مقالة منهجية

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

DOI:

10.3791/4041

⸱

يوليو 31, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عصر ما بعد الجينوم البشري، وتوافر البروتينات المؤتلف في التشكل الأصلية أمر حاسم لبحث الهيكلية والوظيفية والعلاجية والتنمية. هنا، نحن تصف تجارب واسعة النطاق نظام التعبير بروتين في الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى التي يمكن استخدامها لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > التعبير عن البروتين المؤتلف في البكتيريا ، عادة الإشريكية القولونية ، كان أنجح استراتيجية للتعبير عن كمية مليغرام من البروتينات. ومع ذلك ، غالبا ما تكون المضيفات بدائية النواة غير مناسبة للتعبير عن البروتينات البشرية أو الفيروسية أو حقيقية النواة بسبب سمية الجزيء الكبير الغريب ، أو الاختلافات في آلية طي البروتين ، أو بسبب عدم وجود تعديلات معينة في البكتيريا المشتركة أو اللاحقة للترجمة. أنظمة التعبير القائمة على الخميرة (P. pastoris أو S. cerevisiae) 1،2 ، خلايا الحشرات المصابة بفيروس باكوفلو (S. frugiperda أو T. ni) 3 ، وأنظمة الترجمة المختبرية الخالية من الخلايا 2،4 تم استخدامها بنجاح لإنتاج بروتينات الثدييات. بشكل حدسي ، فإن أفضل تطابق هو استخدام مضيف من الثدييات لضمان إنتاج البروتينات المؤتلفة التي تحتوي على التعديلات المناسبة بعد الترجمة. تم استخدام عدد من خطوط خلايا الثدييات (الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 ، خلايا CV-1 في Origin التي تحمل مستضد T الأكبر SV40 (COS) ، ومبيض الهامستر الصيني (CHO) ، وغيرها) للإفراط في التعبير عن كميات مليغرام من عدد من البروتينات البشرية 5-9. ومع ذلك ، فإن مزايا استخدام خلايا الثدييات غالبا ما تقابلها تكاليف أعلى ، ومتطلبات معدات مختبرية متخصصة ، وانخفاض إنتاجية البروتين ، وأوقات طويلة لتطوير خطوط خلايا تعبير مستقرة. تعد زيادة الغلة وإنتاج البروتينات بشكل أسرع ، مع الحفاظ على انخفاض التكاليف ، من العوامل الرئيسية للعديد من المختبرات الأكاديمية والتجارية.

هنا ، نصف إجراء من جزأين فعالا من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتينات البشرية المفرزة من خلايا HEK 293T الملتصقة. هذا النظام قادر على إنتاج كميات ميكروغرام إلى مليغرام من البروتين الوظيفي للدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية. الجزء الأول ، يتم إنتاج تركيبات متعددة من الجين محل الاهتمام بالتوازي وتحويلها بشكل عابر إلى خلايا HEK 293T الملتصقة على نطاق صغير. يتم الكشف عن وتحليل البروتين المؤتلف الذي يفرز في وسط زراعة الخلية عن طريق تحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا الموجهة ضد علامة تنقية البروتين المشفرة بالنواقل. بعد ذلك ، يتم نقل التركيبات المناسبة لإنتاج البروتين على نطاق واسع بشكل عابر باستخدام البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) في مصانع الخلايا المكونة من 10 طبقات. تتركز البروتينات التي تفرز في أحجام لتر من الوسط المكيف في كميات يمكن التحكم فيها باستخدام ترشيح التدفق العرضي ، متبوعا بالتنقية بواسطة كروماتوغرافيا التقارب المضادة ل HA. أثبتت فائدة هذه المنصة من خلال قدرتها على التعبير عن كميات مليغرام من السيتوكينات ومستقبلات السيتوكين ومستقبلات سطح الخلية وعوامل التقييد الجوهرية والبروتينات السكرية الفيروسية. تم استخدام هذه الطريقة أيضا بنجاح في التحديد الهيكلي للبروتين السكري لفيروس الإيبولا الثلاثي 5،10.

في الختام ، توفر هذه المنصة سهولة الاستخدام والسرعة وقابلية التوسع مع زيادة جودة البروتين ووظائفه. علاوة على ذلك ، لا يلزم وجود معدات إضافية ، بخلاف حاضنة ثاني أكسيد الكربونالمرطبة القياسية. يمكن توسيع هذا الإجراء بسرعة ليشمل أنظمة أكثر تعقيدا ، مثل التعبير المشترك لمجمعات البروتين والمستضدات والأجسام المضادة ، أو إنتاج جزيئات شبيهة بالفيروسات للقاحات ، أو إنتاج الفيروسات الغدية أو الفيروسات العدسية لنقل خطوط الخلايا الصعبة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. أعمال إعداد - يبني والثقافات الخلية

قبل البدء في بروتوكول، يجب أن تكون الجينات التي تهم كودون-الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات، والمستنسخة في متجه التعبير المناسب باستخدام معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية. من أجل ضمان أعلى مستوى من فرصة للتعبير عن النجاح، يجب أن يكون إنشاء متغيرات متعددة من الجينات في المصالح. العديد من ناقلات التعبير الثدييات متاحة تجاريا ولها به تنقية مختلفة (polyhistidine، راصة دموية، streptavidin، HALO طلال أبو غزاله، الجلوتاثيون دإ ترانسفيراز، من بين أمور أخرى). نحن نفضل استخدام ناقلات pDISPLAY، الذي يشفر لأحد المروجين المضخم للخلايا البشرية قوي، إشارة الإيج إفراز κ، راصة دموية علامة تنقية، ويحتوي على مرساة عبر الغشاء C-محطة لاستهداف بروتين من خلال المسار إفرازي للعرض على غشاء البلازما. نحن إدراج عادة كودون وقف أمام ancho عبر الغشاء ناقلات ترميزص للسماح يفرز البروتين في المتوسط ​​مكيفة.

الجنينية البشرية الكلى (كلوة الجنين البشري) الخلايا 293T متاحة على نطاق واسع، وزرعها بسهولة وtransfected. وتستخدم بصورة روتينية 293T كلوة الجنين البشري للتعبير عن بروتينات في الثدييات، ولكنها تعتبر biohazardous ويجب التعامل معها على مستوى السلامة الحيوية 2. الرجاء ارتداء الملابس الواقية المناسبة الشخصية، يجب أن يتم تنفيذ العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يوافق عليه باستخدام تقنية العقيم. يجب تطهير جميع الأسطح من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والحكومية. فمن المستحسن أن يتم اختبار الخلايا للتلوث المفطورة قبل استخدامها. يمكن علاج الخلايا مع سيبروفلوكساسين (10 ميكروغرام / مل) لمدة عشرة أيام للقضاء على أي مصدر من النيابة المفطورة. تلوث. وتعرض بروتوكولات عامة لنشر كلوة الجنين البشري خلايا 293T على حدة (الإطار 1).

اعتبارات إضافية للاختبار وتعبير البروتين على نطاق واسع من النقادد في 11-15.

2. صغار اختبار التعبير

مرة واحدة وقد تم تصميم البنى ويمكن أن يؤديها ولدت، transfections اختبار على نطاق صغير باستخدام كلوة الجنين البشري 293T الخلايا، يتم تقديم تخطيطي يلخص عملية أدناه (الشكل 1).

  1. استخدام T75 سم 2 سم أو T225 ثقافة الخلية 2 قوارير (اعتمادا على عدد من التعابير اختبار التي يتعين القيام بها) لزراعة الخلايا كلوة الجنين البشري 293T وتقسيم الخلايا كل 2-3 أيام عندما الخلايا هي متكدسة 100٪ (الإطار 1).
  2. البذور 2.5 × 10 5 كلوة الجنين البشري 293T خلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا وإضافة 2 مل DMEM مع القلم 1X / بكتيريا و 10٪ (V / V) FBS، دوامة لوحة بلطف لضمان تشتيت حتى خلية في كل بئر، و احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في غرفة 5٪ CO 2 مرطب.
  3. عندما كلوة الجنين البشري خلايا 293T تصل إلى 40٪ confluency، تجاهل وسائل الاعلام وإضافة جديدة 2 مل DMEM مع القلم 1X / بكتيريا و 10٪ (V / V) FBS إلى الآبار. نفذترنسفكأيشن المقايسات.
  4. قسامة 90 ميكرولتر المصل خالية DMEM الى معقم 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. ماصة 3 GeneJuice ميكرولتر في DMEM المصل خالية وتخلط بلطف الأنبوب (دوامة الإصبع). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 1 ميكروغرام من MiniPrep تنقية البلازميد (الحمض النووي المخزون = 100 نانوغرام / ميكروليتر) في DMEM-GeneJuice خليط، دوامة إصبع، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. ماصة للنقطه نقطه خليط ترنسفكأيشن على خلايا 293T كلوة الجنين البشري، ودوامة لوحة 6 جيدا بلطف للسماح للتوزيع حتى من خليط ترنسفكأيشن. احتضان لوحة 6 جيدا على 37 درجة مئوية في غرفة 5٪ CO 2 مرطب.
  7. إضافة 1 مل DMEM جديدة مع القلم 1X / بكتيريا و 10٪ (V / V) FBS إلى كل 24 ساعة بشكل جيد بعد ترنسفكأيشن والحضانة لمدة 48 ساعة أخرى (ما مجموعه 72 ساعة).
  8. حصاد 1 مل من طاف من كل بئر في ثلاثة أيام العينات بعد ترنسفكأيشن وmicrocentrifuge في 16000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تنفيذ ويسالخرشنة تحليل وصمة عار على النحو المفصل في الإطار 2. ويمكن تخزين العينات في درجة مئوية 4 طول تخزين عند 4 درجة مئوية هو بروتين التابعة.

3. على نطاق واسع التعبير اختبار وتنقية

مرة واحدة وقد تم التعرف على التركيبة يتحقق مليغرام التعبير كمية من البروتين المؤتلف من قبل PEI ترنسفكأيشن من الخلايا كلوة الجنين البشري تمسكا 293T تستخدم مصانع الخلية 10 طبقة (الشكل رقم 2، 6360 مساحة سطح سم 2). لمزيد من الدراسات الاستكشافية، ويمكن استخدام مصانع أصغر خلية أو T-قوارير (الجدول 1).

  1. تنقية 1 ملغ من الحمض النووي لترنسفكأيشن استخدام عدة MaxiPrep تنقية البلازميد. وينبغي أن يكون ثقافة 500 مل بين عشية وضحاها من XL-1 الأزرق خلايا تنتج ما لا يقل عن 1 ملغ من الحمض النووي محض. تحقق نقاء من الحمض النووي عن طريق قياس A 260 / A نسبة 280؛ يجب أن يكون فوق 1.8.
  2. زيادة كلوة الجنين البشري 293T الخلايا إلى 2.0 X خلايا 8 10. كل T225 سم 2 قارورة نما إلى التعاون confluency 100٪ntains والمتوسط ​​~ 2.25 X الخلايا 7 10.
  3. إضافة 1.2 لتر DMEM مع 5٪ (V / V) FBS إلى مصنع الخلية 10 طبقة. إضافة 2.0 X 10 8 كلوة الجنين البشري 293T الخلايا إلى مصنع الخلية وتوزيعها بالتساوي على جميع خلايا طبقات من السفينة. فمن الصعب جدا تصور confluency من الخلايا في مصنع الخلية. كبديل، وانشاء T75 سم 2 قارورة مع عدد مناسب من الخلايا، وذلك باستخدام عدد الخلية نفسها إلى نسبة المساحة السطحية على النحو الذي قام مع السفينة 10 طبقة. رصد هذه القارورة لمعدلات النمو. مشاهدة الفيديو ذات الصلة للتعليم في التعامل مع مصنع الخلية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 للسماح للمرفق الخلية والنمو.
  4. نفذ على نطاق واسع ترنسفكأيشن عندما تمسكا كلوة الجنين البشري خلايا 293T هي 70٪ متموجة. تحضير خليط ترنسفكأيشن PEI الدنا (3:1 وزن / وزن PEI إلى نسبة DNA) في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام معقم T75 سم 2 قارورة. خلط 0،84 ملغ من الحمض النووي مع 84 مل من برنامج تلفزيوني 1X معقم، ثم يضاف 2.5 مل من PEI (2.5 ملغ مجموع PEI). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وينبغي حل يصبح غائما.
  5. صب الخليط ترنسفكأيشن PEI الحمض النووي ببطء في مصنع الخلية وتوزيعها جيدا على جميع طبقات من السفينة. اختياري: لزيادة الغلة التعبير، إضافة حامض فالبرويك (4 ملي تركيز النهائي). احتضان في 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 لمدة أربعة أيام.
  6. حصاد طاف أربعة أيام بعد ترنسفكأيشن. أجهزة الطرد المركزي في وسائل الإعلام مكيفة ز س 6000 لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية مزيد من طاف باستخدام 0.22 فراغ Stericup جهاز ميكرون فلتر. يمكن إعادة استخدامها في مصنع الخلية 10 طبقة، انظر الإطار 3 لتنظيف تعليمات. هذا هو المفتاح الذي يبدأ التنظيف مباشرة بعد الحصاد طاف، لا تدع الخلايا الجافة على سطح السفينة.
  7. تركز طاف إلى 75 مل باستخدام Centramate الترشيح تدفق عرضية نظام.
  8. إضافة 500 مل من برنامج تلفزيوني وإلى إعادة تركيز 75 مل. كرر 3 additIONAL مرات لتخفيف تماما تبادل العينة.
  9. تتوازن 1 1 مل عمود النسب المضادة للهكتار مع PBS 1X وتطبيق عينة مركزة من قبل تدفق الجاذبية بمعدل <1 مل / دقيقة.
  10. غسل العمود مع 30 مل من 1X PBS-Tween20.
  11. حل HA الببتيد في برنامج تلفزيوني 1X (1.0 ملغ / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية.
  12. تطبق 1 مل من الببتيد HA إلى العمود المضادة للهكتار، والسماح للببتيد تتدفق على الراتنج. جمع من خلال تدفق. وقف تدفق عندما حل الببتيد يصل إلى ارتفاع السرير.
  13. احتضان كامل لمكافحة HA عمود في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  14. كرر الخطوة 12 مرتين إضافية.
  15. تطبق 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى العمود مكافحة HA وتصب في الراتنج حتى تصل إلى ارتفاع السرير. جمع من خلال تدفق.
  16. تجديد عمود المضادة للهكتار مع 10 مل 0.1 درجة الحموضة جليكاين M 2.2. تغسل مع PBS مل (10) ومخزن عمود النسب في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ (W / V) نان 3.
  17. أداء SDS-PAGE التحليل وبركة وractions وفقا لذلك. ملاحظة: الببتيد HA سوف تتداخل مع قياسات تركيز البروتين من قبل 280 أو برادفورد. لتقدير كمية البروتين الحالي، حمل 5، 10، 15، 25 ميكروغرام من جيش صرب البوسنة على الجل SDS-PAGE كمعيار ومقارنة شدة الموجات.

ويمكن تكرار الخطوات 9-17 للقبض على بروتين إضافي من متوسط ​​مكيفة.

4. ممثل النتائج

في هذه المقالة، وصفنا، ويبرهن على وجود منصة ملائمة للتعبير عن مليغرام، كمية انتاج البروتينات البشرية التي يمكن أن تستخدم في وقت لاحق للدراسات الهيكلية والوظيفية. فحص البروتين البشري يبني باستخدام الخلايا كلوة الجنين البشري في 6-293T جيدا لوحات غير كفؤة وفعالة في تحديد ثوابت قابلة للانتاج على نطاق أوسع. ويمكن التعبير transfected ناقلات التجارية بكفاءة في الخلايا 293T كلوة الجنين البشري باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف ترنسفكأيشن، مثل GeneJuice، HD FuGene أو PE أولا من المستحسن استخدام جهاز كاشف ترنسفكأيشن التجارية، مثل GeneJuice أو HD FuGene، للتعبير عن اختبار، حيث أن هذه الكواشف هي أكثر فعالية في التعبير عن البروتينات الأكثر فقرا (الشكل 3). ينبغي أن تتسم البنى المختارة للتعبير أوسع نطاقا من جانب واحد، والفرقة كثافة قوية، والمقابلة لوزن جزيئي المناسبة على لطخة غربية (الشكل 3). قد تهاجر بروتينات سكرية كما أوسع الفرقة بسبب عدم التجانس في ارتباط بالغليكوزيل. لقد أظهرنا أنه يمكن التعبير مجموعة متنوعة من الجزيئات، التي تتراوح بين بروتينات سكرية الفيروسية، السيتوكينات، خلوى المستقبلات، والبروتينات السطحية الأخرى، وتنقيته لانتاج كميات من البروتين millgram استخدام هذا التعبير منصة عامة (الشكل 4).

figure-protocol-1
الشكل 1. التخطيطي سير العمل من صغار transfections.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

figure-protocol-2
الشكل 2. كورنينج 10 طبقة CellSTACK للحصول على أكبر نطاق وبروتين تعبير. كل طبقة تحتوي على 636 سم مساحة سطح الخلية 2 للمرفق. وهناك معيار مختبر CO 2 الحاضنة (6.0 قدم مكعب) عقد مريح أربعة مصانع الخلية 10 طبقة.

figure-protocol-3
.. الشكل (3) على نطاق صغير التعبير عن مختلف البروتينات يفرز أجرينا سلسلة من التعبيرات اختبار على نطاق صغير باستخدام الكواشف ترنسفكأيشن مشتركة:. GeneJuice، HD FuGene وPEI (أ) فحص لطخة غربية مختارة من البروتينات الخلوية الإنسان (tetherin)، المستقبلات (IL-2R الوحيدات β) والسيتوكينات (IL-2). Tetherin هو بروتين سكري غشاء الإنسان أن يحد من إطلاق سراحالوليدة HIV-1 virions 16. المجال خارج الخلية من tetherin كما هو معمول به ديمر الغليكوزيلاتي ثاني كبريتيد مرتبطة، من 36 كيلو دالتون ~. تحت الحد من الظروف، كما هو موضح هنا، tetherin يهاجر كما مونومر مع الوزن 1 الجزيئية واضح من 22 كيلو دالتون ~. انترلوكين 2 (IL-2) هو خلوى (~ 17 كيلو دالتون) تشارك في انتشار الخلايا اللمفاوية 17. فهو يتفاعل مع IL-2 مستقبلات معقدة، منها IL-2R βsubunit (~ 26 كيلو دالتون) هو عنصر 18. CD21 هو بروتين غشاء المشاركة في التنشيط ونضوج الخلايا البائية من قبل النظام مكملا، و هو أيضا مستقبلات لفيروس ابشتاين بار. المجال الغليكوزيلاتي خارج الخلية من CD21 يهاجر كما مونومر مع الوزن الجزيئي واضح من 1 كيلو دالتون 20 ~. (ب) وفحص لطخة غربية من بروتينات سكرية سطح اختيار الفيروسي (XMRV إنفيرومنتل وebolavirus GP). XMRV وبروتينات سكرية ebolavirus (مرساة عبر الغشاء حذف) موجودة في الغشاء الفيروسية مثل المسامير مثلوثي وتشارك في مرفق الخلية المضيفةوالانصهار. زينت بشدة ectodomain من إنفيرومنتل XMRV وGP EBOV مع N-مرتبط glycans والهجرة في الأوزان الجزيئية واضح من 70 كيلو دالتون و 75 كيلو دالتون، على التوالي.

figure-protocol-4
الشكل 4. تنقية البروتينات الخلوية الإنسان على نطاق واسع من الثقافات 293T كلوة الجنين البشري. وأعرب عن البروتينات باستخدام مصنع الخلية 10 طبقة، ويتركز وتنقيته بواسطة المضادة للHA اللوني. كما تبين من تحليل SDS-PAGE Coomassie الملطخة، والمجالات خارج الخلية من مستقبلات انترلوكين 2 (IL-2R) وα γ مفارز الهجرة في الأوزان الجزيئية من 40 كيلو دالتون و 46 كيلو دالتون، على التوالي. المجال خارج الخلية من tetherin يهاجر كما ديمر، تحت ظروف غير المختزلة، مع الوزن 1 الجزيئية واضح من 36 كيلو دالتون. لاحظ أن هناك بعض تلوث جيش صرب البوسنة الذي يظهر في الوزن الجزيئي واضح 1 من 60 كيلو دالتون. وبالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس من glycans N-مرتبط موجودة على tetherin،IL-2R α وايل 2R الفرقة أسباب γ توسيع على هلام SDS-PAGE. ويمكن إزالة هذه معقدة من نوع N-glycans المرتبطة باستخدام الببتيد: N-غليكوزيداز ف.

سفينة المساحة
6 كذلك لوحة 9.5 سم 2 (كل بئر)
100 ملم الأطباق 55 سم 2
245 ملم الأطباق 500 سم 2
T75 سم 2 قارورة 75 سم 2
T175 سم 2 قارورة 175 سم 2
T225 سم 2 قارورة 225 سم 2
الأسطوانة زجاجة العادية 850 سم 2
الأسطوانة زجاجة موسعة السطح 1700 سم 2
1-طبقة CellSTACK 636 سم 2
2-طبقة CellSTACK 1272 سم 2
5 طبقة CellSTACK 3180 سم 2
10 طبقة CellSTACK 6360 سم 2
40 طبقة CellSTACK 25440 سم 2

الجدول رقم 1. مقارنة السفن ثقافة الخلية المستخدمة للتعبير عن بروتين.

قائمة من وصفات الكاشف

100X Ciprofloxacine للحصول على حل 10 مل، إضافة 10 مل من الماء منزوع الأيونات إلى ciprofloxacine 10 ملغ. إضافة 10 ميكرولتر 6N حمض الهيدروكلوريك إلى حل تماما ciprofloxacine.

PEI (1 ملغ / مل) للحصول على حل 100 مل، ويحل 100 ملغ من 25 كيلو دالتون خطي PEI في ماء منزوع الأيونات والحرارة إلى 80 درجة مئوية. حل بارد إلى درجة حرارة الغرفة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2، قسامة، 0.22 ميكرون فلتر تعقيم وتجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لونز الأجل للتخزين.

1X برنامج تلفزيوني للحصول على حل L 1 مائي: 8.0 غ من كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.4 ز نا 2 هبو 4 (لا مائي)، 0،24 ز KH 2 PO 4. ضبط درجة الحموضة من حل إلى 7.4 و 1.0 لتر لملء

1X PBS-توين-20 للحصول على حل L 1 مائي: 8.0 غ من كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.4 ز نا 2 هبو 4 (لا مائي)، 0،24 ز KH 2 PO 4، 1 مل توين-20. ضبط درجة الحموضة من حل إلى 7.4 و 1.0 لتر لملء

1X عازلة لنقل حل L 1 مائي: 3.0 غ من قاعدة تريس، 14،4 ز جليكاين، 150 مل من الميثانول.

1X SDS-PAGE تشغيل المخزن المؤقت للحصول على حل L 1 مائي: 3.0 غ من قاعدة تريس، 14،4 ز جليكاين، 1.0 غرام SDS.

SDS-PAGE الحد العازلة عينة للحصول على حل 10 مل: 0.6 غرام SDS، 3 مل الجلسرين، و 1.8 مل 1،0 تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 1 ملغ زرقة البروموفينول، 5٪ (V / V) 2-المركابتويثانول.

الإطار 1. عام بروتوكولات لنشر الخلية

  1. زراعة خلايا في كلوة الجنين البشري 293T متوسطة Dulbecco ومعدلة النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) الجنين مصل بقري (FBS)، قلم 1X / بكتيريا في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2-ترطيب الجو.
  2. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب. عندما تكون الخلايا في confluency 100٪، وإزالة ونبذ ثقافة المتوسط.
  3. شطف الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X معقم لإزالة آثار مصل. تجاهل غسل برنامج تلفزيوني.
  4. أضف 2 مل من 0.05٪ (W / V) التربسين-EDTA حل لقارورة T225 2 سم (أو 1 مل من 0.05٪ (W / V) التربسين-EDTA لT75 قارورة 2 سم)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى فصل الخلايا من سطح الأرض. ومن الممكن أيضا استخدام 1X معقم PBS-EDTA لفصل الخلايا كلوة الجنين البشري 293T.
  5. إضافة 13 مل من DMEM مع 10٪ (V / V) FBS إلى قارورة T225 2 سم (أو 9 مل من DMEM مع 10٪ (V / V) FBS لT75 سم 2 قارورة) لتحول دون رد فعل التربسين.
  6. تقسيم جells 01:05. للحصول على قارورة T225 2 سم، إضافة 3 مل من تعليق الخلية إلى 27 مل من DMEM جديدة مع FBS القلم / بكتيريا و 10٪ (V / V) 1X في وعاء ثقافة جديدة. للحصول على قارورة T75 2 سم، إضافة 2 مل من تعليق الخلية إلى 8 مل من وسائل الاعلام نمو جديدة. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2-ترطيب الجو. وينبغي أن الخلايا تنمو إلى 100٪ confluency في غضون يومين.

الإطار 2. الغربية لطخة تحليل

  1. إضافة 10 ميكرولتر SDS-PAGE العازلة عينة خفض إلى 30 خلية ثقافة ميكرولتر طاف. يتم حلها بشكل جيد عينات الحمل وprestained علامات وزن جزيئي على المواد الهلامية بولكرلميد، وelectrophorese باستخدام 1X SDS PAGE العازلة على التوالي في 175 V لمدة 1 ساعة أو حتى علامات الوزن الجزيئي.
  2. نقع Immobilon-P PVDF غشاء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لتنشيط.
  3. تجميع جهاز الغربية وصمة عار. ضمان غشاء PVDF يواجه القطب الموجب والحفاظ على جميع مكونات الرطب مع عازلة نقل 1X. الشرطة السريةفقاعات معرف بين جل بولكرلميد والغشاء.
  4. ملء تماما الغرفة الكهربائي مع عازلة نقل 1X ونقل لمدة 1 ساعة في 100 V.
  5. منع الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (W / V) في برنامج تلفزيوني 1X-Tween20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. احتضان مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الأولية (أي 1:1000 تخفيف مكافحة HA خريطة موقع آخر أو الأجسام المضادة المناسبة) حل في 5٪ (W / V) الحليب الخالي من الدسم في 1X PBS-Tween20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. غسل الأغشية في 1X PBS-Tween20 لمدة 10 دقائق. كرر مرتين اضافية.
  8. احتضان مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ثانوية مترافق مع الفوسفاتيز القلوية (1:1000 تخفيف في 5٪ (W / V) الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني، Tween20 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  9. غسل الأغشية في 1X PBS-Tween20 لمدة 10 دقائق. كرر مرتين اضافية.
  10. وضع غشاء في وعاء صغير، أضف 5 مل الفوسفاتيز القلوية substraالشركة المصرية للاتصالات (BCIP / NBT) حل. وينبغي تطوير اللون تحدث خلال 1-5 دقائق. يتم التوصل المطلوب مرة واحدة شدة الفرقة، وتغسل بماء منزوع الأيونات والهواء الجاف. قد اللون تتلاشى مع مرور الوقت؛ مسح الكترونيا الأغشية الجاف مرة واحدة.

المربع 3. تنظيف وإعادة تدوير السفن ثقافة الخلية

في حين تم تصميم المصانع الخلية ليكون استخدام مرة واحدة، ويمكن إعادة تدويرها هذه السفن لtransfections على نطاق واسع باستخدام بروتوكول إضافي التنظيف التالية:

  1. مباشرة بعد الصب وطاف من المصنع الخلية 10 طبقة، إضافة 20٪ (V / V) التبييض ويهز بقوة لفصل الخلايا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات.
  2. تفريغ سفينة جديدة وإضافة 20٪ (V / V) التبييض واحتضانها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  3. تفريغ السفينة وغسل مع 1.5 لتر من الماء منزوع الأيونات. كرر ثلاث مرات.
  4. تستكمل تفريغ مصنع الخلية 10 طبقة وإضافة 0.5 لتر من برنامج تلفزيوني 1X العقيمة مع 10X حل مضاد حيوي / مضاد فطري. تخزين السفينة في درجة حرارة الغرفة واستبدال أغطية التنفيس لملء الموانئ (قبعات معيار 33 ملم مترابطة) قبل استخدام المقبل. ملاحظة: جميع طبقات يجب أن يكون واضحا تماما بعد التنظيف، وإذا لم يكن كذلك، لا تستخدم والتصرف في مصنع الخلية فقا لمبادئ توجيهية مؤسسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصانع الخلية 10 طبقة هي سفينة فعالة لإنتاج كميات مليغرام من البروتين. والميزة الرئيسية لاستخدام مصنع الخلية على السفن التقليدية الأخرى، مثل زجاجات الدوارة، وقوارير هزة أو الدوار القوارير، هو أنها لا تحتاج لشراء أي معدات مختبر إضافية. وهناك معيار CO 2 الحاضنة (~ 6،0 قدم مكعب) تستوعب بسهولة أربعة مصانع الخلية 10 طبقة (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، هذه السفن تحتاج إلى أقل مساحة من العمل، وأطباق، وقوارير وزجاجات بكرة لانتاج الخلايا والبروتينات، واحد مصنع ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل علاج فيروس نقص المناعة البشرية أونتاريو جرانت شبكة التشغيل البحوث (ROG-G645)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة جائزة محقق جديد (MSH-113554) لJEL، وجامعة تورنتو الزمالات إلى HA، الهيئة الاتحادية للجمارك، واللجنة التأديبية المشتركة. فإن الكتاب أود أن أشكر مارني فوسكو، أبيلسون الدفنة والدكتورة إيريكا سافيري Ollmann في معهد سكريبس للبحوث (لا جولا، كاليفورنيا) لخلايا توفير، ebolavirus ناقلات التعبير GP ونصائح عامة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
الفوسفاتيز القلوية (BCIP / NBT) حل الركيزة السائل سيغما B6404
مضاد حيوي / مضاد فطري، 100X إينفيتروجن 15240062
مكافحة HA تقارب مصفوفة، استنساخ 3F10 روش 1815016
مكافحة الفئران خريطة موقع HA، استنساخ 16B12 كوفانس MMS-101P
خلية قارورة والثقافة، وتعامل T75 ثقافة سم الأنسجة 2 كورنينج 430641
خلية قارورة والثقافة، وتعامل T225 ثقافة سم الأنسجة 2 كورنينج 431082
لوحات ثقافة خلية ،6-جيدا زراعة الأنسجة المعالجة كورنينج 3516
مصنع الخلية، 10 طبقة CellSTACK كورنينج 3312
Centramate أوميغا 5K كاسيت غطاء النعش OS005C12
Centramate أوميغا 30K كاسيت غطاء النعش OS030C12
اللوني الزجاج عمود، الطول 1.0x10 Kontes 4204001010
سيبروفلوكساسين سيغما 17850
CO 2
Dulbecco لتعديل النسر وسائل الاعلام (DMEM) سيغما D5796
مصل بقري جنيني (FBS)، والحرارة المعطل إينفيتروجن 12484-028
الكاشف HD ترنسفكأيشن Promega 4709691001
GeneJuice ترنسفكأيشن الكاشف EMD / ميرك 70967-6
جليكاين سيغما G8898
ماعز مكافحة فأر مفتش F ('أب) 2 القلوية الحرارية العلمية 31324
الفوسفاتيز، مترافق الأضداد
راصة دموية (HA) الببتيد، 100 ملغ Genscript عرف توليف
(تسلسل: YPYDVPDYA؛ نقاء 95٪)
كلوة الجنين البشري خلايا 293T ATCC CRL-11268
Householد مبيض (4٪ وزن / هيبوكلوريت الصوديوم) مختلف العلامات التجارية المتاحة
Immobilon-P PVDF غشاء ميليبور IPVH07850
MiniPrep عدة تنقية البلازميد، PureLink سريعة إينفيتروجن K2100-11
MaxiPrep عدة تنقية البلازميد، PureLink HiPure إينفيتروجن K2100-07
نان 3 سيغما S8032
pDISPLAY التعبير ناقلات إينفيتروجن V660-20
البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا)، 100X إينفيتروجن 15140-122
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، معقم 1X سيغما D8537
Polyethyleneimine (PEI)، وخطي 25 كيلو دالتون Polyscience 23966
المقشود مسحوق الحليب الجاف قرنفل
Stericup-GP الترشيح فراغ الدائرة العامة وحدة، ميليبور SCGPU05RE
0.22 ميكرون، سعة 500 مل
زرقة التريبان إينفيتروجن 15250061
التربسين، EDTA، 0.05٪ (W / V) إينفيتروجن 25300-054
توين-20 سيغما P7949
فالبرويك حمض سيغما P4543
Centramate عرضية نظام تدفق غطاء النعش
CO 2 حاضنة مرطب، ومعيار 6.0 متر مكعب. قدم مختلف العلامات التجارية المتاحة
الكهربائي ونقل وحدة مختلف العلامات التجارية المتاحة
حاضنة و 37 درجة مئوية مختلف العلامات التجارية المتاحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
  2. Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
  3. Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
  4. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
  5. Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
  6. Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
  7. Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
  8. Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
  9. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
  10. Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
  11. Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
  12. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
  13. Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
  14. Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
  15. Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
  16. Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
  17. Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
  18. Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK 293T PEI 10

مقالات ذات صلة