترتبط بشكل صحيح في الأخضر. إذا كانت الآبار هي الأحمر، أنت لم تقم بها ويجب أن يكون repositioned القطب في حامل الصفيف.
- حدد "8WE1" (8 جيد 1 الكهربائي) من القائمة المنسدلة في لوحة برامج للإشارة إلى تكوين مجموعة.
- حدد "تحقق" في مقاولات البرمجياتلوحة رأ لتحديد المقاومة المبدئية والقيم السعة لكل بئر. يجب أن تكون قيم المقاومة بين 1600 و 2000 أوم، في حين أن القيم السعة يجب أن تكون بين 5 و 6 nanofarads.
- تحديد الترددات متعددة لقياس المقاومة عند ترددات عدة. هناك خيار لتخصيص الترددات، أو باستخدام مجموعة من الترددات الموصى بها. المعيار اكتساب تردد عدة إعدادات التقاط البيانات على ترددات محددة مسبقا 11 (52،5، 125، 250، 500، 1000، 2000، 4000، 8000، 16000، 32000 و 64000 هرتز) بمعدل 8 آبار / دقيقة. ويمكن أيضا أن الفاصل الزمني بين القياسات تخصيصها. جمع بيانات متعددة تردد يسمح لتحليل، مقاومة المقاومة والسعة،. جمع قيم المقاومة عند 4000 هرتز يكفي عادة للدراسات الثدييات الكيميائي خلية، ولكن ترددات إضافية يمكن أن توفر المعلومات في سياقات أخرى 12،13.
- يمكن تعيين مجموع مدة التجربة، على اليد اليمنىيمكن وقفها لوحة، أو التجربة يدويا، بالنقر على "إنهاء" مرة واحدة قد أنتجت خلايا المقاومة التي تدل على وصوله الى القطب. الوقت الذي يستغرقه للخلايا للوصول الى القطب يعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة.
- انقر على زر "ابدأ" لبدء عملية جمع البيانات.
7. إدارة البيانات
- على الرغم من أن يمكن تصدير البيانات إلى Excel، برنامج 1600R ECIS، الذي يصاحب نظام ECISθ هو الأسلوب الأكثر فعالية لتحليل ECIS / بيانات سيارات الأجرة.
- تحليل البيانات والبرمجيات شريط الأدوات يحتوي على أزرار الراديو Z، R، وجيم هذه تحديد ما إذا كان رسم مقاومة، مقاومة، أو السعة، على التوالي، على المحور الرأسي ضد محور س (الوقت المنقضي).
- وبأكبر قدر من الكفاءة عرض ECIS / سيارات الأجرة البيانات والمقاومة على مر الزمن في 4000 هرتز. التقلبات السريعة في المقاومة، أو microtransients (الشكل 1)، هي دليل على حركة الخلوية على قطب كهربائي. تجميع، سص binning نقاط البيانات بحيث يتم رسوم بيانية ليست كل النقاط، لا ينصح لECIS / سيارات الأجرة، لأنه سوف microtransients المتوسط للخروج من البيانات.
- مرة واحدة أحرز الرسم البياني مع برنامج ECIS1600R، ويمكن تصديره عن طريق اختيار "رسم بياني للتصدير" من القائمة ملف، وحفظ TIF. او. ملف JPG.
8. ممثل النتائج
يشار الخلوية الكيميائي زيادة في المقاومة عند 4000 هرتز. وأشار أيضا إلى وصول الخلايا على القطب الهدف من ظهور التقلبات السريعة في المقاومة ودعا microtransients، أو micromotion كما هو موضح في وآخرون مقابل. آل.، 2009 (الشكل 1) 14. يشار إلى نتيجة سلبية من قبل متسقة، أو انخفاضا طفيفا، في المقاومة عند 4000 هرتز، كما رأينا في الحمراء في الشكل 1. غياب microtransients هو أيضا علامة على عدم وجود خلية لحركة القطب. الزيادة في المقاومة الموالية مباشرةportional إلى عدد الخلايا التي تعبر القطب 10. ويمكن إضافة ريتوكسيماب محددة لجاذب كيميائي أو السموم تتداخل مع مستقبلات بروتين G الديناميكي منع الكيميائي 11.
الشكل 1. تعرضت الكيميائي من الإنسان خلايا تي Jurkat ردا على SDF1α. الإنسان خلايا تي Jurkat (2.0x10 6 خلية / مل) إلى الانحدار من 1α، قوات الدفاع الذاتى (ابتداء من تركيز 100 نانوغرام / مل) أو RPMI 1640 كوسيلة لمراقبة سلبية. ورسوم بيانية للمقاومة التطبيع في 4000 هرتز. انتقل الإنسان Jurkat الخلايا التائية ردا على 1α، قوات الدفاع الذاتى، كما يدل على ذلك زيادة في المقاومة وmicrotransients، في حين كان ينظر أي تحرك مع التعرض لRPMI 1640.
الشكل 2. رأي كبار من ECIS / سيارات الأجرة الكهربائي withouتي الاغاروز. وتتألف كل قطب كهربائي ECIS / سيارات الأجرة من 8 غرف فردية. كل غرفة تشترك في قطب كهربائي كبير (أ)، وتحتوي على قطب كهربائي هدف فردي (ب). كل غرفة لديها أيضا الدوائر الذهب 2 (ج)، والتي تستخدم كمرشد عندما قطع الآبار في الاغاروز مع حقنة عادية. المربعات الذهب (د) هي منصات الاتصال التي تتصل دبابيس بوجو من أجل تطبيق الحالي ميلان إلى القطب. الأقطاب الهدف الفردية في كل الدوائر مع قطب كهربائي أكبر عداد (ه).
الشكل 3. يتم قطع بئرين في كل غرفة الاغاروز مملوءة. عند إضافة جاذب كيميائي واحد إضافة إلى أنه ينشر لإنشاء التدرج في الاغاروز، وفقا لأعلى تركيز من chemoattract الأقرب إلى جاذب كيميائي جيد. الخلايا السفر تحت الاغاروز نحو تركيزات أعلى من جاذب كيميائي ويمكن أن تمر عبر القطب الهدف. كماالخلايا عبر القطب الهدف، وسجلت زيادة في المقاومة من خلال برنامج ECIS 1600R.
الشكل 4. إدراج اثنين من حقنة عادية قياس 14 في شبكي. أ) B 5/64 "مثقاب يستخدم لزيادة رأس قنية.) يجب أن يتم حفر اثنين من الثقوب في شبكي لاستيعاب حقنة عادية عيار 14 وفقا للتخطيط لقطة. ج) استخدام الصحافة الحفر للتأكد من الثقوب متعامدة إلى السطح pleixglass. D) يتم إدراج اثنين من حقنة عادية من خلال شحذ شبكي "¼، 2 مم وبصرف النظر (تقاس من الحواف الداخلية). تندس بعناية هذه حقنة عادية شحذ إلى الاغاروز لقطع الآبار.
الشكل 5. التوفيق بين حقنة عادية مع نقاط الذهب في ECIS / سيارات الأجرة غرفة. لخفض الآبار، ويجب أن حقنة عادية شحذأن تكون متمشية مع نقاط الذهب المرافقة القطب الهدف على الجزء السفلي من الغرفة ECIS / سيارات الأجرة. ينبغي أن تدرج في حقنة عادية عموديا، من دون أي حركة أفقية، وإزالتها في نفس الطريقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خصائص رواية للفحص ECIS / سيارات الأجرة وتشمل قدرتها على أتمتة عملية جمع البيانات في الوقت الحقيقي وخلايا الاستجابة للجاذب كيميائي. في حين أن تطبيق معظم شائعا لهذه التكنولوجيا هو قياس الاستجابات الخلوية لالتدرجات الكيميائي الفردية، أو إلى التدرجات تتكون من خليط من ناهضات الكيميائي والخصوم، والنهج ECIS / سيارات الأجرة هي أيضا قابلة للتغير إلى هذه التكوينات التي يمكن أن تكون مفيدة جدا في تقييم الاستجابة الخلوية. هناك أدلة قوية على أن تداخل أو تدرجات متسلسلة يمكن أن تؤثر في السلوكيات ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ديفيد KNECHT ومايكل وينز لديها براءات الاختراع الصادرة للتكنولوجيا ECIS / سيارات الأجرة، والتي كما تم الترخيص من جامعة كونيكتيكت في شركة التطبيقية، الفيزياء الحيوية
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES07408 وEB00208).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| ECIS Zθ | التطبيقية الفيزياء الحيوية | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS الكهربائي صفيف | التطبيقية الفيزياء الحيوية | 8W الانجذاب الكيميائي | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG الاغاروز | تطبيقات BioWhittaker الجزيئية | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone مصل بقري جنيني | الحرارية العلمية | SH300703 | |
| PEnicillin / الستربتوميسين | النائب Biomedicals | 1670049 | بنسلين 5000 وحدة دولية / مل؛ الستربتوميسين 5 ملغ / مل |
| HEPES الواق | النائب Biomedicals | 1688449 | حل 1M ثقافة الخلية، الصف |
| 14 المقياس الفولاذ المقاوم للصدأ قنية (2) 4 بوصة | عام مختبر التموين | 5-8365-1 | كليل نقطة |
المراجع
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
