يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ترنسفكأيشن الأجسام المضادة إلى الخلايا العصبية كأداة للدراسة إمراض مرض

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4154

⸱

سبتمبر 26, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Administration Medical Center, Memphis, TN, 2Department of Neurology, University of Tennessee Health Science Center, Memphis, TN, 3Department of Anatomy/Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, Memphis, TN

في هذه المقالة

ملخص

ووصف النهج السريع للتحقيق في التفاعلات والآثار على الآليات الجزيئية ذات الصلة وجود الأجسام المضادة في بيئة داخل الخلايا. الأسلوب ينطوي ترنسفكأيشن من الأجسام المضادة في الخلايا الحية باستخدام تشكيل التساهمية غير معقدة تقوم على صياغة المادة الدهنية. هذه التقنية قابلة للتكيف مع خطوط الخلايا والخلايا الأولية خلد.

الملخص

توفر الأجسام المضادة القدرة على اكتساب رؤى جديدة حول مختلف الأحداث التي تقع في الأنظمة الحية. وقد سمحت القدرة على إنتاج أجسام مضادة عالية التخصص لاستهداف بروتينات معينة بمعالجة أسئلة بيولوجية دقيقة للغاية. ومن المهم الإشارة إلى أن الأجسام المضادة قد ارتبطت بالنشوء المرضي لعدد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الذئبة الحمامية الجهازية (SLE)، والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA)، والمتلازمات الأباعدية، والتصلب المتعدد (MS)، واعتلال النخاع المرتبط بالفيروس الليمفاوي التائي البشري من النوع الأول (HTLV-1)/الشلل التشنجي السفلي الاستوائي (HAM/TSP) 1-9. ويعد الكيفية التي تسبب بها الأجسام المضادة المرض مجالاً من مجالات البحث المستمرة، وتشير البيانات إلى أن التفاعلات بين الأجسام المضادة والجزيئات المختلفة داخل الخلايا تؤدي إلى الالتهاب، واختلال الرسائل الخلوية، والموت الخلوي المبرمج (apoptosis) 10. وقد ثبت أن المرضى المصابين بالتصلب المتعدد (MS) واعتلال النخاع المرتبط بـ HAM/TSP ينتجون أجساماً مضادة ذاتية ضد البروتين الرابط للحمض النووي الريبي (RNA) داخل الخلايا، وهو البروتين الريبونوكليوي غير المتجانس A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. وتشير البيانات الحديثة إلى أن الأجسام المضادة لكل من المستضدات داخل العصبونات والمستضدات السطحية هي أجسام ممرضة 3, 5-9, 11. وبناءً على ذلك، فإن وجود إجراء يسمح بدراسة التفاعلات بين الأجسام المضادة والبروتينات داخل الخلايا من شأنه أن يقدم رؤية عميقة حول النشوء المرضي للمرض.

من الشائع نقل الجينات (transfection) إلى الخلايا الأولية والخطوط الخلوية المستزرعة، إلا أن نقل الأجسام المضادة إلى الخلايا كان متعثراً بسبب تغير بنية الجسم المضاد أو انخفاض كفاءة النقل 12. وتشمل طرق النقل الأخرى نقل الأجسام المضادة القائم على الليبوزومات الموجبة (المكونة من DOTAP/DOPE) والبولي إيثيلين إيمين (PEI)؛ وقد أدى كلا الطريقتين إلى انخفاض بمقدار عشرة أضعاف في نقل الأجسام المضادة مقارنة بالمجموعات الضابطة 12. إن الطريقة المتبعة في دراستنا تشبه الطرق التي تتوسطها الدهون الموجبة، حيث تستخدم آلية قائمة على الدهون لتكوين معقدات غير تساهمية مع الأجسام المضادة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية والكارهة للماء 13. لقد استخدمنا كاشف Ab-DeliverIN، وهو تركيبة دهنية قادرة على التقاط الأجسام المضادة عبر تفاعلات كهروستاتيكية وكارهة للماء غير تساهمية وتوصيلها إلى داخل الخلايا. وبذلك، لا تكون عمليات الربط الكيميائي والجيني ضرورية لتوصيل أجسام مضادة وظيفية إلى الخلايا الحية. وقد مكنتنا هذه الطريقة من إجراء تجارب متنوعة لتتبع الأجسام المضادة وتحديد تموضع البروتين، بالإضافة إلى تحليل التبعات الجزيئية للتفاعلات بين الأجسام المضادة والبروتينات داخل الخلايا 9.

في هذا البروتوكول، سنوضح كيفية نقل الأجسام المضادة إلى الخلايا العصبية بسرعة وبشكل قابل للتكرار وبدرجة عالية من كفاءة النقل. وكمثال على ذلك، سنستخدم الأجسام المضادة anti-hnRNP A1 و anti-IgG. ولتسهيل قياس كفاءة النقل، استخدمنا أجساماً مضادة anti-hnRNP A1 موسومة بـ Atto-550-NHS وأجساماً مضادة IgG موسومة بـ FITC. ويعد Atto550 NHS وسماً جديداً يتميز بامتصاص جزيئي ومردود كمي عاليين. كما أن مصدر الإثارة ومرشحات الفلورة لـ Atto550 مشابهة لـ Cy3 (Ex. 556 Em. 578). بالإضافة إلى ذلك، يتميز Atto550 باستقرار ضوئي عالٍ. وقد استُخدمت IgG الموسومة بـ FITC كعنصر تحكم لإظهار أن هذه الطريقة متعددة الاستخدامات ولا تعتمد على نوع الصبغة. سيساعد هذا النهج والبيانات الناتجة عنه في فهم الدور الذي قد تلعبه الأجسام المضادة للمستضدات المستهدفة داخل الخلايا في إمراضية الأمراض البشرية.

البروتوكول

1. وصفها الأجسام المضادة (الشكل 1)

  1. جعل 0.1 M 3 NaHCO العازلة:
    • 8،4 ز NaHCO 3
    • 29،2 ز كلوريد الصوديوم
    • 1 لتر H 2 O
  2. جلب عازلة تصل إلى درجة الحموضة من 8.4 مع هذا الحل (10.6 ز نا 2 CO 3 و 29.2 جم كلوريد الصوديوم، 1 لتر H 2 0).
  3. إضافة 35 ميكرولتر Atto550 NHS إلى 70 المضادة للhnRNPA1 و 500 ميكرولتر العازلة ميكرولتر 3 NaHCO وتناوب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران لمدة ساعة، حقن الخليط في مديال وdialyze في 2 لتر من PBS بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي، تركيز مدال Atto550 NHS مكافحة hnRNPA1 باستخدام عمود الدوران (Amicon الترا 0.5).
  5. بعد NHS Atto550 صفت وتركزت مكافحة hnRNPA1 الأجسام المضادة، نانو الإفلات عينة لتحديد التركيز.

2. ترنسفكأيشن الأجسام المضادة (الشكل 2)

  1. 10 5 خلايا البذور / بشكل جيد في 500 ميكرولتر من Dulbeccيا لمعدلة النسر متوسطة (+10٪ FBS DMEM/F12 +1٪ المضادات الحيوية) في 8 جيدا على مدار 24 ساعة الشريحة قبل ترنسفكأيشن. يجب أن تكون الخلية confluency لا يقل عن 70٪.
  2. أربع وعشرين ساعة بعد البذر، إضافة 2 ميكرولتر من كاشف AB-DeliverIN إلى أنبوب إيبندورف.
  3. المقبل، إضافة 2 ميكروغرام من Atto550 NHS المسمى مكافحة hnRNPA1 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب إيبندورف نفس واحتضان 10-15 دقيقة في RT.
  4. خلال الحضانة، إضافة نضح وسائل الإعلام وسائل الإعلام 394 ميكرولتر من DMEM جديدة للخلايا.

ملاحظة: إضافة 500 ميكرولتر DMEM لغرفة واحدة من الخلايا يمسها ليكون بمثابة السيطرة.

  1. بعد الحضانة، إضافة 100 ميكرولتر من DMEM إلى خليط الأجسام المضادة، مزيج من pipetting صعودا وهبوطا، وإضافة إلى الخلايا في DMEM لإجمالي حجم 500 ميكرولتر.
  2. تغيير وسائل الإعلام بعد 48 ساعة من تسليم الأجسام المضادة.

ملاحظة: تم تكرار بروتوكول مع FITC المكتوب عليه ريج والسيطرة الإيجابية.

3. الحية والثابتة التصوير تحديد الكفاءة

  1. الصورة الحية الخلايا في 48 ساعة باستخدام فلتر Cy3 على المجهر الفلورسنت لصورة بالنقل Atto550 NHS الأجسام المضادة المسمى.
  2. بعد انتهائه التصوير الحية، نضح وسائل الإعلام وخلايا الإصلاح.
  3. بعد الشفط وسائل الإعلام، وعلاج الخلايا مع امتصاص العرق 0.4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا 4 × 5 دقائق لكل منها PBS. ثم، تحميل الخلايا التي تحتوي على تصاعد مع وسائل الاعلام دابي كاشف وساترة الإصلاح. قياس الكفاءة ترنسفكأيشن من الخلايا الثابتة مع برنامج Axiovision. إذا Axiovision البرمجيات ليست في متناول اليد، عد ببساطة الأحداث من الصور الخاصة بك عن طريق اليد ونتائج الاندماج في الحساب في 3.7. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام البرنامج ليماغيج هذه الحسابات.
  4. أولا، استخدام "أحداث" القياس لحساب العدد الإجمالي للخلايا في الصورة التي تختارها في 20X التكبير.
  5. المقبل، واستخدام "الأحداث" القياس لحساب الخلايا التي لم تكنتقاس بنجاح مع الأجسام المضادة في نفس الصورة التكبير 20X.
  6. للوصول إلى قياس "أحداث" في شكل نمط إكسل، اضغط على "خصائص"، انقر فوق "قياس" علامة التبويب، وانقر فوق عرض "والجدول".
  7. وأخيرا، استخدام الحساب التالي لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن الخاص من خلال مقارنة الحدثين قياس سابقا: ((خلايا المجموع - خلايا Untransfected) / خلايا الاجمالي) X = ترنسفكأيشن الكفاءة 100.

4. ممثل النتائج

الصور الحية من untransfected (الشكل 3A) مقارنة الخلايا العصبية (الشكل 3B) بالنقل تكشف عن أن لوحظ بشكل واضح بوضع العلامات على الأجسام المضادة (الأحمر أو الأخضر في كل الشكل) داخل الخلايا (الشكل 3B، C، D). بعد غسل وتطلع مع وسائل الإعلام لإزالة الأجسام المضادة أو بين تمسكا سطح الخلايا، والأجسام المضادة المسمى لا تزال موجودة داخل الخلايا العصبية (الشكل 3C، D). لحساب الكفاءة ترنسفكأيشن، استخدام البرنامج لحساب الخلايا Axiovision مجموع مقارنة مع الخلايا التي لم تكن تقاس بنجاح. تم إدخال هذه القيم إلى والكفاءة ترنسفكأيشن صيغة للحصول على كفاءة ترنسفكأيشن كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا (الشكل 4).

figure-protocol-1
الشكل 1. مخطط سير العمليات الإجراءات المستخدمة لتسمية الأجسام المضادة مع استر NHS أتو 550 تليها الخطوات المطلوبة لتركيز الأجسام المضادة المسمى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

figure-protocol-2
الشكل 2. مخطط سير العمليات الإجراءات المستخدمة لبالنقل الأجسام المضادة المسماة في الخلايا الحية في الثقافة.arge.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

figure-protocol-3
الشكل 3. لايف الصور من الخلايا العصبية بالنقل ترنسفكأيشن 48 ساعة التالية.

figure-protocol-4
الشكل 4. الثابتة وتشطف الصور مع الأحداث عد من أجل تحديد كفاءة ترنسفكأيشن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من أجل اختبار الفرضيات حول جزيئات معينة والتعبير عنها، وتقاس عادة الجينات وناقلات أخرى في الخلايا. الجانب الفريد من هذا الإجراء هو القدرة على الأجسام المضادة في بالنقل بسهولة الخلايا المستهدفة. أجرينا هذه الطريقة في خمس تجارب منفصلة في كل التكرارات. وكانت النتائج مماثلة الكفاءة ترنسفكأيشن بين جميع التجارب. الأهم من ذلك أن طريقة تمكن دخول الأجسام المضادة في الخلية دون تغيير هيكل أو وظيفة الأجسام المضادة. علاوة على ذلك، مع استخدام المجهر مضان من الخلايا العصبية حية، ونحن قادرون على ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من قبل مكتب البحوث والتنمية، الخدمات الطبية البحوث وزارة شؤون المحاربين القدامى. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل على جائزة الاستحقاق استعراض VA (لMCL) وجامعة ولاية تينيسي العلوم الصحية مركز التصلب المتعدد صندوق البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة كتالوج رقم
مجهر الفلورسنت AxioObserver A1 زايس
Axiovision الإصدار 4.2 زايس
مكافحة rhnRNPA1 Abcam Ab4791
FITC المسمى مكافحة ريج OZ العلوم البيولوجية AI20100
Atto550 NHS استر سيجما 92835
AB-DeliverIN OZ العلوم البيولوجية AI20100
DMEM/F12 +10٪ FBS المضادات الحيوية +1٪ Gibco 11320-033
بولي يسين D-8-الشرائح الثقافة جيدا BD 354632
متعددة الأغراض الدوار العلمية والصناعاتوفاق شركة نموذج 151
دابي التركيب وسائل الإعلام ميليبور S7113
PBS Ambion 9626
مديال الحرارية فيشر العلمية 66380
Amicon الترا 0.5- ميليبور UFC501096
بارافورمالدهيد (الحل 4٪) علوم المجهر الإلكتروني
نانو قطرة الحرارية فيشر العلمية

المراجع

  1. Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
  2. Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
  3. Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
  4. Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
  5. Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
  6. Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
  7. Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
  8. Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
  9. Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
  10. Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
  11. Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
  12. Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
  13. Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
  14. Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
  15. Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
  16. Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
  17. Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
  18. Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Atto550 NHS IgG FITC hnRNP A1
ترنسفكأيشن الأجسام المضادة إلى الخلايا العصبية كأداة للدراسة إمراض مرض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.