مقالة منهجية

مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

DOI:

10.3791/3953

⸱

مايو 25, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Extremity Trauma Research and Regenerative Medicine, United States Army Institute of Surgical Research, 2Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يركز على الاستفادة من القدرة الكامنة للخلايا الجذعية لاتخاذ جديلة من مصفوفة من خارج الخلية المحيطة بها، ويكون ذلك حافزا على التمايز إلى الظواهر المتعددة. هذا المخطوط طرق تمتد لدينا وصف وتوصيف نموذج الاستفادة من هيدروجيل bilayered، ويتألف من الربط بين الليفين والكولاجين، وإلى وقت واحد شارك في تمييز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة 1.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اكتسبت البوليمرات الطبيعية على مر السنين أكثر أهمية بسبب توافق مع الحياة التي تستضيفهم، والقدرة على التفاعل مع الخلايا في المختبر والمجراة. وثمة مجال البحوث التي تبشر بالخير في الطب التجديدي هو استخدام اندماجي من المواد الحيوية الرواية والخلايا الجذعية. استراتيجية أساسية في مجال هندسة الأنسجة هو استخدام ثلاثي الأبعاد سقالة (على سبيل المثال، decellularized المصفوفة خارج الخلية، الهلاميات المائية، مايكرو / نانو جزيئات) لتوجيه وظيفة الخلية. وقد تطورت هذه التكنولوجيا من اكتشاف أن الخلايا في حاجة الى الركيزة التي تقوم عليها يستطيعون الالتزام بها وتتكاثر، والتعبير عن النمط الظاهري الخلوية المتباينة وظيفة 2-3. وفي الآونة الأخيرة، كما قد تقرر أن الخلايا ليس فقط استخدام هذه ركائز للانضمام، ولكن أيضا تتفاعل وتأخذ العظة من الركيزة المصفوفة (على سبيل المثال، المصفوفة خارج الخلية، ECM) 4. ولذلك، فإن الخلايا والسقالات وجود اتصال متبادل أنيعمل للسيطرة على تنمية الأنسجة، وتنظيم، وظيفة في نهاية المطاف. الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من (ASCs) هي الوسيطة، والخلايا الجذعية غير hematopoetic الموجودة في الأنسجة الدهنية التي يمكن أن تظهر نسب متعددة التمايز وتكون بمثابة مصدر متاحة بسهولة من الخلايا (أي ما قبل بطائن الأوعية الدموية وpericytes). فرضيتنا هي التي يمكن أن توجه الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الظواهر المختلفة في اتجاه واحد منهم من قبل المشاركة في زراعة ببساطة في مصفوفات bilayered 1. ويركز مختبر لدينا في التئام الجروح الجلدية. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا مصفوفة واحدة مركب من المواد الحيوية الطبيعية، الليفين، والكولاجين، والشيتوزان التي يمكن أن تحاكي خصائص ووظائف بيئة جرح جلدي محددة ECM الشفاء.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الخلايا الجذعية المستمدة من الشحمي (ASCs) 1، 5

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. عزل الدهنية الفئران محيط بالكلية وبربخي وتغسل بمحلول معقم هانك والملح مخزنة (HBSS) التي تحتوي على 1٪ الجنين مصل بقري (FBS) إلى 5 الموصوفة سابقا. وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان، والرفق بالحيوان، واللائحة التنفيذية وفقا لمبادئ دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
  2. فرم الأنسجة ونقل 1-2 غرام في 25 مل من HBSS FBS تحتوي على 1٪ في أنبوب 50 مل و الطرد المركزي في 500 غ لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. جمع الأنسجة الدهنية التعويم الحر لطبقة ونقل إلى دورق مخروطي سعة 125 مل وعلاج مع 25 مل من كولاجيناز من النوع الثاني (200 يو / مل) في HBSS لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية على مدار شاكر (125 دورة في الدقيقة).
    4. إزالة بعناية جزء السائل (أقل من النفط والطبقة الدهنية) بواسطة pipeting وتصنف انها بالتتابع من خلال 100 - ميكرومتر و 70 - ميكرومتر النايلون فلتر شبكة. منبذة الراشح في 500 غ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، ويغسل بيليه مرتين مع 25 مل من HBSS.
  4. Resuspend وبيليه الخلية في 50 مل من متوسط ​​النمو (MesenPRO RS متوسطة بصل) تستكمل مع الملحق MesenPRO النمو RS، مضاد حيوي، مضاد فطري (100 يو / مل من مجموعة البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام / مل من أمفوتيريسين B)، و 2 ملم من الجلوتامين-L وخلايا ماصة في قوارير T75 2 (25 مل / قارورة).
  5. ثقافة ASC في حاضنة 5٪ 2-مرطب ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية (مرور تستخدم 2-4 ASCs لجميع التجارب).

2. إعداد الشيتوزان المجهرية (يتم أخذ خطوات التنفيذ)

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

    5. استحلب محلول مائي من الشيتوزان (6 مل من الشيتوزان ث / ت 3٪ في 0.5 متر من حامض الخليك) في 100 مل من زيت خليط مرحلة تتكون من زيت فول الصويا، N-الأوكتانول (1:2 V / V) و 5 ٪ صوربيتان-أحادية أوليئات (SPAN 80) مستحلب، وذلك باستخدام النفقات العامة (1700 دورة في الدقيقة)، والتحريك المغناطيسي (1000 دورة في الدقيقة) في وقت واحد في اتجاهين متعاكسين. هذا الأسلوب المزدوج لخلط يضمن أن المذيلات تشكلت في وقت مبكر قبل عبر ربط يحدث يمكن أن تبقى في حل وليس إلى تترسب في القاع. وعلاوة على ذلك، وتحريك شريط المغناطيسي يساعد في اجتثاث تجميع الشيتوزان خلال تشكيل micelle وrigidization.
  1. تحريك الخليط أثار بشكل مستمر لمدة ما يقرب من 1 ساعة حتى يتم الحصول على المياه مستقر في والنفط المستحلب. بدء الأيونية عبر ربط مع إضافة 1.5 مل من هيدروكسيد ث / ت 1٪ البوتاسيوم في N-الأوكتانول كل 15 دقيقة لمدة 4 ساعات (24 مجموع مل)
  2. تجفيف المجالات تعافى في مجفف فراغ وتحليل بدون مزيد من المعالجة. يمكنك تحديد الجسيمات CSM متوسط ​​الحجم والمساحة السطحية لكل مليغرام، وحجم وحدة مكعب باستخدام محلل حجم الجسيمات.
  3. لتجارب لاحقة، وغسل CSM ثلاث مرات بماء معقم لإزالة الأملاح المتبقية وتعقيم بواسطة غسل بين عشية وضحاها مع 5 مل من الايثانول المطلقة.

3. تحديدعدد المجموعات الأمينية الحرة في نظام إدارة إعالة الطفل

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. تحديد عدد من المجموعات الأمينية الحرة في الوقت الحاضر يتم أخذ خطوات التنفيذ بعد الأيونية عبر ربط باستخدام benzenesulfonic trinitro (TNBS) فحص الحمض من Bubnis وOfner 6. احتضان 5 ملغ من المجهرية مع 1 مل من محلول TNBS 0.5٪ في انبوب من الزجاج 50 مل لمدة 4 ساعات في 40 درجة مئوية، ويتحلل مع اضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك في 6N 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. تبريد عينات لدرجة حرارة الغرفة واستخراج TNBS مجانا عن طريق إضافة 5 مل من الماء منزوع الأيونات و 10 مل من الأثير الإيثيل.
  3. تدفئة قسامة 5 مل من المرحلة المائية إلى 40 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة حتى يتبخر أي الأثير المتبقية، وبارد لدرجة حرارة الغرفة، وتمييع مع 15 مل من الماء.
  4. قياس الامتصاصية في 345 نانومتر مع الطيف باستخدام TNBS حل بدون الشيتوزان كما فارغة والشيتوزان المستخدمة لص CSMتعويض لتحديد العدد الإجمالي للجماعات الأمينية. ويقدر عدد المجموعات الأمينية الحرة المجلس الأعلى للقضاء بالنسبة لالشيتوزان.

4. التحميل ASC في CSM

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. تتوازن 5 ملغ من يتم أخذ خطوات التنفيذ تعقيمها من قسم 2.5 في HBSS العقيمة بين عشية وضحاها وإضافة إلى 8 - ميكرومتر غشاء حجم المسام ثقافة إدراج لوحة (24 لوحة جيد).
  2. بعد أن يتم أخذ خطوات التنفيذ قد استقروا على الغشاء، نضح بعناية HBSS وإضافة 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الى الداخل من إدراج وميكرولتر 700 من وسائط النمو إلى الخارج من إدراج.
  3. Resuspend ASCs في تركيز مناسب (1 × 04 حتي 04 أكتوبر 10 × 4) في 200 ميليلتر من متوسط ​​النمو والبذور على CSM داخل ثقافة إدراج لوحة. الحجم النهائي من المتوسط ​​في ادخال ثقافة، بعد البذر، هو 500 ميكروليتر.
  4. Incubيأكل من المصنف ASC على يتم أخذ خطوات التنفيذ لمدة 24 ساعة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية.

5. تحديد النسبة المئوية لشركة ASC، وبقاء الخلية في نظام إدارة إعالة الطفل

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. بعد مرور فترة الحضانة، الماصة CSM ASC-تحميل في أنبوب معقم microcentrifuge 1.5 مل من دون إزعاج الخلايا التي هاجرت في غشاء إدراج.
  2. إزالة المتوسطة المتبقية وإضافة 250 ميكرولتر من متوسط ​​نمو جديدة للأنبوب.
  3. إلى كل أنبوب، إضافة 25 ميكرولتر من MTT [3 - (4،5-dimethylthiozole-2-يل) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد] حل (5 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 4 ساعات في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 مرطب حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  4. بعد مرور فترة الحضانة، وإزالة المتوسطة، إضافة 250 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل، ودوامة الخليط لمدة 2-5 دقيقة إلى ذوبان مجمع formazan.
  5. أجهزة الطرد المركزي في CSM في 2700 زلمدة 5 دقائق، الماصة قبالة طاف وتحديد الامتصاصية لها طول موجي في 570 نانومتر و 630 باستخدام قارئ لوحة قياسية، وفقا لمواصفات الشركة الصانعة MTT.
  6. تحديد عدد الخلايا المرتبطة يتم أخذ خطوات التنفيذ بالنسبة الى القيم التي تم الحصول عليها من أرقام ASC تعريف المثقف لتطوير منحنى القياسية.

6. تحضير وتوصيف ASC-CSM المضمنة في الربط بين الليفين الهلام

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. البولي ايثيلين غليكول (PEG) الليفين (PEG-الليفين) هيدروجيل أعده سوغز وآخرون 7 بحل succinimidyl غليكول البولي ايثيلين glutarate تعديل (PEG، 3400 دا). باستخدام 4 مل من تريس مخزنة المالحة (TBS، ودرجة الحموضة 7.8)، ومرشح تعقيم مع فلتر 0.22 ميكرون فقط، قبل البدء في التجربة. PEG حل فعال فقط في هذا التطبيق لساعات 3-4 الأولى.
  2. مزيج 500 &مو؛ لتر من مخزون الفيبرينوجين (40 ملغ / مل في TBS، ودرجة الحموضة 7.8) و250μl من الأوراق المالية PEG في ثقافة جيدة من لوحة 6 جيدا والحضانة لمدة 20 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية. هذا الخليط يشكل نسبة تركيز ضرس من 01:10، SG-PEG-SG: الفيزيولوجية.
  3. أخذ 250 ميكرولتر من ASC-CSM بتركيز 5 ملغ من CSM، (≈ 2 × 10 4 خلايا) وتخلط مع الحل الفيزيولوجية مضاد للفيروسات.
  4. إضافة على الفور 1 مل من الأوراق المالية الثرومبين (25U/mL) ويسحن بسرعة مرة أو مرتين مع ماصة. بعد خلط ثرومبين مع الفبرينوجين الإكسسوارات، ضع الخليط على الفور خلية جل في لوحة ال 12 جيدا والمحتضنة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للسماح للدبق كاملة. منذ ذلك الوقت دبق سريع، لا تحاول باستمرار على حل هلام داخل طرف ماصة لأكثر من 5 ثوان. والمشقوق والفيزيولوجية مضاد للفيروسات بواسطة ثرومبين ويشكل هيدروجيل الليفين مضاد للفيروسات. على هذا النحو، الويشار إلى البريد المنتج هلام نهائي لمثل الربط بين الليفين.
  5. غسل المواد الهلامية الربط بين الليفين مرتين مع HBSS واحتضان وسائل الاعلام مع الحد الأدنى من الضروري ألفا (α-MEM) تستكمل مع FBS 10٪ في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب عند 37 درجة مئوية.
  6. مراقبة الهجرة من الخلايا من CSM في هلام على مدى فترة استمرت 11 يوما باستخدام معيار تقنيات المجهر الضوئي.

7. تحضير وتوصيف ASC-CSM المضمنة في الهلام الكولاجين

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. مزيج ASC-CSM (5 ملغ تحتوي ≈ 2 × 10 4 خلايا) مع الكولاجين من النوع 1 (7.5 ملغ / مل) المستخرج من الأوتار ذيل فأر وفقا لطريقة من بورنستاين (8) وfibrillate بعد تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 6.8 باستخدام 2N هيدروكسيد الصوديوم.
  2. إضافة لييفاتي الكولاجين ASC-CSM الخليط إلى طبق من ذهب 12-جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في humidi 5٪ CO 2fied حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد الرجفان كاملة، واحتضان والمواد الهلامية الكولاجين ASC-CSM لمدة تصل إلى 11 يوما في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية.
  4. مراقبة الهجرة من الخلايا من CSM في هلام على مدى فترة استمرت 11 يوما باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية.

8. تطوير Bilayered الربط بين الليفين-(ASC-CSM) التركيبات جل الكولاجين

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. لتطوير طبقة ثنائية بناء، وإعداد كل من الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين على النحو الموصوف أعلاه، مع تعديلات طفيفة. لفترة وجيزة، لدراسة خصائص المهاجرة والتعاون الاستقراء، من مصدر واحد من الخلايا الجذعية باستخدام اثنين من bioscaffolds، "شطيرة" وASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين الكولاجين والسقالات الربط بين الليفين باستخدام عملية من أربع خطوات: 1) ASC تحميل على CSM، 2) يلقي ييفاتي هلام الكولاجين وطبقة حبات ASC-CSM على العقيدلاجين هلام، 3) الزهر الربط بين الليفين الجل على هلام ASC-CSM-الكولاجين والسماح للهلام ليصلب، و 4) إضافة إلى متوسط ​​جيد وتدرج في دراسة الخلايا في المختبر أو إزالتها من إدراج للتطبيقات في الجسم الحي (انظر الشكل 1 ).
  2. إعداد نوع 1-1 مل الكولاجين (7.5 ملغ / مل) خليط كما هو موضح أعلاه في 7.1، دون إضافة ASC-CSM إلى الخليط. ضع الخليط في ادخال زراعة الأنسجة 6-جيدا (8 ميكرون حجم المسام)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب على 37 درجة مئوية.
  3. بعد اكتمال طبقة، الرجفان على مدى 5 ملغ الكولاجين سطح ASC-CSM (10، 000 خلية / ملغ) أوقف في وسائل الإعلام ثقافة (200 ميكرولتر). بعد المجهرية التي استقرت على مدى جيل، وإعداد جيل الربط بين الليفين كما هو موضح في القسم 6.0، دون إضافة ASC-CSM إلى الخليط، وطبقة ومضاد للفيروسات الفيزيولوجية / ثرومبين حل أكثر من طبقات ASC-CSM-الكولاجين. عند إعداد جيل الربط بين الليفين، استخدم 250 ميكرولتر من مستنبت الخلية في مكان رهو 250 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على خلايا.
  4. وبمجرد الانتهاء، احتضان البنى لمدة 30 دقيقة في حاضنة 5٪ CO 2 مرطب لتحقيق دبق كاملة قبل تغذي التصور مع الثقافة المتوسطة.
  5. بعد دبق كاملة، ومكان 1 مل من المتوسط ​​في مجلس الشيوخ خلال بناء و3 مل من المتوسط ​​في مجلس النواب.

9. مما يجعل الحلول المالية

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  • الكالسيوم المخزون كلوريد (40 ملم): استخدم فقط CaCl 2 0.2 H 2 O. حل 588.4 ملغ من CaCl 2 0.2 H 2 O مع 100 مل من الماء منزوع الأيونات. تعقيم باستخدام فلتر 0.22-ميكرون.
  • البولي ايثيلين جلايكول: الربط هو شديد التفاعل مع الأكسجين، ويمكن أن تصبح تتأكسد عند تعرضها للهواء الغرفة. على هذا النحو، ينبغي تخزين PEG تحت النيتروجين (N 2) الغلاف الجوي. لجنة التنسيق الإداريةوزن urately 32 ملغ في أنبوب الطرد المركزي 2-مل (تأكد لتطهير أنابيب مع N 2 قبل الاستعمال) ومخزن في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. حل 32 ملغ من PEG في 4 مل من محلول TBS قبل الاستخدام.
    يجب أن تكون الحلول التالية الطازجة قبل كل تجربة.
  • TBS حل: (7،75-7،77 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية، درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية حرجة للغاية). للتحضير 15 مل من محلول TBS، حل بعناية قرص واحد العازلة في فلتر تعقيم الماء منزوع الأيونات والتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة. لا تخزن المخزون حل التحضير أنها جديدة كل مرة.
  • حل الفيزيولوجية: (40 ملغ / مل). حل مسحوق الفيزيولوجية في TBS لجعل تركيز الفيبرينوجين 40 ملغ / مل. حلها بين عشية وضحاها باستخدام محرك مغناطيسي في 4 درجات مئوية. فمن الأسهل على حل كامل 1-G مع كمية المبلغ المطلوب من TBS. في اليوم التالي، وإزالة الفيزيولوجية من 4 درجات مئوية (غائم عادة) والسماح لهالتدفئة في حمام مائي حتى يتم الحصول على حل متجانسة. أخيرا، تصفية تعقيم الفيزيولوجية باستخدام فلتر 0.45-ميكرون.
  • ثرومبين حل (25 وحدة / مل): لجعل الحل ثرومبين، تزن من المبلغ المطلوب وحل مع 40 ملم معدة CaCl 2 0.2 H 2 O. انها دائما ممارسة جيدة لاستخدام قارورة كاملة من ثرومبين لجعل الأوراق المالية. على سبيل المثال: ذوب زجاجة ثرومبين كو 5 مع 200 ملم من 0.2 CaCl 2 H 2 O، قسامة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

10. ممثل النتائج

والهدف العام لهذه التقنية المقدمة هنا هي للتدليل على إمكانية التفريق مصفوفة يحركها وقت واحد من ASC إلى الظواهر متعددة باستخدام CSM كوسيلة التسليم. علينا أن نبرهن استراتيجية في المختبر لتوفير الخلايا الجذعية من يتم أخذ خطوات التنفيذ في سقالة الكولاجين الربط بين الليفين bilayered. توصيف ASC جزءا لا يتجزأ من ضمن هذه reveale سقالةد التي يمكن ASC محملة يتم أخذ خطوات التنفيذ "محصورة" بين طبقة الكولاجين وPEG الليفين في وقت واحد وبشكل مختلف اتخاذ جديلة من كلا بيئات خارج الخلية لتزدهر في ظل الظروف الجديدة. نحن يتميز أولا القدرة لنظام نموذجي للحفاظ على بقاء الخلية والقدرات المهاجرة. أيد الكولاجين قدرة ASCs للمحافظة على "stemness"، كما تجلى من قبل التعبير عنها من Stro-1 وعلى الخلايا الليفية، مثل التشكل (الشكل 2D و 2F). في المقابل، بفعل الربط بين الليفين في ASCs للتمييز نحو النمط الظاهري الأوعية الدموية، كما يتضح من الشكل الظاهري لها بنية أنبوب يشبه، على البطانية خلية محددة التعبير عن عامل فون ويلبراند (2E الشكل و2G)، وخلية حوطية محددة من التعبير NG2 والصفائح الدموية المشتقة مستقبلات عامل النمو بيتا (PDGFRβ) (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، فإن هذه الظواهر المرصودة بدا أن يحدث في وقت مبكر في الثقافة، وتمت المحافظة على أكثر من 11 يوما، كما هو ماركاonstrated في الشكل 3.

الجداول والأرقام

فوائد طبقة ثنائية أنشئ:

  • لا يمكن للسقالة وحدها دون أداء الخلايا كما سقالة النشطة بيولوجيا.
  • ويمكن الربط بين الليفين حث الخلايا الجذعية للتمييز بدون إضافة عوامل النمو.
  • يمكن الكولاجين المساعدة في الحفاظ على النمط الظاهري الخلايا الجذعية من ASCs.
  • ويمكن استخدام تأنشا طبقة ثنائية باعتبارها الركيزة نشطة لأنواع الخلايا الأخرى للهجرة وتتكاثر (على سبيل المثال، الخلايا البطانية، الخلايا الليفية، الخلايا القرنية، وخلايا العضلات الملساء، pericytes).
  • ويمكن استخدامه مع السقالات هندسة الأنسجة التي يصعب مثل العظام hydroxyaptite أو المنزوع المعادن على تجديد أنسجة الصلبة والناعمة.
  • ويمكن استخدامه لتطوير متعددة الطبقات، متنوع النسيج الهندسة التصور (مثل الجلد والأوعية الدموية، الأوعية الدموية، الظهارية، عن طريق الجلد والأوعية الدموية تحت الجلد، وغيرها).
  • ويستخدم مصدر وحيد الخلية لتطوير واحدحجرات متعددة الخلايا.
  • فمن لديه القدرة على الاندماج مع الأنسجة المضيف لأنه هو من أصل طبيعي.
  • CSM داخل التركيبة هلام يوفر منبرا للخلايا لترحيل من.
  • الشيتوزان، وتستخدم لإعداد CSM، هي معروفة نشط الكيماوي جاذبة.
  • ويمكن تطبيق المفهوم العام المطبقة في هذا البروتوكول من "مصفوفة يحركها تمايز الخلايا الجذعية" على غيرها من أنواع الخلايا الجذعية. ومع ذلك، هناك ما يبرر اجراء مزيد من التحقيقات لتحديد الجدوى من مصفوفة يحركها تمييز. لا يمكن للbilayered هلام سقالة بمثابة خزان لتسليم الخلايا بطريقة مستدامة والتي تسيطر عليها.
  • بعد إعادة الإعمار، لا يزال من المواد الهلامية لا يمكن فصلها إلى مكونات فردية.

figure-protocol-1
الشكل 1. تخطيطي يصور الهدف العام وعملية لهذه التقنية. 1) الخلايا الجذعية المشتقة من الشحمي (ASCs) هي الصغرىaded على المجهرية الشيتوزان. 2) ثم يسكب الكولاجين في إدراج 6-جيدا، ودرجة الحموضة تعديلها لfibrillate الكولاجين، وإدراج وضعت في غرفة لوحة 6 جيدا. والطبقات ثم المجالات CSM ASC محملة على مادة الكولاجين. 3) ثم يتم سكب الفيزيولوجية مضاد للفيروسات على الكولاجين (ASC-CSM)، وتبلور من خلال إضافة ثرومبين. يمكن 4) ثم إن البناء طبقة ثنائية نهائي شطبها من إدراج الثقافة وتستخدم لفي المختبر أو في تحليل الجسم الحي.

figure-protocol-2
الشكل 2. توصيف ASC زرعها داخل الكولاجين والربط بين الليفين المصفوفات 3D. passaged A) المرحلة على النقيض من صورة مجهرية من ASC المعزولة والحفاظ على روتين باستخدام 2-الأبعاد تقنيات زراعة الخلايا. Photomicrographs B و D و F تصوير ASC-CSM زرعها داخل هلام الكولاجين 3-الأبعاد، بينما C، E، G، وعرض ASC-CSM زرعها داخل هلام PEG-3-الليفين الأبعاد، سواء في يوم 12. في باء وجيم)، وترد ASCs المهاجرة بعيدا عن المجال CSM في كلا النوعين سقالة. ASCs ويبدو أن بالارض، المغزل، مثل التشكل في الكولاجين (B)، مع المحافظة على التعبير عنها من علامة الخلية الجذعية Stro-1 (D؛ السهم). عندما تربيتها في الربط بين الليفين ASCs يحمل أكثر أنبوب يشبه الهياكل وحثهم على التعبير عن هذه الخلية علامات الأوعية الدموية وعامل فون ويلبراند (E). انتقال المجهر الإلكتروني يصور مورفولوجيا النموذجية التي أظهرتها ASCs داخل كل سقالة. ASCs في هلام الكولاجين تظهر لديهم أصغر أرجل كاذبة خيطية (فلوريدا) وتمتد من جسم الخلية (F)، في حين شكلت ASCs عادة lumenal (المسمى L) هياكل (G؛ السهم).

figure-protocol-3
الشكل 3. التحليل الصرفي من ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين طبقات ثنائية الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين. كانت "محصورة" ASC، يتم أخذ خطوات التنفيذ بين الكولاجين والمواد الهلامية الربط بين الليفين والمحافظة عليها في ثقافة لمدة 11 يوما. وcolu اليسارمليون يصور ASCs المهاجرة والمنتشرة داخل المصفوفة الكولاجين ويبدو أن تأخذ على التشكل مثل مغزل. العمود الأيمن يصور ASCs المهاجرة بعيدا عن يتم أخذ خطوات التنفيذ وتشكيل أنبوب يشبه الهياكل في جميع أنحاء هلام الربط بين الليفين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وASCs معروفة لسهولة لهم من العزلة والقدرة على التمييز تجاه مختلف أنواع الخلايا. مع التقنيات الموضحة في هذه المخطوطة، ونحن قادرون على استغلال اللدونة من ASCs من خلال تعريض هذه الخلايا إلى biomatrices متعددة في وقت واحد. كما الخلايا تهاجر بعيدا عن قاعدة CSM ويدخل بيئتهم المحيطة خارج الخلية، وخلايا اتخاذ جديلة من السقالة، ويمكن الحفاظ على إما "stemness" (الكولاجين) أو يكون ذلك حافزا للتفريق نحو أنواع الخلايا الأوعية الدموية والأوعية الدموية الداعمة-(الليفين). منذ مهتمة مختب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا المصالح المتنافسة المالية موجودة.

براءة الذمة

آراء أو التأكيدات الواردة في هذه الوثيقة هي وجهات نظر خاصة من كتاب ولا يمكن تفسيره بأنه مسؤول أو يعكس وجهات النظر من وزارة الدفاع أو الحكومة الأمريكية. الكتاب هم من العاملين في حكومة الولايات المتحدة، وأعدت هذا العمل كجزء من واجباتهم الرسمية. وأيد كل العمل الذي قامت به الولايات المتحدة للبحوث الطبية للقوات المسلحة وقيادة العتاد. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار بروتوكول مراجعتها والموافقة عليها من قبل الولايات المتحدة للبحوث الطبية للقوات المسلحة والعتاد مجلس القيادة المؤسسية ومراجعة وفقا للبروتوكول المعتمد.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان مدعوما من قبل SN منحة زمالة ما بعد الدكتوراه في الهندسة من بيتسبرغ مبادرة الأنسجة. ويدعم منطقة دبي للتعهيد عن طريق منحة من منح المؤسسة جنيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف / معدات شركة فهرس العدد تعليقات
هانكس المتوازن محلول ملحي (HBSS) Gibco 14175 الاستهلاكية
الأبقار مصل الجنين Hyclone SH30071.03 الاستهلاكية
كولاجيناز النوع الثاني سيغما الدريخ C6685 الاستهلاكية
70 ميكرومتر النايلون شبكة تصفية العلوم البيولوجية دينار بحريني 352350 الاستهلاكية
100 ميكرومتر النايلون شبكة تصفية العلوم البيولوجية دينار بحريني 352360 الاستهلاكية
MesenPRO النظام نمو متوسطة إينفيتروجن 12746-012 الاستهلاكية
L-الجلوتامين Gibco 25030 الاستهلاكية
CaCl 2 0.2 H 2 O سيغما C8106 الاستهلاكية
T75 قارورة زراعة الأنسجة العلوم البيولوجية دينار بحريني 137787 الاستهلاكية
الشيتوزان سيغما الدريخ 448869 الاستهلاكية
حمض الخليك سيغما الدريخ 320099 الاستهلاكية
N-أوكتانول العضوية Acros 150630025 الاستهلاكية
صوربيتان-أحادي أوليئات سيغما الدريخ S6760 الاستهلاكية
هيدروكسيد البوتاسيوم سيغما الدريخ P1767 الاستهلاكية
الأسيتون فيشر العلمية L-4859 الاستهلاكية
الإيثانول سيغما الدريخ 270741 الاستهلاكية
Trinitro Benzenesulfonic حمض سيغما الدريخ P2297 الاستهلاكية
حامض الهيدروكلوريك سيغما الدريخ 320331 الاستهلاكية
إثيل الأثير سيغما الدريخ 472-484 الاستهلاكية
8 ميكرون إدراج اللوحة زراعة الأنسجة العلوم البيولوجية دينار بحريني 353097 الاستهلاكية
أنابيب Microcentrifuge 1.5 مل الصياد 05-408-129 الاستهلاكية
MTT الكاشف إينفيتروجن M6494 الاستهلاكية
ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيغما الدريخ D8779 الاستهلاكية
Qtracker خلية كيت وصفها (ستعقب 655) الجزيئية تحقيقات Q2502PMP الاستهلاكية
اكتب 1 الكولاجين Travigen 3447-020-01 الاستهلاكية
هيدروكسيد الصوديوم سيغما الدريخ S8045 الاستهلاكية
12-حسنا لوحات نسيج الثقافة العلوم البيولوجية دينار بحريني 353043 الاستهلاكية
الفبرينوجين سيغما F3879 الاستهلاكية
ثرومبين سيغما T6884 الاستهلاكية
Benztriazole المشتقة من البولي ايثيلين Sunbio DE-034GS الاستهلاكية
تريس العازلة اللوحي (درجة الحموضة 7.6) سيغما T5030 الاستهلاكية
نبذ إيبندورف 5417R الخيليةpment
شاكر المداري نيو برونزويك Scienctific C24 معدات
مرطب حاضنة ثاني أكسيد الكربون مع الهواء-5 2٪ الحرارية العلمية نموذج 370 معدات
فوق النمام IKA Visc6000 معدات
النمام المغناطيسي كورنينج PC-210 معدات
فراغ المجفف - - معدات
حجم الجسيمات محلل مالفيرن STP2000 Spraytec معدات
ماء الحمام فيشر العلمية Isotemp210 معدات
طيفي بيكمان بيكمان كولتر DU الطيف 800UV/Visible معدات
دوامة Diagger 3030a معدات
Microplate قارئ الجزيئية الأجهزة SpectraMax M2 معدات
ضوء / الإسفار مجهر أوليمبوس IX71 معدات
متحد البؤر المجهر أوليمبوس FV-500 ليزر متحد البؤر المجهر معدات
المجهر الإلكتروني كارل زايس MicroImaging 435 ليو نائب الرئيس معدات
انتقال الكترون المجهر JEOL JEOL 1230 معدات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Adipose Derived Stem CellsChitosan MicrospheresCollagen GelPEG Fibrin GelStem Cell MigrationWound Healing ScaffoldExtracellular MatrixTissue Engineering

مقالات ذات صلة