يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية

13.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4182

⸱

أكتوبر 2, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

تم تصميم نظام السيارات المستدامة تنظم البكتيرية لعلاج التلوث النفطي باستخدام معيار أجزاء DNA للتبادل (BioBricks). وهندسيا E. القولونية للحط من سلالة الألكانات عبر الأكسدة β في البيئات المائية السامة. أظهرت الإنزيمات منها من الأنواع المختلفة ألكان النشاط التدهور. بالإضافة إلى ذلك، لزيادة التسامح ن الهكسان عن طريق إدخال جينات من البكتيريا التي تتحمل ألكان.

الملخص

هذا العمل يطرح مجموعة أدوات التي تمكن من تحويل الألكانات من الإشريكية القولونية، ويقدم دليلا على مبدأ إمكانية تطبيقه. مجموعة الأدوات يتكون من أجزاء متعددة قابلة للتبديل القياسية (BioBricks) 9 التصدي لتحويل الألكانات، وتنظيم التعبير الجيني والبقاء على قيد الحياة في البيئات الغنية الهيدروكربونية السامة.

تم تنفيذ مسار ثلاث خطوات لتدهور ألكان في E. الإشريكية لتمكين تحويل الألكانات متوسطة وطويلة السلسلة إلى alkanols كل منها، والأحماض alkanals alkanoic-في نهاية المطاف. ويستقلب هذا الأخير عبر مسار β للأكسدة الأصلية. لتسهيل أكسدة المتوسطة سلسلة الألكانات (C5-C13) وcycloalkanes (C5-C8)، وأربعة جينات (alkB2، rubA3، rubA4 والمطاطية) من نظام هيدروكسيلاز ألكان من Gordonia SP. تحولت TF6 8،21 في E. القولونية. لتحويلسلسلة طويلة الألكانات (C15-C36)، تم تنفيذ هذا الجين لادا من thermodenitrificans Geobacillus. لمزيد من الخطوات المطلوبة لعملية التدهور، وأدخلت ADH وALDH (القادمة من thermodenitrificans G.) 10،11. تم قياس النشاط المقايسات الخلية الراحة. لكل خطوة الأكسدة، لوحظ نشاط انزيم.

لتحسين كفاءة عملية، وكان المستحث فقط التعبير في ظل ظروف انخفاض الجلوكوز: تم استخدام الركيزة المروج التنظيم، pCaiF. pCaiF موجود في E. K12 القولونية وينظم التعبير عن الجينات المسؤولة عن تدهور مصادر الكربون غير الجلوكوز.

ونفذ باستخدام الجينات التسامح المذيبات، وPhPFDα β، وكلاهما من Pyrococcus horikoshii OT3 - الجزء الأخير من مجموعة الأدوات - استهداف البقاء. يمكن المذيبات العضوية لحث على الإجهاد وانخفاض الخلايا البقاء على قيد الحياة من قبل affectin سلباغرام من البروتين للطي. كما المحرمين، وPhPFDα β تحسين عملية مثل البروتين للطي في ظل وجود من الألكانات. وقد لوحظت التعبير عن هذه الجينات أدى إلى التسامح الذي أبداه الهيدروكربونية تحسين معدل زيادة النمو (إلى 50٪) في الوجود من 10٪ N-الهكسان في ثقافة المتوسط.

تلخيص، فإن النتائج تشير إلى أن مجموعة أدوات تمكن E. الإشريكية لتحويل وتحمل النفط والغاز في البيئات المائية. على هذا النحو، فإنه يمثل خطوة أولية نحو إيجاد حل مستدام لإصلاح النفطية باستخدام نهج البيولوجيا التركيبية.

المقدمة

يعد التلوث النفطي من أخطر أسباب التلوث البيئي، وهو يؤثر بشكل كبير على الأنظمة البيئية والشركات والمجتمعات 3. فعلى سبيل المثال، هناك حاجة إلى حلول لمكافحة التلوث النفطي المستمر الناتج عن مياه مخلفات الرمال النفطية في ألبرتا بكندا. وخلال عملية استخراج النفط من الرمال النفطية، يتم استخلاص البيتومين، وهو شكل مؤكسد شبه صلب من النفط، باستخدام تقنيات الاسترداد الحراري التي تستهلك حوالي 3.1 برميل من المياه لكل برميل واحد من النفط 1. وتُخزن مياه العمليات الملوثة بالنفط، والتي تأتي أساساً من نهر محلي، في أحواض المخلفات بعد استخراج البيتومين. وهناك حاجة إلى تدوير مياه العمليات بشكل أكثر فعالية من أجل تقليل الحاجة إلى سحب المياه العذبة. ومن أجل تسهيل استخراج البيتومين وضمان تلبية المواقع في المصب لإرشادات جودة المياه لحماية الأنظمة البيئية المائية، تتطور معالجات مياه العمليات بشكل سريع 3.

تُشجع حالياً تقنيات المعالجة الحيوية التي تستخدم الكائنات الدقيقة لمعالجة التلوث بالمركبات العضوية 1. وتعد الألكانات العائلة الأكثر وفرة من الهيدروكربونات في النفط الخام، حيث تحتوي على 5 إلى 40 ذرة كربون لكل جزيء 7, 21. ومن المعروف أن العديد من البكتيريا تقوم بتفكيك الألكانات ذات الأطوال المختلفة عبر الأكسدة المتتالية لمجموعة الميثيل الطرفية، مما يؤدي إلى تكوين الكحولات أولاً، ثم الألدهيدات، وأخيراً الأحماض الدهنية 8. وفي إطار مشروع iGEM هذا، تم التعبير عن عدة إنزيمات من كائنات مختلفة وتوصيفها، وإتاحتها عبر معيار BioBrick وسجل الأجزاء البيولوجية القياسية.

يسهل نظام ألكان هيدروكسيليز المدروس جيداً في Gordonia sp. TF6 خطوة الأكسدة الأولية للألكانات C5-C13 بالإضافة إلى السيكلوألكانات C5-C8 باستخدام أربعة مكونات كحد أدنى: alkB2 (ألكان 1-مونوأكسيجيناز)، وrubA3، وrubA4 (اثنان من الروبيريدوكسينات) وRubB (روبيريدوكسين ريدكتيز) 8, 21. وقد أفيد بأن أكسدة الألكانات طويلة السلسلة (التي تتراوح من C15 حتى C36) تتم بواسطة ladA، وهو ألكان مونوأكسيجيناز بروتيني فلافيني من Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. يشكل LadA معقدًا تحفيزيًا مع فلافين مونو نيوكليوتيد (FMN) يستخدم الأكسجين الذري للأكسدة. ويؤدي ذلك إلى تحويل الألكانات إلى ألكانول أولي مقابل. ثم تُؤكسد الكحوليات بشكل أكبر بواسطة كحول وديهيدروجيناز الألدهيد إلى أحماض دهنية، والتي تدخل بسهولة في مسار β-أكسدة 7, 21. ويقوم كحول ديهيدروجيناز غير معتمد على الزنك من البكتيريا المحبة للحرارة Geobacillus thermoleovorans B23 بأكسدة ألكانولات متوسطة السلسلة إلى الألكانالات المقابلة لها، باستخدام NAD+ كعامل مساعد 10. كما يستطيع ألدهيد ديهيدروجيناز من البكتيريا نفسها تحفيز الخطوة النهائية المعتمدة على NAD+ في أكسدة السلسلة المتوسطة 11.

من أجل تقليل تكاليف الحث والحفاظ على التكاثر الأمثل للنظام البكتيري، تم توصيف المحفز pCaiF من بكتيريا E.coli. يمكن لهذا المحفز تنظيم تعبير مكونات مسار تحلل الهيدروكربونات، ويتم تنظيمه بواسطة مستويات cAMP-Crp، والتي تعتمد بدورها على مستويات الجلوكوز 6. عند التركيزات العالية للجلوكوز خارج الخلية في البيئة، يكون مستوى cAMP (فوسفات أحادي نيوكليوتيد أدينوسين الحلقي) الخلوي منخفضاً نتيجة تثبيط أدينيلات سيكلاز كأثر جانبي لنقل الجلوكوز بوساطة نظام PTS. وعلى العكس من ذلك، أثناء الحالة المحدودة (تركيزات الجلوكوز المنخفضة)، يزداد مستوى cAMP ويرتبط Crp بـ cAMP مكوناً المعقد cAMP-Crp، الذي يرتبط بـ pCaiF وينشط عملية نسخ المكونات المصب 6, 14.

لا تستطيع بكتيريا E. coli من النوع البري تحمل سوى تركيزات متوسطة من الهيدروكربونات. ولإكمال مجموعة الأدوات، كان من الضروري معالجة مسألة تحمل الهيدروكربونات. ومن المعروف أن العديد من البكتيريا المتحملة للمذيبات العضوية يمكنها البقاء على قيد الحياة في أنظمة ثنائية الطور من الماء والمذيب 12. وتعد المرافقات الجزيئية (chaperones)، المعروفة بقدرتها على زيادة التحمل، من المكونات التي تسهل الطي الصحيح للبروتينات. وقد ثبت أن نظام البريفولدين (prefoldin) المستخلص من Pyrococcus horikoshii OT3، والذي يتكون من البروتينين phPFDα و phPFDβ، يزيد من القدرة على تحمل الهيدروكربونات 17.

تم بناء مجموعة أدوات تحويل الألكانات وفقاً لمبدأ BioBrick، الموثق في سجل الأجزاء البيولوجية القياسية 9. وتُعد BioBricks بلازميدات تحتوي على قطعة إدراج وظيفية محددة محاطة بـ 4 مواقع قطع محددة مسبقاً. ويمكن توسيع قطع BioBrick المدرجة بمرونة، مما يسمح ببناء أنظمة بيولوجية ذات وظائف جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. BioBrick الجمعية

  1. وتقدم BioBricks من التسجيل الأجزاء البيولوجية المعيارية من مقر iGEM. لبناء BioBrick جديدة من BioBricks القائمة، هضم BioBrick المانحة (تصل إلى 1.0 ميكروغرام) مع الانزيمات وEcoRI SpeI لتحديد المواقع المصب جزء المانحة للجزء متقبل. ملخص مع XbaI وPstI لتحديد المواقع الجزء المانحة المنبع للجزء متقبل. إضافة 1/3 انزيم تقييد المناسبة التي تقطع في العمود الفقري للالمانحين. أداء الهضم في إجمالي حجم من 20-25 مل مع المخزن المؤقت المناسبة، وفقا لمزود (تركيز النهائي 1X). استخدام 5 وحدات / DNA ميكروغرام للإنزيمات التقييد.
  2. هضم BioBrick متقبل مع أي EcoRI وXbaI أو SpeI وPstI.
  3. احتضان الهضم ل(على الأقل) واحد ساعة في 37 ° C. إبطال نشاط نوكليازات الاقتطاع الداخلية عن طريق الحرارة، الحضانة عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وطرد المركزي في وقت قريب.
  4. Ligate على هضم BioBrickأجزاء (المانحة ومتقبل) معا. منذ XbaI وSpeI توليد ينتهي DNA متوافق، يتم إنشاء موقع المختلطة التي لا يمكن قطع مع أي تقييد انزيم مما أدى إلى BioBrick الجديدة مجتمعة بأن يحيط بها 4 مواقع تقييد القياسية. في خليط ربط تركيز DNA النهائي هو يفضل ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر. أداء رد فعل ربط في إجمالي حجم من 10-15 مل مع المخزن المؤقت ربط T4 (تركيز النهائي 1X) ويغاز T4 (1 وحدة / ميكروغرام DNA).
  5. احتضان الخليط في ربط C ° 16 على الأقل 3 ساعة.
  6. أداء رد فعل التحول مع نصف مزيج من حوالي ربط.
  7. تأكيد BioBrick أن يكون صحيحا مع التسلسل.
  8. لبناء BioBrick جديدة من DNA توليفها، تعديل الجينات لتخليق الأمثل للتعبير في E. القولونية عن طريق أداة الموقع JCat ( http://www.jcat.de/ ). إجراء تعديلات إضافية، وفقا لمتطلبات B ioBrick القياسية. هذا يعني أن توحيد يتكون كل BioBrick من تسلسل الحمض النووي التي تهم يسبقه البادئة ويليه لاحقة. البادئة واللاحقة هي متواليات التي تحتوي على مواقع محددة سلفا تقييد، التي هي غائبة في تسلسل البلازميد المتبقية. تقييد هذه المواقع القياسية تجعل من الممكن لتبادل وتوسيع إدراج BioBrick بمرونة 9. البادئة واللاحقة لها تسلسل التالي:
اسم تسلسل تعليق
بادئة 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' إذا كان الجزء التالي هو تسلسل الترميز أو أي الجزء الذي يبدأ ب "ATG"
لاحقة 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
ove_title "> 2 تحويل ألكان. يستريح الفحص الخلوي، في الجسم الحي

تم إجراء هذا الاختبار يعتمد على الطريقة الموصوفة من قبل فوجي وآخرون (2004).

  1. ثقافة E. خلايا الإشريكية معربا عن نظام هيدروكسيلاز ألكان ( BBa_K398014 ) والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 5 مل المتوسطة LB مع المضادات الحيوية المناسبة بين عشية وضحاها.
  2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل الى OD (الكثافة الضوئية) بنسبة 0.3 في 600 نانومتر.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة و resuspend بيليه في 5 مل العازلة الفوسفات 0،1 M (درجة الحموضة 7.4).
  4. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة و resuspend بيليه في 5 مل العازلة الفوسفات M 0،1 تحتوي على أملاح E2 الآن و0.66٪ V / V الجلسرين (النيتروجين deficienر متوسطة).
  5. قياس العكارة الخلية (OD 600).
  6. إعداد خليط الخلايا مأخوذة من 6 مل مل في 25 قوارير الزجاج المغلقة الغطاء وعدم التحكم الخلية (E2 + أملاح 0.66٪ V / V الجلسرين).
  7. إضافة 100 نانومول لكل من ألكان القارورة.
  8. احتضان مخاليط في C ° 37 لمدة 24 ساعة (تقصير عندما يتم الحصول على معدلات أعلى).
  9. قياس OD 600 بعد الحضانة.
  10. استخراج الهيدروكربونات في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق خلات الإيثيل وتحديد تركيز المواد الهيدروكربونية في الثقافة الخلية بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (انظر البروتوكول 3).
  11. حساب تدهور لكل وحدة من الكتلة الحيوية من خلال تقسيم المبلغ الإجمالي للألكان تحويلها من قبل الحاضر مجموع الكتلة الحيوية في كل قارورة (OD 600 إلى تحويل الوزن الجاف). تقسيم الناتج على مدة تجريبية تعطي النشاط تدهور في الكتلة الحيوية وحدة لكل وحدة الزمن. يتم أخذ المتوسط ​​من ثلاثة أشواط الفردية.

3. ألكان الفحص إنزيم تحويل، وفيالمختبر

تم إجراء هذا الفحص بشكل أساسي وفقا لطريقة وصفها لي وآخرون (2008).

  1. ثقافة E. خلايا الإشريكية التعبير عن الجينات لادا ( BBa_K398017 ) والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 50 مل المتوسطة بالمضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
  2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل إلى الكثافة البصرية بنسبة 0.6 في 600 نانومتر.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 4،000 دورة في الدقيقة (4 ° C) و resuspend بيليه في 5 مل من 50 ملي تريس العازلة.
  4. يصوتن (خلية ديسروبتر، LA النظم البيولوجية) الخلايا في دورة عمل 40٪ مع عنصر تحكم الإخراج من 4، والحفاظ على الحل على الجليد لكامل مدة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في الخليط الناتج لمدة 5 دقائق في 4،000 دورة في الدقيقة في 4 و دعلى سبيل المثال؛ C لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف إلى قارورة جديدة.
  6. تحديد تركيز البروتين الكلي للخلية مقتطفات من الفحص برادفورد. ملاحظة: استخدام قوارير الزجاج لمنع زيادة الخلفية و / أو فقدان البروتين.
  7. إعداد خليط 100 مل تحتوي على 0.1٪ V / V ألكان و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة.
  8. تسخين الخليط في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة فقط لسلسلة الألكانات متوسطة طويلة مع ارتفاع درجة الغليان. (على سبيل المثال C 16: 287 ° C).
  9. لتحقيق الذوبان الأمثل للألكان، يصوتن لمدة 1 دقيقة في حين لا يزال دافئا حتى يتم الحصول على متجانسة، خليط لزج.
  10. إضافة 1MM من NADH، 1 ملم أحادي نوويد الفلافين، 1 ملم MgSO 4 و 0،01 ت / ت تريتون X-100.
  11. إعداد 6 مليلتر مأخوذة في 25 قوارير مغلقة غطاء مل.
  12. إضافة كميات كافية من مستخلص الخلية (يعتمد على المقايسات برادفورد، وتركيز النهائي من 5 ملغم بروتين / لتر). إعداد التحكم لم البروتين.
  13. احتضان عند 60 ° C (للبريد الأمثلnzymatic النشاط) لمدة 24 ساعة.
  14. استخراج الهيدروكربونات في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق خلات الإيثيل وتحديد تركيز المواد الهيدروكربونية في الثقافة الخلية بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (انظر البروتوكول 3).
  15. وأضاف حساب تدهور لكل وحدة من الكتلة الحيوية من خلال تقسيم المبلغ الإجمالي للألكان تحويلها من قبل البروتين الكلي لكل قارورة (من منحنى المعايرة برادفورد). مزيد من تقسيم مدة التجربة تعطي النشاط تدهور لكل وحدة من البروتين الخلوي لكل وحدة الزمن. يتم أخذ المتوسط ​​من ثلاثة أشواط الفردية.

4. إيثيل أسيتات استخراج النفط والغاز وقياسات تركيز

  1. يتم استخراج الألكانات من محلول مائي عن طريق إضافة 2.5 مل خلات الإيثيل (solvant عديم الأقطاب) إلى حل التجريبية 6 مل. يتم إضافة القياسي الداخلي للمذيب عند تركيز 0.1٪ (V / V). المعيار (على سبيل المثال، سيكلو ديكان) تختلف اعتمادا على مجموعة من قمم المتوقع في المصالح.
  2. اختياري: إضافة تريتونX-100 إلى خليط مائي وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة من أجل الحصول على المناسبة ثنائية طوري النظام.
  3. دوامة الخليط لمدة 5 ثوانى (1،500 دورة في الدقيقة) واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى مرحلتي منفصلة.
  4. إزالة كمية ممكنة من الطبقة العضوية (أعلى) وتجفيف المذيبات اللامائية باستخدام كبريتات المغنيسيوم.
  5. إزالة MgSO 4 من الترشيح (0.2 ميكرومتر) ونقل الراشح في قوارير الغاز اللوني للمقاييس، أو مخزن في -20 ° C.
  6. تحديد تركيز بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي باستخدام عمود CP-SIL 5CB (طول = 5 م). حقن 10 ميكرولتر من العينة في طريقة تقسيم (1:10، 230 ° C). تعيين العمود تدفق الغاز إلى 1 مل / دقيقة (الهيليوم). ويستخدم الفرن درجة حرارة التالية البرنامج:
    معدل درجة حرارة [° C] الوقت [دقيقة]
    0 50 7.5
    50 90 1.0
    50 110 2.0
    50 130 2.0
    50 145 2.0
    50 160 2.0
    50 170 2.0
    50 185 2.0
    50 210 2.0
    50 250 2.0
    50 320 2.0
  7. دمج القمم وتصحيح تركيزات فيما يتعلق القياسي الداخلي.

5. الكحول / الفحص ألدهيد نشاط إنزيم

تم إجراء هذا الفحص بشكل أساسي وفقا لطريقة وصفها آخرون كاتو.(2010).

  1. ثقافة E. الخلايا القولونية التعبير عن ADH ( BBa_K398018 ) أو ALDH ( BBa_K398030 ) الجينات والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 50 مل المتوسطة بالمضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
  2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل إلى الكثافة البصرية بنسبة 0.6 في 600 نانومتر.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 4،000 دورة في الدقيقة في C ° 4 و resuspend بيليه في 5 مل من 50 ملي تريس العازلة.
  4. يصوتن الحل الخلية في دورة عمل 40٪ مع عنصر تحكم إخراج 4 (إبقاء الحل على الجليد خلال صوتنة).
  5. أجهزة الطرد المركزي في الخليط الناتج لمدة 5 دقائق في 4،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلية.
  6. لتحديدتل تركيز البروتين في الخلية عن طريق الفحص مقتطفات برادفورد (ملاحظة: استخدام قارورة زجاجية لمنع ملزمة البروتين).
  7. تحميل وحة 96 ميكرولتر جيدا مع 180 57 مم جليكاين العازلة التي تحتوي على NAD (تركيز النهائي 1 ملم، ودرجة الحموضة 9.5) في كل بئر.
  8. إضافة 5 ميكرولتر من الكحول (ألدهيد) لفحصها للآبار. ملاحظة: الكحول الحرارة سلسلة طويلة قبل بدء الفحص أن يكون السائل. وينبغي أن يضاف لكل الكحول (ألدهيد) عنصر تحكم دون الركيزة (المراقبة السلبية). وبالإضافة إلى ذلك، تعد فارغة تحتوي على خليط من العازلة والركيزة دون استخراج الخلايا.
  9. سخن لوحة للقارئ لوحة (ماجلان TECAN V7.0) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للموازنة للنظام.
  10. إضافة كميات كافية من مستخلص الخلية (يعتمد على المقايسات برادفورد، وتركيز النهائي من 5 ملغم بروتين / لتر). إعداد التحكم لم البروتين.
  11. قياس إنتاج NADH باستخدام الطيف في طول موجة من 340 نانومتر كل دقيقة من 2-3 1 ساعة عند 37 ° C.
  12. حساب معدل إنتاج NADH من منحدر OD (340 نانومتر). تأخذ في الاعتبار طول مسار الضوء ومعامل انقراض NADH من 6220 سم -1 M -1. وأضاف تقسيم معدل إنتاج NADH من المبلغ الإجمالي من البروتين للتعبير عن النشاط للتفاعل نازعة في استخراج الخلايا (U / ملغم بروتين خلية كاملة). حساب متوسط ​​والانحراف المعياري من ثلاثة أشواط مستقلة.

6. pCaiF توصيف

  1. ثقافة E. خلايا الإشريكية معربا عن بناء pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) والخلايا التي تحمل المروج وحده ( BBa_K398326 ) بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة المضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
  2. تطعيم 5 مل تحتوي على 10 M9 غرام / لتر الجلوكوز والمضادات الحيوية مع 50 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها وتنمو بين عشية وضحاها.
  3. ثقافة فرعية 50 ميكرولتر من ثمرة بين عشية وضحاها إلى 5 مل من جديد ز with10 M9 / لتر واحتضان حتى وصلت إلى التعكر خلية الكثافة البصرية بنسبة 0.2 في 600 نانومتر.
  4. تحميل وحة 96 أيضا مع 100 ميكرولتر من M9 المتوسطة الطازجة التي تحتوي على المبلغ المطلوب من مصدر الكربون لاختبار في كل بئر. إجراء تجارب لتقييم ثلاث نسخ الإحصائية وإضافة عناصر التحكم الخاصة السلبية (البرية من نوع E. القولونية K12).
  5. إضافة 5 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى الآبار التي تحتوي على المتوسط.
  6. قياس منحنى النمو (OD 600) ومضان GFP (485 نانومتر الإثارة وانبعاث 520) باستخدام قارئ لوحة كل 10 دقيقة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز المستمر.
  7. حساب معدل النمو ومحتوى GFP محددة من القياسات منها وقارن بين عنصر التحكم. حساب متوسط ​​والانحراف المعياري على الأقل ثلاث تجارب مستقلة.

7. التسامح الفحص

  1. ثقافةكولاي التعبير عن الجينات وPhPFDα β ( BBa_K398406 ) بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة LB والمضادات الحيوية المناسبة. E. القولونية التعبير عن الجينات لادا ( BBa_K398017 يستخدم) كما المراقبة السلبية.
  2. ثقافة فرعية 10 ميكرولتر من ثمرة بين عشية وضحاها إلى 5 مل جديدة من LB (مع مضاد حيوي) واحتضان حتى وصلت إلى التعكر خلية الكثافة البصرية من 0،3 حتي 0،4 في 600 نانومتر.
  3. تمييع الثقافات مع الطازجة المتوسطة وحتى يتم التوصل إلى OD 600 من 0.1.
  4. تحميل وحة 96 أيضا مع 180 ميكرولتر المتوسطة M9 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة والتركيز السليم النهائي للمركب سام (مثل 0، 4، 8، 10٪ من N-الهكسان) في ثلاث نسخ. لأن ألكان المياه يمكن أن يؤدي إلى خليط من مرحلتين نظم فمن الضروري أن يكون ضوابط ملائمة على لوحة (على سبيل المثال دifferent سلالات والتجارب ذات الصلة فارغة).
  5. إضافة 20 ميكرولتر من ثقافة (التحكم) في الآبار.
  6. قياس تركيز الكتلة الحيوية (OD 600) باستخدام قارئ لوحة كل 10 دقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز المستمر.
  7. حساب معدلات النمو من القياسات منها عن تركيزات مختلفة كيل وقارن بين سيطرة سلبية. حساب متوسط ​​والانحراف المعياري على الأقل ثلاثة أشواط مستقلة.

8. Homolog التفاعل رسم الخرائط

  1. وقد وضعت تطبيق HIM لتنفيذ استعلامات البروتين في الخادم بوستجرس تشغيل قاعدة البيانات STRING (مجاني للاستخدام الأكاديمي) 20. تعيين تطبيق التفاعل نديد يحدد البروتينات المتفاعلة في الكائن الحي المضيف الأصلي باستخدام قاعدة بيانات STRING. يتم استخدام تسلسل من الجينات المعنية التفاعل في البحث للعثور على الجينات BLAST مثلي في الكائن الحي المستهدف. 4 Cytoscape لتصور نتيجة لرسم الخرائط. يمكن تحميل الأداة البرمجيات HIM في: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. لإجراء رسم الخرائط، (1) دخول ID BioBrick والتطبيق سوف تحميل البيانات تلقائيا تسلسل جزء من قلم الأجزاء البيولوجية المعيارية 9، أو (2) ENTER (لصق) البيانات تسلسل في التطبيق.
  3. استخدام الموقع قاعدة بيانات للبحث عن STRING ID STRING البروتين لتسلسل الأحماض الأمينية التي تم إدخالها.
  4. يتم تحديد البروتين مع تماثل عالية باستخدام الانفجار. بعد ذلك تطبيق تسرد كل بروتين التفاعل معروفة في الحي والبحث عن مصدر homologs في الكائن الحي المضيف (على سبيل المثال كولاي).
  5. تصدير قائمة الناتجة التفاعل المفترضة إلى نص أو Cytoscape.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحويل الألكان

تم تقييم نشاط خطوات الأكسدة الثلاث من الألكان إلى الحمض الدهني المقابل باستخدام مقاييس الخلايا الساكنة وقياسات النشاط الإنزيمي. وتُعرض النتائج وفقاً لتفاعلات المسار: (1) هيدروكسيلاز الألكان، و(2) ديهايدروجيناز الكحول، و(3) ديهايدروجيناز الألدهيد.
بالنسبة للخطوة الأولى، تم بناء بلازميدات مختلفة للألكانات متوسطة وطويلة السلسلة. والبلزميد BBa_K398014 يحتوي على الجينات الأربعة الخاصة بنظام ألكان هيدروكسيليز (AH...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويستخدم مبدأ BioBrick لبناء هيكل للتدهور الألكانات وتم الحصول على دليل على مبدأ واحد للمكونات مجموعة الأدوات. ويقترح عدة فحوصات لقياس في الجسم الحي والنشاط في المختبر من الانزيمات ألكان مسار المهينة. العمل المقدم يوضح بنجاح عددا من الأساليب التي يمكن استخدامها لتحديد الأنشطة انزيم والتعبير في الحي المضيف E. القولونية بعد تنفيذ BioBricks مناسبة. وعلاوة على ذلك، يظهر أن يمكن استخدام مبدأ BioBrick لتصميم كائن حي يعبر عن البروتينات اللازمة لتدهور الألكانات، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد وضعت التجارب التي أجريت في هذه المادة عن طريق الفيديو للمسابقة الدولية آلة المعدلة وراثيا 9. والكتاب أود أن أشكر أعضاء الفريق لوقا iGEM Bergwerff، بيتر فان TM Boheemen، Cnossen Jelmer، هوغو F. روخاس كويتو ورامون فان دير فالك ل المساعدة في البحث. نشكر هان دي Winde، ستيفان دي كوك ويلدرم Esengül للمناقشات مفيدة واستضافة هذا البحث. وأيد هذا العمل من قبل وزارة TU جامعة دلفت للتكنولوجيا الحيوية، والمعلوماتية الحيوية مختبر دلفت، TU دلفت إدارة Bionanoscience، زيت ساندز القيادة مبادرة (OSLI)، studentenuitzendbureau مسمار، هولندا مبادرة الجينوم، مركز Kluyver، Nederlandse Vereniging Biotechnologische (مؤسسة Stichting التكنولوجيا الحيوية هولندا) ، DSM، Geneart، غرينر الحيوي واحدة وGenencor.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بكتيريا E. coli K12New England BiolabsC2523H
أوكتانFluka74822
هكساديكانFluka52209
1-أوكتانولFluka95446
دوديكانول-1Sigma-Aldrich126799
هكسانSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligaseNew England BiolabsM0202L
جهاز كروماتوغرافيا الغاز
جهاز تفتيت الخلاياLA BiosystemsCD-019
مقياس الطيف الضوئيAmersham Pharmaciaspec 2000
قارئ الأطباقشركة .Tecan Group LtdMagellan v7.0
حضّانة إنوفا، 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBجامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسية<أدخل الرابط (a href=)"http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" الهدف="لم يتم تقديم نص للمصدر لترجمته. يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته.">BBa_K398014نظام هيدروكسيلاز الألكان
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسيةBBa_K398027مولد بروتين ladA
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-نازعة هيدروجين الكحول (ADH) جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسيةBBa_K398018مولد ADH
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسية<أو رابط تشعبي (a href=)"http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" الهدف="لم يتم تقديم نص مصدر للترجمة.">BBa_K398030مولد ALDH
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398326: pCaiF جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسية<تؤدي هذه الدراسة إلى تقديم مجموعة أدوات تتيح تحويل الألكانات بواسطة بكتيريا Escherichia coli، وتقدم إثباتاً لمبدأ قابليتها للتطبيق. تتكون مجموعة الأدوات من أجزاء قياسية متعددة قابلة للتبديل (BioBricks) تتناول تحويل الألكانات، وتنظيم التعبير الجيني، والبقاء على قيد الحياة في البيئات السامة الغنية بالهيدروكربونات. وقد تم تنفيذ مسار من ثلاث خطوات لتفكيك الألكانات في بكتيريا E. coli لتمكين تحويل الألكانات متوسطة وطويلة السلسلة إلى الألكنولات، والألكنالات، والأحماض الألكانوية المقابلة لها في نهاية المطاف. وتتم عملية استقلاب الأخيرة عبر مسار أكسدة بيتا (β-oxidation) الأصلي. ولتسهيل أكسدة الألكانات متوسطة السلسلة (C5-C13) والألكانات الحلقية (C5-C8)، تم نقل أربعة جينات (alkB2 وrubA3 وrubA4 وrubB) من نظام هيدروكسيلاز الألكان الخاص بسلالة Gordonia sp. TF68 إلى بكتيريا E. coli. أما بالنسبة لتحويل الألكانات طويلة السلسلة (C15-C36)، فقد تم تنفيذ جين ladA من بكتيريا Geobacillus thermodenitrificans. ولإتمام الخطوات اللاحقة المطلوبة في عملية التفكيك، تم إدخال ADH وALDH (المشتقين من G. thermodenitrificans). وقد تم قياس النشاط باستخدام مقايسات الخلايا الساكنة، حيث لوحظ النشاط الإنزيمي لكل خطوة أكسدة. ولتحسين كفاءة العملية، تم تحفيز التعبير فقط في ظل ظروف انخفاض الجلوكوز: حيث استُخدم محفز منظم بالركيزة، pCaiF. يتواجد pCaiF في بكتيريا E. coli K12 وينظم التعبير عن الجينات المشاركة في تفكيك مصادر الكربون غير الجلوكوزية. أما الجزء الأخير من مجموعة الأدوات -الذي يستهدف البقاء على قيد الحياة- فقد تم تنفيذه باستخدام جينات تحمل المذيبات، PhPFDα وβ، وكلاهما من Pyrococcus horikoshii OT3. يمكن للمذيبات العضوية أن تسبب إجهاداً خلوياً وتقلل من فرص البقاء عن طريق التأثير سلباً على طي البروتين. وبصفتها مرافقات جزيئية (chaperones)، تعمل PhPFDα وβ على تحسين عملية طي البروتين، على سبيل المثال في وجود الألكانات. وقد أدى التعبير عن هذه الجينات إلى تحسين تحمل الهيدروكربونات، وهو ما ظهر من خلال زيادة معدل النمو (حتى 50%) في وجود 10% من n-hexane في الوسط المزرعي. وباختصار، تشير النتائج إلى أن مجموعة الأدوات هذه تمكن بكتيريا E. coli من تحويل الهيدروكربونات وتحملها في البيئات المائية. وبناءً على ذلك، فإنها تمثل خطوة أولية نحو حل مستدام لمعالجة التلوث النفطي باستخدام نهج البيولوجيا التركيبية."http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" الهدف="بما أن النص المصدر فارغ (_blank)، يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته.">BBa_K398326المحفز pCaiF
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التقنية الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسيةBBa_K398331جهاز قياس pCaiF
المقاومة: كلورامفينيكول
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- جامعة دلفت للتكنولوجيا في قسم التكنولوجيا الحيوية أو سجل الأجزاء البيولوجية القياسية<أداة ربط تشعبية (href=)"http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" الهدف ="لم يتم توفير نص للمصدر لترجمته. يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته.">BBa_K398406عنقود تحمل المذيبات
المقاومة: كلورامفينيكول

المراجع

  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Escherichia coli BioBricks
مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.