مقالة منهجية

أسرع وارتفاع القرار، وطن متري سنويا، GFP القائم على الفحص فيوجن الميتوكوندريا الحصول على بيانات حركية من خلايا متعددة في طريق موازية متحد البؤر المجهري

18.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3991

⸱

يوليو 20, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Center for Neuroscience Research, Tufts School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Geriatrics & Gerontology, Wake Forest Baptist Medical Center, 3Department of Medicine, Boston University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

وقد تم قياس انصهار الميتوكوندريا من خلال تتبع من موازنة GFP المصفوفة التي تستهدف photoconverted عبر الشبكة الميتوكوندريا مع مرور الوقت. حتى الآن، يمكن أن تتعرض خلية واحدة فقط لتحليل الحركية ساعة طويلة في وقت واحد. نقدم أسلوب الذي يقيس خلايا متعددة في وقت واحد، بذلك تسرع من عملية جمع البيانات.

الملخص

يلعب الاندماج الميتوكوندري دوراً أساسياً في التوازن الداخلي لكالسيوم الميتوكوندريا، والطاقة الحيوية، والبلعمة الذاتية، ومراقبة الجودة. ويتم قياس الاندماج في الخلايا الحية عن طريق التحويل الضوئي لبروتين GFP القابل للتنشيط الضوئي والموجه نحو الماتريكس (mtPAGFP) في مجموعة فرعية من الميتوكوندريا. ويُستخدم المعدل الذي تتوزع به الجزيئات المحولة ضوئياً بالتساوي عبر كامل مجتمع الميتوكوندريا كمقياس لنشاط الاندماج. وحتى الآن، كانت القياسات تُجرى باستخدام نهج التصوير الزمني لخلية واحدة، حيث يتم قياس التوازن في خلية واحدة على مدار ساعة. وهنا، نقوم بتوسيع وأتمتة طريقة الخلايا الحية المنشورة سابقاً والقائمة على استخدام mtPAGFP وتركيز منخفض من TMRE (15 nm). تتضمن هذه الطريقة التنشيط الضوئي لجزء صغير من الشبكة الميتوكوندرية، وجمع مجموعات عالية الدقة من المقاطع البؤرية كل 15 min لمدة 1 hour، وقياس التغير في شدة الإشارة. واعتماداً على عدة عوامل، مثل سهولة العثور على الخلايا التي تعبر عن PAGFP، وإشارة المناطق المنشطة ضوئياً، يمكن جمع حوالي 10 خلايا ضمن الفواصل الزمنية البالغة 15 min. ويوفر هذا تحسناً كبيراً في الكفاءة الزمنية لهذا المقايسة مع الحفاظ على القياس الكمي عالي الدقة دون الخلوية، بالإضافة إلى المعاملات الحركية اللازمة لرصد تفاصيل سلوك الميتوكوندريا في بيئتها البنائية الخلوية الأصلية.

تلعب ديناميكيات الميتوكوندريا دوراً في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك التنفس، وتنظيم الكالسيوم، والموت الخلوي المبرمج1,2,3,13. وتؤثر بنية الشبكة الميتوكوندرية على وظيفة الميتوكوندريا، وعلى الطريقة التي تتفاعل بها مع بقية الخلية. ومن خلال عمليات الانقسام والاندماج المستمرة، تكتسب الشبكات الميتوكوندرية أشكالاً متنوعة تتراوح من الشبكات شديدة الاندماج إلى أن تكون أكثر تجزؤاً. ومن المثير للاهتمام أن مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، ومرض شاركو ماري توث 2A، وضمور العصب البصري السائد قد ارتبطت جميعها بتغير مورفولوجيا الميتوكوندريا، وتحديداً الشبكات المجزأة4,10,13. وفي كثير من الأحيان، تصبح الميتوكوندريا غير مستقطبة عند التجزؤ، ويؤدي تراكم ذلك إلى ضعف وظائف الخلية18. وقد تبين أن انشطار الميتوكوندريا يرسل إشارة للخلية للمضي قدماً نحو الموت الخلوي المبرمج، كما يمكن أن يوفر آلية لفصل الميتوكوندريا غير المستقطبة وغير النشطة للحفاظ على قوة معظم الشبكة14. ومن ناحية أخرى، يؤدي اندماج الميتوكوندريا إلى مشاركة بروتينات المصفوفة، والمواد المذابة، وmtDNA والتدرج الكهروكيميائي، ويبدو أيضاً أنه يمنع التقدم نحو الموت الخلوي المبرمج9. إن كيفية تأثير انشطار واندماج الميتوكوندريا على التوازن الخلوي وبشكل نهائي على عمل الكائن الحي تتطلب مزيداً من الفهم، وبالتالي فإن التطوير والتحسين المستمر لكيفية جمع المعلومات حول هذه الظواهر يعد أمراً ضرورياً.

كشفت فحوصات اندماج الميتوكوندريا الحالية عن رؤى متنوعة حول فيزيولوجيا الميتوكوندريا، حيث يتميز كل منها بمزايا خاصة. يقوم فحص الاندماج الهجين باستخدام PEG7 بخلط مجموعتين من الخلايا ذات وسمات مختلفة (mtRFP وmtYFP)، ثم يحلل مقدار الاختلاط والتموضع المشترك للفلوروفورات في الخلايا المندمجة ومتعددة النوى. ورغم أن هذه الطريقة قدمت معلومات قيمة، إلا أنه لا يمكن لجميع أنواع الخلايا الاندماج، كما أن الظروف التي يتم فيها تحفيز الاندماج تتضمن استخدام عقاقير سامة قد تؤثر على عملية الاندماج الطبيعية. ومؤخراً، تم ابتكار تقنية خالية من الخلايا تعتمد على استخدام الميتوكوندريا المعزولة لمراقبة أحداث الاندماج بناءً على فحص اللوسيفيراز1,5. يتم استهداف خطين خلويين بشريين إما بالجزء الطرفي الأميني أو الكربوكسيلي لإنزيم رينيلا لوسيفيراز (Renilla luciferase) جنباً إلى جنب مع سحاب الليوسين (leucine zipper) لضمان حدوث عملية الديمرة عند الخلط. يتم عزل الميتوكوندريا من كل خط خلوي ثم دمجها. يمكن أن يحدث تفاعل الاندماج بدون السيتوسول تحت ظروف فيزيولوجية في وجود الطاقة، ودرجة الحرارة المناسبة، وجهد الغشاء الميتوكوندري الداخلي. ومن المثير للاهتمام أنه وجد أن السيتوسول ينظم مدى الاندماج، مما يثبت أن إشارات الخلية تنظم عملية الاندماج 4,5. وسيكون هذا الفحص مفيداً جداً في عمليات الفحص عالي الإنتاجية لتحديد مكونات آلية الاندماج وأيضاً المركبات الدوائية التي قد تؤثر على ديناميكيات الميتوكوندريا. ومع ذلك، ستكون هناك حاجة إلى فحوصات ميتوكوندريا خلوية كاملة أكثر تفصيلاً لاستكمال هذا الفحص المختبري لمراقبة هذه الأحداث داخل البيئة الخلوية.

تُستخدم تقنية لمراقبة ديناميكيات الميتوكوندريا في الخلية الكاملة منذ فترة من الزمن، وهي تعتمد على بروتين GFP القابل للتنشيط الضوئي والموجه نحو الميتوكوندريا (mtPAGFP)6,11. عند التعبير عن mtPAGFP، يتم تنشيط جزء صغير من شبكة الميتوكوندريا ضوئياً (10-20%)، ويتم تسجيل انتشار الإشارة إلى بقية شبكة الميتوكوندريا كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة باستخدام التصوير المجهري البؤري بنظام الفاصل الزمني. تؤدي كل عملية اندماج إلى تخفيف شدة الإشارة، مما يتيح قياس معدل الاندماج. وعلى الرغم من أن عمليتي الاندماج والانقسام تحدثان باستمرار في الخلايا، فإن هذه التقنية تراقب الاندماج فقط لأن الانقسام لا يؤدي إلى تخفيف إشارة PAGFP6. ويسمح التوسيم المشترك بمستويات منخفضة من TMRE (7-15 nM في خلايا INS1) بقياس الجهد الغشائي للميتوكوندريا. فعندما تكون الميتوكوندريا في حالة فرط استقطاب، فإنها تمتص المزيد من TMRE، وعندما يحدث لها زوال استقطاب، فإنها تفقد صبغة TMRE. أما الميتوكوندريا التي تعاني من زوال الاستقطاب فلم يعد لديها جهد غشائي كافٍ وتميل إلى عدم الاندماج بكفاءة، إن حدث ذلك أصلاً. لذلك، يمكن تتبع الميتوكوندريا النشطة في الاندماج باستخدام هذه المستويات المنخفضة من TMRE9,15. قد يكون تراكم الميتوكوندريا التي تعاني من زوال الاستقطاب والتي تفتقر إلى إشارة TMRE علامة على السمية الضوئية أو موت الخلايا. وتجعل التركيزات الأعلى من TMRE الميتوكوندريا حساسة جداً لضوء الليزر، ولذلك يجب توخي الحذر الشديد لتجنب التوسيم المفرط بـ TMRE. وإذا كان موضوع الاهتمام هو تأثير زوال استقطاب الميتوكوندريا، فيمكن استخدام تقنية تعتمد على مستويات أعلى قليلاً من TMRE وضوء ليزر أكثر كثافة لإحداث زوال استقطاب الميتوكوندريا بطريقة محكومة (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). ولضمان عدم وجود مشكلة تتعلق بالسمية الناتجة عن TMRE، نقترح تعريض الخلايا المحملة (3-15 nM TMRE) لمعايير التصوير التي ستُستخدم في المقايسة (ربما 7 مجموعات من 6 مقاطع بصرية متتالية)، وتقييم صحة الخلايا بعد ساعتين. وإذا بدت الميتوكوندريا مجزأة للغاية وكانت الخلايا تموت، يمكن استخدام علامات ميتوكوندريا أخرى، مثل dsRED أو Mitotracker red بدلاً من TMRE.

كشفت طريقة mtPAGFP عن تفاصيل حول سلوك الشبكة الميتوكوندرية لم يكن من الممكن تصورها باستخدام طرق أخرى. فعلى سبيل المثال، نعلم الآن أن الاندماج الميتوكوندري يمكن أن يكون كاملاً أو عابراً، حيث يمكن لمحتوى الماتريكس أن يمتزج دون تغيير المورفولوجيا العامة للشبكة. بالإضافة إلى ذلك، نعلم أن احتمالية الاندماج مستقلة عن مدة التلامس وأبعاد العضية، وتتأثر بحركية العضية، والجهد الغشائي، وتاريخ نشاط الاندماج السابق8,15,16,17.

نصف في هذه المخطوطة منهجية لتوسيع نطاق البروتوكول المنشور سابقاً باستخدام mtPAGFP و 15nM TMRE8 من أجل فحص خلايا متعددة في وقت واحد وتحسين الكفاءة الزمنية لجمع البيانات دون التضحية بدقة التحليل تحت الخلوية. وقد أصبح هذا ممكناً من خلال استخدام منصة مجهرية مؤتمتة، وبرمجيات قابلة للبرمجة لالتقاط الصور. يتيح برنامج Zen من شركة Zeiss للمستخدم تحديد وتتبع عدة خلايا معينة تعبر عن mtPAGFP. ويمكن تنشيط كل خلية من هذه الخلايا ضوئياً في منطقة اهتمام محددة، كما يمكن مراقبة مجموعات من المقاطع البؤرية (confocal slices) لرصد إشارة mtPAGFP بالإضافة إلى TMRE في فواصل زمنية محددة. ويمكن استخدام أنظمة بؤرية أخرى لتنفيذ هذا البروتوكول شريطة توفر منصة مؤتمتة قابلة للبرمجة، وحاضنة تحتوي على CO2، ووسيلة لتنشيط PAGFP ضوئياً؛ سواء كان ذلك باستخدام ليزر متعدد الفوتونات أو ليزر ديود بطول موجي 405 nm.

البروتوكول

1. صورة طبق التحضير

  1. ثقافة INS1 الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على مستوى RPMI الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 5 مم NaHCO 3، 2 HEPES مم، حمض البيروفيك 2 ملم، و 11 مللى جلوكوز إلى التقاء 80٪.
  2. يعرض للتريبسين الثقافات الخلية INS1 مع التربسين 0.05٪، وطبق لهم على بولي-D-يسين المغلفة لوحات التصوير ساترة القاع (30-40 التقاء٪).
  3. السماح لوحات للوصول إلى نقطة التقاء 60-80٪ (~ 2 أيام) وإضافة مصفوفة الميتوكوندريا المستهدفة (COXVIII) الفيروسة الغدانية PA-GFP لمدة 24 ساعة (وزارة الداخلية = 5). وسائل الاعلام والسماح لتبادل الخلايا في النمو لمدة يوم 2 قبل التصوير.
  4. في يوم من التصوير، إضافة 7-15 TMRE نانومتر إلى لوحات التصوير، ويوازن ما لا يقل عن 45 دقيقة.
  5. خلال هذا الوقت على دور الحاضنة (وقد استخدمت مرحلة أعلى حاضنة هنا) والسماح للمجهر لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة. بدوره على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.

2. معلمات التصوير للمجهر زايس 710 LSM متحد البؤر

  1. بعد مجهر لديه معايرتها، تحت علامة التبويب اكتساب، انقر على "أدوات عرض دليل"، وفتح التصوير إعداد الفريق، واختيار "قناة واسطة" والتبديل تتبع كل "الإطار".
  2. في لوحة مسار الضوء، واختيار LSM ووضع قناة. العمل من رمز عينة التصاعدي، حدد "الخلفية"، MBS 690 +، وMBS 488. في الجزء السفلي من لوحة، واختيار "T-PMT" لتمكين التصور من مجال مشرق أو قناة مدينة دبي للإنترنت.
  3. الانتهاء من تعديل مسار ضوء المعلمات عن طريق تحديد النطاق للصبغ GFP إلى 490-540 نانومتر، وإلى 580-700 نانومتر لصبغ TMRE.
  4. في وضع حيازة واستخدام 512 × 512 بكسل مجال المسح الضوئي، 4x ومتوسط، واختيار عامل التكبير (والتي قد ترغب في الاحتفاظ بما يتفق لأغراض المعايرة).

3. تحقيق الاستفادة المثلى من معلمات التصوير

  1. باستخدام خطة لامزيغ 100X (1.4 NA) هدف عدسة، FOCلنا في الخلايا الخاصة بك مع ضوء الهالوجين، وليس ضوء الفلورسنت، لحماية الميتوكوندريا من الضيائية.
  2. شاشة للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP الخلايا باستخدام ذات الثقب مفتوحة الى اقصى حد ممكن والمسح الضوئي للعثور على الخلايا التي هي أكثر إشراقا الخضراء.
  3. العثور على أدنى قوة ليزر 2-الفوتون اللازمة لتفعيل السلطة الفلسطينية وGFP وتحسين المعلمات التصوير ضمان أن يكون إشارة لا تشبع كاشف. تأكد من أن إشارة PA-GFP colocalizes مع الإشارة TMRE لسلسلة-Z قليلة. خسارة للإشارة إلى الاستقطاب TMRE الميتوكوندريا أو الضيائية، والخلايا العارضة لا ينبغي أن تستخدم هذه الخصائص للتحليل.
  4. العثور على خلية للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP وتحديد عامل التكبير.
  5. تعيين نطاق Z-سلسلة لجمع 6 شرائح (هذا النطاق سوف تحتاج إلى تلبية جميع الخلايا 10 ما لم يتم تعيين محدد Z-التركيز في كل موقف).
  6. حفظ طريقة التصوير لكل خلية (خلية 1، الخلية 2 وما إلى ذلك).

4. ضبط آليد الجزء من البرنامج ويعين خلايا 10 سوف تتبع لفحص ساعة 1 فيوجن الميتوكوندريا

  1. في اللوحة اليسرى من النافذة multitime، حدد "حفظ" لوحة، وتحديد الموقع الذي سيتم فيه حفظ الملفات.
  2. في لوحة "شراء"، تحميل طريقة اكتساب حفظها للخلية 1 في تكوين المسح الضوئي والتحقق من المربع مكدس ض. أيضا اختيار "علامة Z-وسط كومة Z".
  3. في لوحة "لبنات"، حدد "كتلة واحدة في كل مكان". انقر على "كتل إضافة" لكل فترة إلى أن يقاس.
  4. في لوحة "توقيت"، حدد "الانتظار الفاصلة" ونوع "0" في "فترة الانتظار قبل كتلة في الموقع الأول فقط". وسوف كتل 2-4 لديهم "15 دقيقة" في هذا القسم.
  5. في لوحة الموقع، واختيار "نقل التركيز إلى تحميل الموقف بين المواقع" و "تحميل مسح التكوين عندما 'نقل إلى الموضع" أو النقر على "التالي الموضع". وبموجب "لائحة المواقع تحرير" اختر "مسح جميع"، ومن ثم تحديد "متعددة المواقع بمحركات المرحلة ".
  6. اوندإيه "بليتش" لوحة، انقر على "تبييض" مربع، وتعيين ملف التكوين في "التكوين" سحب أسفل القائمة، على النحو المحدد في إطار البرنامج الرئيسي. ثم، في إطار "التبييض"، حفظ طريقة تنشيط ضوئي مناسب. في لوحة المناطق، واختيار العائد على الاستثمار لهذه الخانة بصفة خاصة، وإضافة هذا العائد على الاستثمار إلى multitime عن طريق اختيار "المنطقة الحالية إضافة إلى عائد الاستثمار قائمة" نافذة. تأكد من تحديد الموقع نفسه في "ROI" سحب أسفل القائمة.

بالنسبة لتوقيت للعمل بشكل صحيح، ولكل خلية أن يكون الفاصل الزمني 15 دقيقة، واثنين من الطرق بحاجة ليتم حفظها. في قائمة الكتل، وسوف يكون أول واحد "الحقيقي" تكوين تنشيط ضوئي، والباقي سيكون لها "وهمية" التكوين الذي لا يستخدم ليزر ثنائي الفوتون. سيكون اللبنة الأولى أيضا أن تكون الكتلة الوحيدة التي ليس لديها تأخير (BKIntv = 0). ولذلك، فإن الطريقة يبدأ مسح خط الأساس واحد، يتبعه فحص تنشيط ضوئي. ما تبقى من كتل لديها 900 ثانية BkIntv، وفي كل نقطة زمنية هناك نوعان من المسح تماما كما في الوقت 0 ثانية، للحفاظ على اتساق توقيت.

  1. لكل واحد من الخلايا 10 التي يتعين اتباعها مع مرور الوقت، تنفيذ هذا التسلسل:
    العثور على PAGFP معربا عن خلية حفظ منهجه التصوير
    موقع لوحة، بمناسبة موقف مرحلة، وتحديد طريقة التصوير
    الرئيسية ROI لوحة، اختيار المنطقة من اهتمام لتكون لوحة بليتش photoactivated-ROI حفظ محددة، وأيضا تحميله في المربع العائد على الاستثمار:
    محو العائد على الاستثمار وإعادة تعيين التكبير المسح إلى 1
    العثور على الخلية التالية وتعيين التكبير
    تكرار هذه العملية للحصول على الخلايا 9 التالي

تأكد من أن كل موقع ويمنع كل مرحلة لها أسلوب التصوير المناسبة (مسح التكوين) المرتبطة بها. أيضا التأكد من أن كتلة الأول في كل موقع يتوافق مع طريقة تنشيط ضوئي مناسبة في حين أن بقية تحتوي على "وهمية" الأسلوب. أخيرا، حدد "تشغيل".

5. تحليل قوة إشارة PA-GFP

    للحصول على الخلايا التي في إشارة photoactivatable-GFP colocalizes مع الإشارة TMRE أحمر، طرح الخلفية في الصور PAGFP (هنا نستخدم metamorph).
  1. ثم تصدير البيانات إلى Excel وحساب متوسط ​​كثافة لZ-المداخن في كل نقطة زمنية. تجاهل المقاطع البصرية التي ليس لها إشارة.
  2. قياس التخفيف إشارة في كل Z-كومة من حساب النسبة المئوية للإشارة إلى photoactivated الأصلي.

يتم فحص كل نقطة بيانات وسجلت مرتين، مما أدى إلى معلومات Z-كومة مكررة عن كل نقطة زمنية. تحقق من أن القيم Z-كومة توافق. إن لم يكن، وهذا يدل على وجود مشكلة (على سبيل المثال حركة التركيز الخلية،).

6. ممثل النتائج

عندما حدث اندماج يحدث بين الحبيبات الخيطية PA-GFP تفعيلها وعدم تفعيلها، وPAGFP داخل المصفوفة الميتوكوندريا تختلط مع مصفوفة غير المسمى، وتصبح مخففة على مساحة أكبر، والحد من إشارةكثافة (الشكل 1A). في الخلية INS1، حدوث انخفاض كبير في كثافة إشارة يحدث كل 15 دقيقة، حتى تم التوصل إلى موازنة من الانصهار الميتوكوندريا (حوالي 1 ساعة). لاحظ أن الخلية في الشكل 1B يسلك colocalization شبه كاملة من السلطة الفلسطينية وGFP وإشارات TMRE. في هذه القياسات لتركيز منخفض جدا من TMRE (15 نانومتر) ويستخدم للمساعدة في استهداف تنشيط ضوئي من PAGFP، وأيضا لرصد صحة الخلية. والخلايا مع وفرة من الميتوكوندريا استقطابها لديها colocalization غير مكتملة من PAGFP وTMRE، وينبغي ألا يكون ذلك بسبب تحلل وهذا يدل إما الضيائية، أو الخلايا في حالة الموت.

الوقت موازنة للانصهار الميتوكوندريا هي عادة 1 ساعة في INS1 الخلايا، وعندما يتم تنشيط ~ 15٪ من حجم الميتوكوندريا. في بعض الأحيان، حتى لو كان يضيء مساحة صغيرة، ومعظم من الميتوكوندريا أصبح photoactivated بسبب وجود اتصالات للغاية، وفي هذه الحالة مزيد من الاندماج يصعب اكتشاف. قد أنواع الخلايا الأخرى تظهر مرة موازنة مختلفة، وينبغي اختبار على فترات أقصر وعلى مدى فترة أطول لوصف ديناميات الميتوكوندريا. لمنع انصهار الميتوكوندريا، يمكن وضع الخلايا ضمن بيئة lipotoxic. فقد سبق أن بينت أن 0.4 ملم بالميتات شظايا الميتوكوندريا، ويمنع الانصهار الميتوكوندريا 9. ويمكن ملاحظة هذا التأثير في الشكل 2، حيث يتم تجزئة الميتوكوندريا، ولكن كثافة إشارة mtPAGFP لا تتغير بقدر ما في ظل الظروف العادية (الشكل 1). ولذلك، فإن التخفيف من الإشارة PA-GFP من المرجح أن يكون راجعا إلى الاندماج الميتوكوندريا بدلا من الانشطار. في أنواع الخلايا الأخرى، نقترح استخدام طرق أخرى معروفة للحث على تجزئة الميتوكوندريا، مثل إسكات OPA1 وهو أمر ضروري لاندماج الميتوكوندريا 14.

figure-protocol-1
الشكل 1. تخفيف نموذجي للإشارة PA-GFP بعد تنشيط ضوئي خلال فحص الانصهار الميتوكوندريا. ألف PA-GFP يصبح تدريجيا باهتة بسبب الأحداث الانصهار الميتوكوندريا مما يؤدي إلى التخفيف من البروتين على مساحة متزايدة، حيث يمكن أن تشاهد في هذه الصور المتوقعة من 6 أقسام بصري كميا كل 15 دقيقة. باء TMRE مع السلطة الفلسطينية وGFP يدل على أن الميتوكوندريا وينشط وليس استقطابها. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

figure-protocol-2
الشكل 2. الميتوكوندريا تحول دون الاندماج مع بالميتات 0.4 ملي يقلل من التخفيف من السلطة الفلسطينية وGFP. التوقعات ألف من 6 أقسام البصرية تظهر الميتوكوندريا قصيرة مع كثافة إشارة لا تتغير مع مرور الوقت. باء Colocalization من السلطة الفلسطينية وGFP مع TMRE يدل على ان الميتوكوندريا لا ديالاستقطاب. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

المناقشة

هذه الطريقة تسمح للتصوير حوالي 10 خلايا في كل مرة، إذا كان اكتساب يحدث كل 15 دقيقة بعد تنشيط ضوئي. والعدد الدقيق للخلايا تعتمد على مدى سرعة واحد قادر على تحديد مكان واحياء خلايا mtPAGFP التعبير داخل صحن والثقافة، ومدى السرعة التي يمكن للمرء أن إعداد جميع المعلمات البرمجيات. وينبغي لجعل الآلي بسلاسة أن تستخدم طبقة من الخلايا حتى لأن المعين Z-كومة هوامش سوف تطبق على جميع الخلايا.

وحجم هذا المجال تنشيط ضوئي الأولية تحكم وقت موازنة. لتكون قادرة على قياس انصهار الميتوكوندريا، من المهم أن photoactivate فقط 10-20٪ من الشبكة، بحيث يمكن رصد انتشار إشارة إلى بقية الشبكة مع مرور الوقت. إذا photoactivated الكثير من الشبكة، فمن الممكن أن الاندماج الكامل سوف تحدث بسرعة كبيرة جدا، وسوف لن يتم القبض على هذا الحدث.

يجب توخي الحذر الشديد لضبط قوة الليزر ليزر ثنائي الفوتون، فضلا عن تركيز TMRE لتجنب الضيائية الأمر الذي يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الميتوكوندريا. ويمكن التأكد من أن إشارة mtPAGFP colocalizes مع الإشارة TMRE مساعدة في تقييم الضيائية والصحة العامة الخلية 8،15. وينبغي تجنب الإضاءة مع ضوء epifluoerescent. في حين تبحث عن الخلايا معربا عن mtPAGFP، ينبغي أن تكون مفتوحة ذات الثقب الحد الأقصى في حين مسح مع إثارة قوة 488nm منخفض. تعديل قوة الليزر ثنائي الفوتون إلى photoactivate ما يكفي من السلطة الفلسطينية وGFP لقياس إشارة أكثر من 1 ساعة ولكن ليس لoversaturate أي من الخلايا يمكن أن تكون خادعة 8. ومع ذلك، ينبغي أن أمضى بعض الوقت في هذه الخطوة الأمثل لبدء برنامج الآلي مرة واحدة، فمن شاقة لوقف ذلك، لاختيار أكثر من الخلايا، واستئناف.

لمراقبة الجودة، والحصول على فارق المقابل تدخل (DIC) يمكن أن صورة (أو الضوء المرسل) لمراقبة التركيز على أن تكون خلايا جدامن المفيد أيضا وسيلة جيدة للكشف عن الفقاعات تشكلت في غمر النفط خلال المسح الضوئي، وهذا يحدث في بعض الأحيان من حركات المرحلة.

على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب mtPAGFP تجمع البيانات على حركة أحادي الاتجاه للبروتينات الميتوكوندريا المصفوفة من الميتوكوندريا photoactivated إلى تلك التي لا المسمى، فإنه من الممكن تصور للاستفادة من هذه التقنية لدراسة العمليات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إرفاق fluorochromes محددة للبروتينات غشاء لمراقبة حركتهم محددة خلال أحداث الانصهار، كما ثبت عن ABC-لي، وانصهار والذي يحدث على نطاق وزمنية مختلفة من خلط للبروتينات قابلة للذوبان مصفوفة 15.

الإفصاحات

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل زييس، وشركة

شكر وتقدير

نشكر مركز تافتس للبحوث علم الأعصاب، P30 NS047243 (جاكسون)، وبحوث الانجذاب الميتوكوندريا التعاونية (mtARC) بدعم من مركز ايفانز للبحوث الطبية الحيوية في التخصصات الطبية في بوسطن الحرم الجامعي، وصلة مؤسسة الطب، وزايس لدعم هذا العمل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد
COXIII الفيروسة الغدانية-PA-GFP الدكتور يبينكوت-شوارتز
TMRE إينفيتروجن T669
زييس LSM 710 مبائر زييس

المراجع

  1. Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
  2. Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
  3. Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  4. Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
  5. Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
  6. Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
  7. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
  8. Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
  9. Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
  10. Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
  11. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  12. Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100(2011).
  13. Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
  14. Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
  15. Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
  16. Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
  17. Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
  18. Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طريقة mtPAGFPالتصوير بالمجهر البؤريالتنشيط الضوئي للميتوكوندرياصبغ TMREاكتساب مكدس Zمنصة مجهرية مؤتمتةقياس كثافة الإشارةتحليل ديناميكيات الميتوكوندرياتصوير الخلايا الحية
أسرع وارتفاع القرار، وطن متري سنويا، GFP القائم على الفحص فيوجن الميتوكوندريا الحصول على بيانات حركية من خلايا متعددة في طريق موازية متحد البؤر المجهري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.