Method Article

رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات Aplysia

DOI:

10.3791/3907

⸱

July 15th, 2012

 ,  , 
1Fishberg Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Mt. Sinai School of Medicine, 2Phase Five Communications Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة Aplysia. نحن صورة الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت، أورانج الكالسيوم، وحمل ومراقبة انتقال متشابك مع الأقطاب الكهربائية (داخل الخلايا) حادة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اقترح أن التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا توسط في تحريض عدد من الأشكال الهامة من اللدونة متشابك (على سبيل المثال، وتيسير homosynaptic) 1. يمكن اختبار هذه الفرضيات من خلال رصد التغيرات في وقت واحد في الكالسيوم داخل الخلايا وإحداث تغييرات في فعالية متشابك. نحن توضح كيف يمكن تحقيق ذلك من خلال الجمع بين التصوير مع الكالسيوم داخل الخلايا تقنيات التسجيل. وتجرى التجارب لدينا في العقدة الشدق من californica Aplysia الرخويات. هذا المستحضر يحتوي على عدد من الميزات تجريبيا المفيد: يمكن إزالتها بسهولة من العقد والتجارب Aplysia استخدام الخلايا العصبية التي تجعل الكبار اتصالات متشابك العادية ويكون لها قناة ايون العادية التوزيع. نظرا لانخفاض معدل الأيض للحيوان ودرجات حرارة منخفضة نسبيا (14-16 ° C) التي هي طبيعية للAplysia .. يجري مستقرة لفترات طويلة من الزمن. الأنف والحنجرة "> للكشف عن تغيرات في الخلايا الكالسيوم الحرة سوف نستخدم النسخة المحمولة من impermeant أورانج الكالسيوم (2) الذي هو بسهولة 'تحميل' إلى الخلايا العصبية عن طريق الرحلان الشاردي. هذه الصبغة عندما الطول الموجي الطويل الفلورسنت يربط الكالسيوم، ويزيد من كثافة مضان. أورانج الكالسيوم لديها خصائص الحركية بسرعة 3 و، على عكس الأصباغ ratiometric (على سبيل المثال، FURA 2)، لا يتطلب أي مرشح عجلة للتصوير، وهي الصورة إلى حد ما مستقرة وأقل من الأصباغ سمي ضيائي الأخرى (على سبيل المثال، فلوو-3) 2،4. مثل كل ratiometric غير الأصباغ، البرتقالية الكالسيوم يشير التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم، ولكن لأنه ليس من الممكن لحساب التغيرات في تركيز صبغة بسبب التحميل ونشرها، فإنه لا يمكن معايرتها لتوفير تركيزات الكالسيوم مطلقة.

تم استخدام، ثابتة تستقيم المجهر المركب المرحلة، إلى الخلايا العصبية الصورة مع كاميرا CCD قادر على تسجيل نحو 30 لقطة في الثانية. في Aplysia هذا القرار الزمانيهي أكثر من كافية للكشف عن تغيير واحد حتى الناجم عن ارتفاع في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. وتستخدم في وقت واحد أقطاب حادة للحث على نقل وتسجيل متشابك الخلايا العصبية التي تم تحديدها في مرحلة ما قبل وبعد المشبكي. في ختام كل محاكمة، برنامج نصي مخصص يجمع بين الكهربية وتصوير البيانات. لضمان التزامن المناسب نستخدم نبضة ضوء LED من تقام في ميناء الكاميرا من المجهر. التلاعب في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي (على سبيل المثال عن طريق حقن الخلايا EGTA) يسمح لنا لاختبار الفرضيات محددة، فيما يتعلق بدور الكالسيوم داخل الخلايا في التوسط أشكال مختلفة من اللدونة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد

  1. تخدير عن طريق حقن الحيوان 75-100 مل كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر حل. وAplysia نستخدمها للتصوير عموما 150-200 غرام ويتم الحصول عليها من العلم مارينوس.
  2. دبوس تخدير الحيوان إلى طبق الشمع مغطاة. حقنة الإبر تعمل بشكل جيد لهذا الغرض؛ التقنيات العقيمة ليست ضرورية. باستخدام ملقط ومقص الإجمالي القياسية إجراء شق في القدم الحيوان وفضح الشامل الشدق. تحديد موقع العقدة الشدق. باستخدام مقص وملقط الربيع الجميلة، مجانا بعناية العقدة عن طريق قطع جميع الأعصاب الشدق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علينا أن نبرهن التقنيات التي يمكن استخدامها في وقت واحد لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتقييم فعالية انتقال متشابك. هذه التقنيات مفيدة لتحديد كيفية توسط أشكال مختلفة من قصيرة الأجل اللدونة.

ويتم التصوير بها مع مضان المجهر والكاميرا CCD. هذه الاحتياجات من المعدات متواضعة نسبيا بالمقارنة مع مجموعة عمليات التصوير أكثر وظيفية. هذه التقنية بسيطة وسهلة للتعلم. بينما التصوير مع كاميرا CCD تسمح برؤية مساحة واسعة لق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد PHS غرانت (MH51393) هذا العمل. وتقدم بعض Aplysia نستخدمها من قبل الموارد الوطنية للAplysia من جامعة ميامي في إطار المنحة RR10294 من المركز الوطني للبحوث الموارد، NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كاشف اسم شركة كتالوج رقم تعليق
الكالسيوم أورانج إينفيتروجن C-3013
EGTA سيجما E-4378
مجموعة الكالسيوم المخزن المؤقت معايرة إينفيتروجن C-3008MP مفيدة لاختبار الحساسية ومجموعة ديناميكية من الإشارة
المغنيسيوم كلوريد هيدرات سيجما M0250 المستخدمة في حل M 0.33 و تخدير الحيوان

الجدول 1. الكواشف المستخدمة.

اسم المعدات شركة تعليق
FN-1 مضان المجهر تستقيم نيكون الآلات مع Narishige ITS-FN1 المرحلة
NMN-21 المتلاعبين Narishige شنت على خشبة المسرح مع المغناطيس
CoolSNAP HQ كاميرا CCD 2 Photometrics
NIS عناصر AR
(الإصدار 3.22) 		نيكون الآلات تستخدم برامج التصوير للحصول على البيانات مضان
10X/0.3w خطة فلور الهدف نيكون الآلات هذه العدسة الغمر بالماء لديها مسافة طويلة جدا من العمل 3.5 ملم
X-سايت 120 مصباح هاليد المعدنية PC EXFO تستخدم للتصوير مضان
LS-DWL
مصباح الهالوجين 		Sumica
ET-CY3 تصفية مجموعة صفاء التكنولوجيا ؛
السلطة 1401 A / D تحويل كامبريدج الالكترونية التصميم وقد تم أخذ العينات في 3 كيلو هرتز
ارتفاع II
(الإصدار 7.07) 		كامبريدج الالكترونية التصميم استخدام البرمجيات للحصول على البيانات الكهربية
SEC-10 مكبر للصوت LX NPI الالكترونيات تستخدم مع headstage 10X
نموذج مكبر للصوت 410 براونلي الدقة تستخدم لتضخيم وتصفية الإشارات
WS-4 ك ناقص التكنولوجيا العزلة الاهتزاز للتصوير
التبريد منصة والعرف لوحة نحاسية من خلالها يتم ضخ الماء المثلج بمعدل متغير

الجدول 2. استخدام معدات.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
  2. Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular CalciumSynaptic EfficacyCalcium ImagingIntracellular RecordingAplysia GanglionCalcium Orange DyeElectrophysiology ImagingFluorescent MicroscopyCCD CameraSynaptic Plasticity

Related Articles