ونحن تصف طريقتين لشرطي العابرة-تكامل من التهاب الكبد الوبائي جمعية (سي) فيروس والانتهاء من دورة الحياة الفيروسية كامل، والتي تعتمد على تشكيل متغايرة النوى. هذه التقنيات هي مناسبة للكشف عن خطوط الخلايا التي تعبر عن عوامل تقييد المهيمنة، والتي تحول دون إنتاج ذرية HCV المعدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقتين لتشكيل متغايرة النوى إلى اكتشاف العوامل تقييد HCV
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد فيروس التهاب الكبد C (HCV) فيروساً موجهاً للكبد، وتقتصر نطاقات مضيفه على البشر والشمبانزي. ورغم ملاحظة تضاعف الحمض النووي الريبوزي (RNA) لفيروس HCV في خطوط خلوية بشرية غير كبدية وفي خطوط خلوية فئرانية، إلا أن الكفاءة كانت منخفضة جداً وتطلبت إجراءات اختيار طويلة الأمد باستخدام بنى ريبلوكون (replicon constructs) لفيروس HCV تعبر عن علامات اختيار سائدة مقاومة للمضادات الحيوية1-5. وبناءً على ذلك، تقتصر أبحاث HCV in vitro على خطوط الخلايا السرطانية الكبدية البشرية المسموح فيها بدخول الفيروس وإكمال دورة حياته. ونظراً لضيق الانتحاء النوعي لفيروس HCV، لا يتوفر نموذج حيواني صغير ذو كفاءة مناعية يدعم دورة تضاعف HCV الكاملة 6-8. ومن المرجح أن يكون التضاعف غير الفعال لفيروس HCV في الخلايا غير البشرية، مثل تلك ذات الأصل الفئراني، ناتجاً عن عدم التوافق الجيني لعوامل الاعتماد المضيفة الأساسية و/أو التعبير عن عوامل التقييد.
لقد بحثنا فيما إذا كان تكاثر فيروس التهاب الكبد C (HCV) يتم تثبيطه بواسطة عوامل تقييد سائدة سواء في خطوط الخلايا البشرية المشتقة من أنسجة غير كبدية أو في خطوط خلايا الكبد الفأرية. ولتحقيق هذه الغاية، طورنا طريقتين مستقلتين للتكملة العابرة (trans-complementation) الشرطية تعتمدان على دمج الخلايا الجسدية. وفي كلتا الحالتين، لا يكون إكمال دورة التكاثر الفيروسي ممكناً إلا في الخلايا متعددة النوى (heterokaryons). وبناءً على ذلك، فإن نجاح التكملة العابرة (trans-complementation)، والذي يتم تحديده من خلال قياس الإنتاج الجديد (de novo) للنسل الفيروسي المعدي، يشير إلى غياب القيود السائدة.
تحديداً، تم ترنسفكشن ريبليكونات HCV دون الجينومية التي تحمل جين لوسيفيريز منقول إلى خلايا سرطان الكبد البشرية عالية النفاذية (خلايا Huh-7.5). لاحقاً، تم استزراع هذه الخلايا بشكل مشترك ودمجها مع خلايا بشرية وفأرية متنوعة تعبر عن البروتينات التركيبية لـ HCV وهي core وenvelope 1 و2 (E1, E2) والبروتينات الملحقة p7 وNS2. وبشرط أن يبدأ دمج الخلايا عن طريق المعالجة بالبولي إيثيلين جليكول (PEG)، أفرزت المزرعة جسيمات فيروسية معدية أصابت خلايا ساذجة بطريقة تعتمد على المستقبلات.
لتقييم تأثير القيود السائدة على دورة حياة الفيروس الكاملة، بما في ذلك دخول الخلية وترجمة RNA والتضاعف وتجميع الفيروس، استفدنا من خط خلايا كبد بشرية (خلايا Huh-7 Lunet N 9) التي تفتقر إلى التعبير الداخلي عن CD81، وهو عامل دخول أساسي لفيروس التهاب الكبد C (HCV). في حالة غياب التعبير خارجي المنشأ عن CD81، تكون هذه الخلايا مقاومة أساساً للإصابة بـ HCV 10. ومن المهم الإشارة إلى أنه عند استزراعها بشكل مشترك ودمجها مع خلايا تعبر عن CD81 البشري ولكنها تفتقر إلى عامل دخول خلوي حيوي آخر على الأقل (أي SR-BI، أو CLDN1، أو OCLN)، فإن الخلايا متباينة النوى الناتجة فقط هي التي تظهر المجموعة الكاملة من عوامل دخول HCV اللازمة للإصابة. لذلك، ولتحليل ما إذا كانت عوامل التقييد السائدة تثبط استكمال دورة تضاعف HCV، قمنا بدمج خلايا Lunet N مع خلايا متنوعة من أصل بشري وفأري تستوفي المعايير المذكورة أعلاه. وعندما تم ترنسفكشن الخلايا المستزرعة مشتركاً ببروتين غلافي فيروسي طافر عالي الاندماج من الفيروس الرغوي النموذجي (PFV11) ثم تعريضها لاحقاً بجسيمات HCV معدية (HCVcc)، لوحظ إنتاج de novo لفيروسات معدية. يشير هذا إلى أن HCV قد أكمل دورة تضاعفه بنجاح في الخلايا متباينة النوى، مما ينفي وجود تعبير عن عوامل تقييد سائدة في هذه الخطوط الخلوية. ستكون طرق التكامل trans الشرطية الجديدة هذه مفيدة لفحص مجموعة واسعة من الخطوط الخلوية والخلايا الأولية للكشف عن تعبير عوامل التقييد السائدة الخاصة بـ HCV.
البروتوكول
فيوجن الخلية بواسطة PEG
1. خلية ثقافة
- ثقافة هوه-7.5، الحله وHep56.1D خطوط الخلايا ساذجا أو التعبئة والتغليف 12 في 15 سم أطباق ثقافة خلية كاملة في DMEM (DMEM cplt) المتوسطة، على أن تستكمل مع DMEM 2 مم L-الجلوتامين، 1X غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 10٪ مصل العجل الجنين. تطبيق اختيار المناسب لخطوط الخلايا مستقر كما هو مبين في الجدول رقم 1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم طريقتين للحث على تشكيل متغايرة النوى في الخلايا المزروعة لتحليل القيود السلبية السائدة التي تحول دون تكرار سي. باستخدام هذه الإجراءات استبعدنا وجود عامل مهيمن أعرب constitutively أو فيروس من صنع الإنسان في مختلف الكبد غير والفئران في خطوط خلايا الكبد. الفحص 1 يحلل في المقام الأول إذا عوامل تقييد منع التجمع HCV وإطلاق ذرية المعدية. لأنه في هذه الحالة وتنصهر الخلايا التعبئة والتغليف إلى الخلايا ريبليكون HCV، وعوامل تقييد ممكن وأعرب في الخلايا التعبئة والتغليف فقط الحصول على حق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تلقى TP رسوم استشارية من Biotest.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لWakita Takaji وينس لBukh JFH1 والعزلات J6CF، على التوالي. وعلاوة على ذلك نشكر تشارلز رايس للخلايا 7.5 هوه والأجسام المضادة 9E10، ستيفن Foung للأجسام المضادة E2 محددة CBH-23، وجميع أعضاء قسم علم الفيروسات التجريبي، Twincore للحصول على اقتراحات مفيدة والمناقشات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| DMEM | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 41965-039 | |
| L-الجلوتامين | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 25030-024 | |
| غير الاساسيين من الأحماض الأمينية | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 11140-035 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 15140-122 | |
| الجنين المصل في ربلة الساق | PAA، Cölbe، ألمانيا | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | تفضلت التي تقدمها Foung ستيفن 10 | ||
| ATP | سيغما، Steinheim، ألمانيا | A2833-106 | |
| الجلوتاثيون | سيغما، Steinheim، ألمانيا | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo الجنرال، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية | نملة-BL-1 | |
| G418 (geneticin) | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 11811-064 | |
| البولي ايثيلين جلايكول-1500- | روش، مانهايم، ألمانيا | 10783641001 | |
| بارافورمالدهيد | روث، كارلسروه، ألمانيا | 0335.3 | |
| تريتون X-100 | روث، كارلسروه، ألمانيا | 3051.2 | |
| ماعز المصل | سيغما، Steinheim، ألمانيا | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | تفضلت التي تقدمها رايس تشارلز 7 | ||
| دابي (4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | إينفيتروجن | D1306 | |
| اليكسا، فلور 546 - الماعز المضادة للمفتش الإنسان | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | A21089 | |
| اليكسا، فلور 488 - ماعز لمكافحة فأر مفتش | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | إينفيتروجن، كارلسروه، ألمانيا | C2925 | |
| Fluoromount | سيغما، Steinheim، ألمانيا | F4680-25ML | |
| جميع المواد الكيميائية الأخرى | روث، كارلسروه، ألمانيا | ||
| مواد خلية ثقافة | Sarstedt، Nümbrecht، ألمانيا |
المراجع
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
