تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

ملخص

طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف E. القولونية والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

الملخص

السموم البكتيرية ربط الكوليسترول في الأغشية، وتشكيل المسام التي تسمح لتسرب محتويات الخلوية وتدفق المواد من البيئة الخارجية. يمكن استرداد الخلية إما من هذه الإهانة، الأمر الذي يتطلب عمليات إصلاح غشاء بالموقع، وإلا يموت اعتمادا على كمية التعرض للسموم ونوع من الخلايا ^1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه السموم لحث على الاستجابة للالتهابات قوية في المضيفين المصابة من خلال تنشيط خلايا المناعة، بما في ذلك الضامة، والتي تنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات ^2. كثير من البكتيريا إيجابية الجرام تنتج السموم ملزمة الكوليسترول التي ثبت للمساهمة في الفوعة من خلال آليات uncharacterized إلى حد كبير.

التغييرات الشكلية في غشاء البلازما من الخلايا المعرضة لهذه السموم تتضمن تنحية بهم إلى السطح نتوءات الكولسترول عالي التخصيب، والتي يمكن تسليط في الفضاء خارج الخلية مما يدل على أن الدفاع الجوهرية الخلويةآلية ^3،4. هذه العملية تحدث في جميع الخلايا في حالة عدم وجود النشاط الأيضي، ويمكن تصور استخدام EM بعد ⁴ تثبيت الكيميائية. في الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية التي تتوسط الالتهاب ردا على التعرض للسموم، واقترح الحويصلات الغشاء يسببها لاحتواء السيتوكينات من عائلة IL-1 وربما تكون مسؤولة على حد سواء لسفك السم ونشر هذه السيتوكينات الموالية للالتهابات ^5،6،7. A الرابط بين IL-1β الإفراج ونوع معين من موت الخلايا، وقد اقترح تسميته pyroptosis، وكلاهما العمليات كاسباس-1 تعتمد ^8. لفرز تعقيدات هذا الرد البلاعم، والذي يتضمن ربط السم، متراجعا من الحويصلات الغشاء، وإطلاق سراح خلوى، وموت الخلايا يحتمل، وقد وضعنا أساليب التصنيف وطرق الفحص المجهري مضان التي تسمح لتصور الوقت الحقيقي من السم خلايا التفاعلات، بما في ذلك قياسات ضعف والموت (الشكل 1). استخدمالتصوير الخلية الحية ضروري بسبب قيود في تقنيات أخرى. ويمكن للنهج البيوكيميائية يتم تحليل التأثيرات التي تحدث في الخلايا الفردية، في حين أن التدفق الخلوي لا يقدم عالية الجودة، في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لتحليل الحركية من الردود الناجمة عن المنبهات الأخرى التي تنطوي على تغييرات في الخلايا المعقدة المظهري.

البروتوكول

1. تنقية O ستربتوليزين (SLO)

1. تطعيم 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا التي تحتوي على BL21 GOLD-pBADgIII SLOhis البلازميد ⁹ الى 0.5 لتر مرق LB وإضافة 500 ميكرولتر 50 ملغ / مل الأمبيسلين. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة الثقافة في C ° 37 حتى OD ₆₀₀ = 0.6، 1.5 ساعة ~ عادة. أجهزة الطرد المركزي 1 مل البكتيريا (يعتبر T ₀₎ في 10،000 XG 5 دقائق، ويحل بيليه في 140 ميكرولتر 1X العازلة عينة SDS / OD 1 و يصوتن لDNA لتحليل القص نقاء البروتين.
2. حمل البكتيريا مع إضافة 5 ....

النتائج

يمكن عادة 10 ^{7 8} -10 يمكن الحصول عليها U / مل SLO مع تركيز البروتين من 4 ملغ / مل. كمية السم اللازمة لتحلل الخلايا تختلف وفقا لنوع الخلية، ولكن عادة ما يكون 125-500 U / مل SLO (الشكل 2B). يمكن أنواع الخلايا مثل الخلايا البلعمية تكون أكثر مقاومة (4000 U / مل) على الرغم من الآخرين (خطوط الخلايا T خاصة) هي أكثر حساسية. هذه الحساسيات تتوافق مع SLO متاحة تجاريا. النشاط يقلل السم تقريبا 2-أضعاف مع كل ذوبان الجليد للتجمد، وهناك حاجة إلى فحوصات للدم وذلك مع كل .......

المناقشة

وصف تقنيات تسمح هنا النظر في ردود الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. الخطوة الأكثر أهمية هو التعامل مع والجرعات من السم. يمكن أن يكون النشاط السم متغير للغاية، حتى بين مختلف مأخوذة من إعداد نفسه، بسبب هشاشتها. هذا يتطلب اختبار إما كل قسامة من السم ضد مرجع الخلية أو خط أو كرات الدم الحمراء باستخدام التدرجات السم. التدرجات السم، كما ألقى micropipette، والسماح للمجموعة كاملة من الأنشطة التي يسببها السم التي يتعين مراعاتها في الوقت الحقيقي، ولكن لا تصلح لتحليل كيميائي حيوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
ني NTA الاغاروز	QIAGEN	30210
polymixin-الاغاروز	سيجما	P1411-5ML
زيبا Desalt سبين العقيد	الصياد	PI-89891
الأغنام كرات الدم الحمراء	الصياد	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	انظر المرجع 9
Cy5 صبغ monoreactive	GE للرعاية الصحية	PA25001
Fura2-AM	الحياة تكنولوجيز	F1221
Calcein AM / EThidium homodimer	الحياة تكنولوجيز	L3224
مكافحة CD11c-APC	BD العلوم البيولوجية	550261
الكولاجين المغلفة بالزجاج أسفل الطبق	ماتيك	P35GCol-1.5-10-C
فيمتو تلميح II	الصياد	E5242957000
Microloader	الصياد	E5242956003
ديكستران اليكسا 555	الحياة تكنولوجيز	D34679
Injectman NI 2	إيبندورف	920000029
FemtoJet	إيبندورف	5247 000.013
			الجدول 1. قائمة ومصدر الكواشف محددة و equipmحاجة الأنف والحنجرة. يتم سرد معدات معينة والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع الشركة ورقم الكتالوج.
			3،1 العازلة تركيب الخطوة مستعملة ليز / اغسل 50 ملي ناه 2 ص 4 300 مم كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0 1.4 تريس / الملح 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم 1.7 شطف العازلة 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم 250 مم إيميدازول 1.8 RBC الفحص العازلة 0.3٪ BSA 2 مم CaCl 2 10 ملي HEPES، درجة الحموضة 7.4 2.1 العازلة R / B RPMI متوسطة خلية ثقافة 2 مم CaCl 2 0.5٪ BSA
			الجدول 2. قائمة مخازن المستخدمة في هذا البروتوكول. المخازن المؤقتة المستخدمة، يتم سرد تكوينها والخطوة الأولى التي يتم استخدامها في البروتوكول.