فلوري في الموقع التهجين (FISH) لتحديد النصوص مرنا في الخلايا الفردية يسمح تحليل النشاط جينائي مثل النسخ في وقت واحد من أكثر من عضو واحد في فار الأسرة متعددة الجينات في المتصورة المنجلية الكريات الحمراء المصابة 1. أسلوب قابل للتكيف ويمكن استخدامها على أنواع مختلفة من الخلايا والجينات والكائنات الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتوسطت التصاق الكريات الحمراء المنجلية من المصابين (IE) لمستقبلات البطانية الإنسان خلال الإصابة بمرض الملاريا بنسبة التعبير عن المتغيرات البروتين المشفرة بواسطة PfEMP1 الجينات فار.
وفرداني P. المنجلية الجينوم تؤوي ما يقرب من 60 جينات مختلفة من فار الذي يعتقد الشخص الوحيد الذي كتب في الخلية في وقت الدم خلال المرحلة العدوى. كيف يتم تحقيق مثل هذه اللائحة يستبعد بعضها بعضا من النسخ الجيني فار غير واضح، كما هو تحديد الجينات الفردية أو فار مجموعات فرعية من الجينات المرتبطة فار المستقبلات المختلفة، وذلك من الربط الفرق على نتائج السريرية لP. المنجلية العدوى. مؤخرا، تم استدعاء النموذج النسخ يستبعد بعضها بعضا في شك من المقايسات النسخ يعتمد على الفردية P. تحديد نص في المنجلية واحد INFخلايا الدم الحمراء ected باستخدام RNA الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) تحليل النسخ الجيني فار من الطفيل في نوى الفردية P. IE المنجلية 1.
هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لتنفيذ منهجية RNA-FISH لتحليل النسخ الجيني فار في نوى وحيد من P. المنجلية المصابة الكريات الحمراء الإنسان. وتستند هذه الطريقة على استخدام digoxigenin والبيوتين التي تحمل علامات مضاد تحقيقات RNA باستخدام TSA زائد الإسفار لوح النظام 2 (بيركن إلمر)، P. التحليلات المجهرية وتحديد طازجة IE المنجلية. يمكن استخدام أسلوب التهجين في الموقع لمراقبة النسخ وتنظيم مجموعة متنوعة من الجينات التي أعرب عنها خلال مراحل مختلفة من P. المنجلية دورة الحياة، وقابلة للتكيف مع الأنواع الأخرى طفيل الملاريا وغيرها من الكائنات وأنواع الخلايا.
البروتوكول
1. جيل من تبدي الكريات الحمر المصابة مختارة فرشلي
لهذا الفحص، ويتم الحصول على أفضل النتائج عند استخدام الثقافات اختيار طازجة للتعبير سطح PfEMP1 البروتين. في هذه التجربة سيما P. 3D7 وقد تم اختيار النسب المنجلية باستخدام الاجسام المضادة المحددة كما هو موضح سابقا 1.
يوم 1
- حصاد 200 ميكرولتر من خلايا الدم معبأة من P. المنجلية الثقافة التي تحتوي على 2-5٪ IE مرحلة متأخرة بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعادة تعليق بيليه الدم في 2 مل من 37 ° C الحارة حل الجيلاتين 0.75٪ في أنبوب العقيمة 14 مل، ويترك لمدة 15-20 دقيقة في C ° 37 للسماح للIE غير مصاب وخاتم المرحلة إلى الرواسب.
- حصاد IE في وقت متأخر من المرحلة، أي مرحلة العليا، في أنبوب جديد 14 و مل يغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام.
- تمييع 50 ميكرولتر من PfEMP محددة المضادة1 الأجسام المضادة في 2 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام وتصفية العقيمة.
- مزج غسلها في وقت متأخر من مرحلة IE مع أمصال مضادة للتعقيم المخفف في أنبوب العقيمة 14 مل واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
- تدور باستمرار في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام.
- يغسل 50 ميكرولتر من البروتين Dynabead A مرتين مع التعليق RBC غسل وسائل الإعلام باستخدام DynaMaq-15 المغناطيس.
- إعادة تعليق على Dynabeads في 300 RBC وسائل الإعلام غسل ميكرولتر وإضافتها إلى IE وقت متأخر من مرحلة غسلها. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 مع الإثارة لطيف.
- نقل أنبوب إلى المغناطيس DynaMaq-15. ترك لمدة 1-2 دقيقة، وإزالة جميع السائل.
- إعادة تعليق على Dynabeads في مل 4-5 من RBC غسل وسائل الإعلام. نقل مرة أخرى إلى أنبوب المغناطيس وترك الأمر لمدة 1-2 دقائق قبل إزالة كل السائل. كرر الخطوة غسل مرة واحدة.
- نقل الخرز غسلها إلى 25 سم 2 F الثقافة عقيمةاسك تحتوي على 200 ميكرولتر معبأة طازجة خلايا الدم الحمراء. إضافة 5-6 مل من وسائل الإعلام Albumax في الثقافة. بين عشية وضحاها في تخزين 5٪ CO 2 في 37 ° C.
يوم 2
- إزالة Dynabeads من الثقافة عندما IE اختيار واعادة احتلالهما في خلايا الدم الحمراء الطازجة عن طريق نقل كل ثقافة لأنبوب العقيمة 14 مل. وضع أنبوب على المغناطيس-15 DynaMaq وترك لمدة 1-2 دقيقة. ثم، من أجل عودة جميع السائل إلى قارورة الثقافة.
- ثقافة ودورات أقل عدد ممكن حتى تطفلن الدم من 5-10٪ والطفيليات هي في ringstage.
- وينبغي تحليل IE من FACS للتأكد من أن النمط الظاهري سطح الصحيح، لقد تم الحصول على البروتين من أي تعبير إما and/orPF11_0008 PFD1235w 1.
2. إعداد مجسات
تم إنشاء RNA تحقيقات العقاقير من أكثر المناطق متغير من PFD1235w وفار PF11_0008 </ م> من الجينات P. المنجلية DNA 3D7 الجيني. تم تضخيم الحمض النووي عن طريق PCR والمستنسخة في ناقلات أو 19 لpSPT18 النسخ، على التوالي وفقا لوصف الشركة المصنعة (شركة روش). وصفت تحقيقات (أزواج قاعدة 580 (بي بي) و 590 BP في الطول) مع Digoxigenin (DIG) أو البيوتين باستخدام RNA DIG وضع العلامات كيت أو مزيج البيوتين وضع العلامات RNA، على التوالي. اكدنا على خصوصية كل من تحليلات تحقيقات طخة الشمالية وحيد التسمية تحليل FISH 1.
3. رقيقة مسحة من الطفيليات وتثبيت قبل في التهجين الموضعي
يوم 1
يتم تنفيذ جميع الخطوات في بيئة خالية من ريبونوكلياز وجميع الكواشف ريبونوكلياز خالية أو ما قبل المعالجة مع pyrocarbonate اثيل (DEPC) أو ريبونوكلياز زاب (إينفيتروجن). يجب تنظيف الشرائح وتغطية زلات مع الكحول لإزالة الشحوم المتبقية التصنيع. من المهم لأداء بروتوكول دون أي توقف في الخطوات بينمن أجل تقليل مخاطر التلوث نوكلياز.
- تقديم فيلم رقيقة الدم بواسطة الطريقة المعيارية نشر 3. باستخدام عدسة 100X من النفط الهدف المجهر، عد IE وحساب النسبة المئوية من IE في الثقافة. تأكد من أن الطفيلي في مراحل التزامن التقريبي، في حلقة ومراحل مبكرة من أتروفة دورة IE. هذه هي مرحلة ما قبل النسخ المتماثل، مراحل أحادي nucleate، معربا عن الجينات مرنا فار واحد ومناسبة لفحوصات الخلية النسخ FISH من هذا النوع.
- نقل 50 ميكرولتر من ثقافة الطفيلي، في تطفلن الدم من 5-10٪، إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف ريبونوكلياز خالية. الطرد المركزي ل1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة وسائل الإعلام وإضافة 50 ميكرولتر PBS درجة الحموضة 7.2 في DEPC المعالجة المائية. تستنهض الهمم الأنبوب بلطف. كرر الخطوة الترسيب الطرد المركزي مرتين لغسل خلايا خالية من وسائل الإعلام والحطام الخلية.
- تقديم أربعة جيدة مسحات رقيقة الجودة. لكل التشويه، تشويه جعل واحدة على1 قطرها 11 ملم جيدا من الشريحة 4 جيدا، والشرائح الزجاجية أي أربعة في المجموع، في هود ريبونوكلياز خالية (خطوة حاسمة). موجة الشرائح لفترة وجيزة في الهواء لتجف. جعل ثلاث شرائح إضافية لشريحة السلبية الضوابط واحد لتلطيخ واحد لتحقيق الجينات أي صلة أخرى باستخدام مسبار محددة، شريحة أخرى لتلقي العلاج وريبونوكلياز شريحة ثالث يتضمن IE لا يعبر عن الجينات في المصالح. ترك الشرائح لتجف على مقاعد البدلاء لمدة 10-20 دقيقة.
- إصلاح الأغشية الرقيقة من يضيف 60 ميكرولتر من محلول يحتوي على تثبيت بارافورمالدهيد 4٪ و 5٪ حمض الخليك الجليدية في الآبار. يترك لمدة 10 دقيقة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 2X الشرائح في SSPE العازلة لمدة 5 دقائق بواسطة التحريض في درجة حرارة الغرفة لطيف. إزالة السائل الزائد لفترة وجيزة عن طريق لمس الآبار التي تحتوي على الخلايا بلطف بمنديل ورق.
- تغطية الشرائح مع البيبسين 0.01٪ في حمض الهيدروكلوريك M 0.01 عن 2 دقيقة عند 37 ° C (خطوة حرجة للغاية). غسل 2X الشرائح في SSPE لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع الحل ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية مسحات المراقبة السلبية مع 60 ميكرولتر من محلول ريبونوكلياز. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 وتغسل ثم الشرائح في SSPE 2X لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الشروع فورا في الخطوة التهجين.
4. التهجين تحقيقات RNA على الشرائح الثابتة
يوم 1
- إعداد غرفة التهجين، مثل ThermoStar 100 HC4 أو تلميح ماصة فارغة مربع وضعت في فرن نظيفة، عن طريق الرش مع زاب ريبونوكلياز ومسحه بمنديل تنظيف الورق. ملء قنوات للغرفة التهجين أو الجزء السفلي من مربع مع DEPC المياه المعالجة للتأكد من أن الشرائح لن تجف خلال التهجين. إغلاق الغرفة وسخن إلى 48 ° C.
- يخفف من تحقيقات في حل التهجين إلى تركيز النهائي من 12 نانوغرام / ميكرولتر. تفسد الحل التحقيق في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة التدفئة. البرد على الفور على الجليد.
- الهواء الجاف لفترة وجيزة الشرائح بعد غسل 2X SSPE. إزالة السائل الزائد بعناية حول الآبار بمنديل ورق.
- فتح غرفة التهجين ووضع الشرائح في الغرفة. تطبيق أحد أو كلا تحقيقات في وحدة تخزين ما مجموعه 60 ميكرولتر لكل بئر. تغطية بعناية قطرة السائل مع زلة غطاء ريبونوكلياز خالية باستخدام ملقط معقم.
- إغلاق الغرفة وهجن الشرائح في C ° 48 للا يقل عن 16 ساعة خلال الليل.
5. اقتران الأجسام المضادة والتضخيم الإسفار
يوم 2
وتستند الخطوات التالية على نظام TSA زائد الإسفار لوح من إلمر بيركن. تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الشرائح 3 مرات في المخزن المؤقت TNT لمدة 5 دقائق مع التقليب لطيف.
- منع الآبار في 150 ميكرولتر من العازلة TNB لمدة 30 دقيقة.
- تمييع HRP، مترافق α-DIG الأجسام المضادة في المخزن المؤقت TNB في نسبة 1:100 وHRP، مترافق الضد α-البيوتين في المخزن المؤقت TNB، بنسبة 1:500 من. إزالة أي العازلة TNB الزائدة من الشرائح بمنديل ورق. عندما كشف في وقت واحد 2 النصوص، يمكن كل من الأجسام المضادة تذهب في آن واحد. تطبيق بمبلغ إجمالي قدره 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في TNB جيدا وبعناية مع تغطية زلة غطاء. احتضان لمدة 2 ساعة الشرائح.
- إزالة تغطية زلات بعناية. غسل العازلة TNT الشرائح في 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- تمييع FITC-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500 وتطبيق 100 ميكرولتر من حل كل بئر. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة.
- إزالة الغطاء ينزلق بعناية وغسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت بواسطة TNT التحريض لطيف.
- تمييع Cyan3-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500. إضافة 100 ميكرولتر فيكذلك من هذا الحل. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة.
- إزالة الغطاء ينزلق بعناية وثم شطف الشرائح بسرعة عن طريق الغمر في المخزن المؤقت TNT.
- غسل الشرائح 3 مرات مع العازلة TNT لمدة 5 دقائق.
- تزج الشرائح بسرعة في DEPC المعالجة المائية.
- ترك الشرائح للهواء الجاف. تحميل الشرائح مع مكافحة تتلاشى كاشف تحتوي على دابي. ختم زوايا تغطية زلات بطلاء الأظافر.
- الشرائح جاهزة الآن للفحص المجهري. الحفاظ على الشرائح مغطاة رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية إذا كان التجربة هي ان تنجز في اليوم التالي. يمكن أن يتم الختم A كاملة من الجانبين من الشرائح يعمل 24 ساعة بعد تطبيق كاشف مكافحة تتلاشى. وهذا سوف يسمح ليمكن تصوير الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد الانتهاء من البروتوكول.
6. التصور من مجسات تهجين
- بدوره على المجهر. A المجهر القياسية المناعي هو sufficient لهذا النوع من التجربة، ولكن إذا كان لديك الوصول إلى المجهر متحد البؤر يمكنك أيضا استخدام هذه الصور ل3D أو للحصول على مقاطع الفيديو الخاصة بك من الخلايا الملون. تسمح المجهر في عملية الاحماء ل15-30 دقيقة. التبديل على جهاز الكمبيوتر والبرمجيات.
- التحقق من جودة تلطيخ على المجهر المناعي. اختيار بقعة تحتوي على طفيليات قليلة.
- ضبط الربح من كل الليزر يدويا. ضبط بكسل يسكن إلى 4-6 م -1 ق -1 و الخطوات إلى 512 بكسل 512 ×.
- التقاط صورة لامدا الاختبار باستخدام الإطار. إعادة ضبط كسب الليزر.
- اتخاذ الحد الادنى من 20 صورة جيدة واحدة من الخلايا الفلورسنت. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2-5 صور حقل يحتوي 5-20 الطفيليات من أجل الحصول على لمحة العادلة لنسبة الطفيليات إيجابية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1 يوضح المخطط الانسيابي من الخطوات الرئيسية والمدة الزمنية للمنهجية FISH RNA.
هذه سلسلة من الصور ممثل بشكل جيد والحفاظ سيئة الملون التجارب FISH مرنا باستخدام واحد P. وتظهر المنجلية IE في الشكل 2. هذه الخلايا لديها الأوالي صغيرة (1-1.5 ميكرون قطر) النواة التي اتسخت الأزرق مع دابي. أربع وعشرين ساعة بعد الغزو في كرات الدم الحمراء P. المنجلية عملية تك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل FISH RNA، وعلى النقيض من الأساليب مثل النشاف الشمالية وRT PCR-، يسمح التمييز النصوص مرنا محددة على المستوى خلية واحدة. هذا يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا النشطة وغير النشطة transcriptionally، في هذا المثال، P. البروتوزوا الطفيلية المنجلية داخل خلايا الدم الحمراء. مثل خلية كاملة الملاحظات اللازمة وغالبا ما تكون قد كشف أنماط الترانسكربتي مهمة وجديدة 1.
على الرغم من أن وصفت غير...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل Alifrangis وAbildtrup العلا للالتنميط الجيني من الطفيليات وهولم كريستينا للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (منحة 55005511)، ومؤسسة وندبيك (R9-A840 منحة) ومؤسسة نيلز بوهر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
| حمض الخليك | سيغما / الدريتش | 338826-100ML | |
| Albumax وسائل الإعلام: RPMI حل الجلوتامين 1640 | Lonza | BE12-115F | 500 مل RPMI 1640 محلول 5 مل الجلوتامين |
| Albumax وسائل الإعلام: جنتاميسين سلفات Albumax-الحل | Lonza | BE02-012E | جنتاميسين سلفات 2.5 مل 50 مل Albumax-الحل |
| Albumax-الحل: الهيبوزانتين | سيغما الدريخ | H9377 | 0،8 ز الهيبوزانتين |
| Albumax-الحل: AlbuMAX II | أناnvitrogen | 11021-037 | 200 غ Albumax |
| Albumax-الحل: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 لتر RPMI 1640 حل مع المغناطيس في حد أقصى. 50 ° C. تصفية تعقيم وتخزين في -20 درجة مئوية في مأخوذة. |
| Amberlite | سيجما | A5710-110G | الراتنج لdeionize الفورماميد. |
| مكافحة البيوتين البيروكسيداز PAB الماعز المتقارنة | Calbiochem | 203206 | |
| المضادة للحفر الأجسام المضادة | نوفوس البيولوجية | NB100-41330 | |
| مكافحة تتلاشى مع كاشف دابي | إينفيتروجن | P36931 | وسائل الإعلام لديها تركيب لعلاج لمدة 24 ساعة قبل أن ينتزع الشريحة تماما. |
| البيوتين RNA وصفها ميكس | روش | 11685597910 | |
| كاميرا رقمية | نيكون الرقمية DC-F11 البصر | ||
| Coverslips | منزل-جلاسر | 631-1570 | |
| ثقافة قارورة 25 سم سطح Nunclon 2 | نونك | 156340 | |
| DEPC | Fluka / سيجما | 32490-100ML | 1 مل DEPC في الماء 1000 مل deinonized. إضافة شريط ضجة ويحرك المزيج لمدة 12 ساعة. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. |
| كاميرا رقمية | نيكون الرقمية DC-F11 البصر | ||
| Dynabeads البروتين | إينفيتروجن | 10002D | |
| DynaMaq-15 المغناطيس | إينفيتروجن | 123-01D | |
| الفورماميد bioultra 99٪ | Fluka/ سيجما | 47671-1L-F | منزوع الأيونات الفورماميد: 5 غ من راتنج التبادل الأيوني لكل 100 مل من الفورماميد. يحرك المزيج 30 دقيقة. من خلال ورقة ترشيح WHATMAN. |
| . الجيلاتين 0 حل 75٪: الجيلاتين | سيغما الدريخ | G2500 | 3،75 ز الجيلاتين في 500 مل من RPMI 1640. الحرارة إلى 56 ° C إلى حل. تصفية تعقيم 56 ° C. عندما المحل في -20 درجة مئوية في مأخوذة. |
| . الجيلاتين 0 حل 75٪: 1640 RPMI | Lonza | BE12-115F | 3،75 ز الجيلاتين في 500 مل من RPMI 1640. الحرارة إلى 56 ° C إلى حل. تصفية تعقيم 56 ° C. عندما المحل في -20 درجة مئوية في مأخوذة. |
| الجلوتامين الحل: L-glutamin | سيغما الدريخ | G3126 | الجلوتامين L 14،6 غرام في 500 مل من كلوريد الصوديوم 0،9٪. حل وتصفية قterilize وتخزينها في -20 درجة مئوية في مأخوذة. |
| الجلوتامين الحل: حمض الهيدروكلوريك | سيجما | H1758 | الجلوتامين L 14،6 غرام في 500 مل من كلوريد الصوديوم 0،9٪. حل، تصفية تعقيم وتخزينها في -20 درجة مئوية في مأخوذة. |
| حل التهجين: الفورماميد بيو جدا 99٪ SSC 20X | Fluka / سيجما | 47671-1L-F | المجموع 20 مل، والحفاظ على تجميد في -20 ° C مأخوذة في 10 مل الفورماميد منزوع الأيونات |
| حل التهجين: التركيز على Denhardt 50X | سيجما | D2532 | 5ml 20xSSC |
| حل التهجين: كاشف الخميرة حجب tRNARoche | سيجما | R-6750 | 2 مل 50X Denhardt في 250 ميكرولتر 20 ملغ لكل مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال |
| حل التهجين: سمك السلمون الحيوانات المنوية DNA | Fluka / سيجما | 31149-106GF | 0.4g روش حظر كاشف 1 مل من 10 ملغ في سمك السلمون مل DNA الحيوانات المنوية (الحرج: تفسد spermDNA السلمون في 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إلى حل التهجين) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil الآلات محدودة | 1004-0011 | ويمكن الاستعاضة عن الفرن التهجين التهجين وغرف ريبونوكلياز مجانا مبطن بالماء DEPC. |
| الغمر النفط UV شفافة مضان مجانا | سيجما | 10976-1EA | |
| المناعي أو مبائر المجهر | نيكون D-الكسوف TE2000C | ||
| Nailpolish | متوفرة في أي صيدلية | ||
| PBS 20X: كلوريد الصوديوم بوكل نا 2 HPO 4 × 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC منزوع الأيونات H 2 O | Ajust درجة الحموضة إلى 7.4 160 غ 4 غرام 23 ز 4 غرام 1 لتر | ||
| بارافورمالدهيد 4٪ | Fluka / chemika | 76240 | PFA 4 غرام في PBS مل 80 / DEPC. الحرارة إلى 65 درجة مئوية حتى يذوب PFA. إضافة 20 مل PBS، تسمح الحل لتبرد. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تصفيتها. متجر في مأخوذة في -20 ° C. |
| بارافورمالدهيد 4٪ / حامض الخليك 5٪ | 950 + 50 ميكرولتر paraformaldhyde حمض الخليك ميكرولتر | ||
| البيبسين | سيغما / الدريتش | P7000 | |
| البيروكسيديز، مترافق المضادة للالبيوتين | Calbiochem | 203206 | |
| RBC غسل وسائل الإعلام: RPMI حل الجلوتامين 1640 | Lonza | BE12-115F | 500 مل RPMI 1640 الجلوتامين 5 مل الحل |
| RBC غسل وسائل الإعلام: جنتاميسين سلفات | Lonza | BE02-012E | جنتاميسين سلفات 2.5 مل |
| ريبونوكلياز | سيغما / الدريتش | جعل 10 ملغ / مل محلول المخزون. | |
| ريبونوكلياز الحرة أنبوب 1.5 مل | Ambion | AM12450 | |
| ريبونوكلياز زاب | Ambion | AM9780 | |
| الشرائح 4 آبار 11MM | الحرارية العلمية | MENZXER306W | |
| SSC 20X: كلوريد الصوديوم | سيغما / شركةdrich | S9625 | 3 M كلوريد الصوديوم (175 غرام / لتر) 0.3M 3 سترات الصوديوم X H 2 O (88 غرام / لتر) ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 1M |
| SSC 20X: الصوديوم سترات يذوى | سيغما / الدريتش | W302600 | 3 M كلوريد الصوديوم (175 غرام / لتر) 0.3M 3 سترات الصوديوم X H 2 O (88 غرام / لتر) ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 1M |
| SSPE 20X: كلوريد الصوديوم | سيغما / الدريتش | S9625 | 175،3 ز كلوريد الصوديوم |
| SSPE 20X: ناه 2 ص 4 | سيغما / الدريتش | S0751 | 27،6 ز ناه 2 PO 4. |
| SSPE 20X: 4 EDTA مسحوق | 9،4 ز EDTA مسحوق إضافة الماء DEPC، وضبط درجة الحموضة 7.4. السياراتالعصا لمدة 20 دقيقة | ||
| TNB العازلة: العازلة TNT | 10 مل العازلة TNT | ||
| TNB العازلة: كاشف الحظر | 0.05g كاشف الحظر حل كاشف حظر، تسخين حل لC ° 60 لمدة ساعة مع التحريك. مخزن في -20 ° C. (مشتقة من إلمر بيركن TSA-البروتوكول.) | ||
| TNT العازلة: تريس / حمض الهيدروكلوريك | سيجما | T1503 | 1M تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 |
| TNT العازلة: كلوريد الصوديوم | سيغما الدريتش | S9625 | 100 مل |
| TNT العازلة: Tween20 | سيجما | 93773 | 5 M كلوريد الصوديوم 30 مل 1 مل DEPC DH 2 O869 مل ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 في درجة حرارة الغرفة. (مشتقة من إلمر بيركن TSA-البروتوكول.) |
| بالإضافة إلى TSA Cyanine3 / فلوريسئين النظام | بيركن إلمر | NEL753000IKT | قراءة البروتوكول من نظام TSA زائد الإسفار لوح بعناية قبل بدء التجربة. |
| 14 مل أنابيب معقمة | Almeco - CM LAB نقاط و | 91016 |
المراجع
- Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).
- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
- Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117(2009).
- Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
- Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
- Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
- Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
- Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
- Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
- Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
