مقالة منهجية

سد واجهة الحيوية الالكترونية مع Biofabrication

DOI:

10.3791/4231

⸱

يونيو 6, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland , 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland , 3Department of Materials Science and Engineering, University of Maryland

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة نهج biofabrication: ترسب من المحفزات التي تستجيب السكريات في وجود أقطاب منحازة لخلق افلام حيويا والتي يمكن functionalized مع الخلايا أو البروتينات. نحن يبرهن على وجود استراتيجية مقاعد البدلاء أعلى للجيل من الأفلام، فضلا عن استخداماتها الأساسية لإنشاء السطوح biofunctionalized تفاعلية للالمختبر على واحد في رقاقة التطبيقات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التطورات في تقنية المختبر على رقاقة بإحداث ثورة في كل من البحث والطب من خلال انخفاض التكاليف وحساسية أفضل وقابلية النقل والإنتاجية الأعلى. أظهر دمج المكونات البيولوجية في الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة البيولوجية (bioMEMS) إمكانات كبيرة لتحقيق هذه الأهداف. تسمح الرقائق الإلكترونية الدقيقة بميزات على نطاق ميكرومتر بالإضافة إلى اتصال كهربائي للاستشعار والتشغيل. تمنح المكونات البيولوجية الوظيفية النظام القدرة على الكشف المحدد عن التحليلات والوظائف الأنزيمية وقدرات الخلية الكاملة. تم استخدام عمليات التصنيع الدقيق القياسية وتقنيات التحليل الحيوي بنجاح لعقود في صناعات الكمبيوتر والبيولوجية ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن الجمع بينهما والتفاعل بينهما في بيئة المختبر على رقاقة يطرح تحديات جديدة. هناك دعوة للتقنيات التي يمكنها بناء واجهة بين القطب الكهربائي والمكون البيولوجي الخفيف وسهل التصنيع والنمط.

Biofabrication ، الموصوف هنا ، هو أحد هذه الأساليب التي أظهرت وعدا كبيرا بدمجها السهل في التجميع للمكونات البيولوجية مع تعدد الاستخدامات في الوظائف الموجودة على الرقاقة التي يتم تمكينها. يستخدم التصنيع الحيوي المواد البيولوجية والآليات البيولوجية (التجميع الذاتي ، التجميع الأنزيمي) للتجميع الهرمي من أسفل إلى أعلى. بينما أظهرت مختبراتنا هذه المفاهيم في العديد من التنسيقات 1،2،3 ، نوضح هنا عملية التجميع بناء على الترسيب الكهربائي متبوعا بتطبيقات متعددة للتفاعلات القائمة على الإشارة. تتكون عملية التجميع من الترسيب الكهربائي لأغشية البوليمر المستجيبة للمنبهات المتوافقة حيويا على الأقطاب الكهربائية ووظائفها اللاحقة مع المكونات البيولوجية مثل الحمض النووي أو الإنزيمات أو الخلايا الحية 4،5. يستفيد الترسيب الكهربائي من تدرج الأس الهيدروجيني الذي تم إنشاؤه على سطح قطب كهربائي متحيز من التحليل الكهربائي للماء 6،7 ،. الشيتوزان والألجينات عبارة عن بوليمرات بيولوجية مستجيبة للمنبهات يمكن تشغيلها للتجميع الذاتي في أغشية هيدروجيل استجابة للإشارات الكهربائية المفروضة 8. يتم تحديد سمك هذه الهلاميات المائية من خلال مدى امتداد تدرج الأس الهيدروجيني من القطب. يمكن تعديل ذلك باستخدام كثافات تيار متفاوتة وأوقية الترسيب 6،7. سيصف هذا البروتوكول كيفية ترسيب أغشية الشيتوزان وتشغيلها عن طريق ربط المكونات البيولوجية تساهميا بمجموعات الأمين الأولية الوفيرة الموجودة في الفيلم من خلال الطرق الأنزيمية أو الكهروكيميائية 9،10. كما سيتم تناول أفلام الجينات ومحاصرتها للخلايا الحية 11. أخيرا ، يتم إثبات فائدة التصنيع الحيوي من خلال أمثلة على التفاعل القائم على الإشارات ، بما في ذلك نقل الإشارات من مادة كيميائية إلى كهربائية ، ومن خلية إلى خلية ، وكذلك نقل الإشارات من إنزيم إلى خلية. < p class = "jove_content"> يمكن إجراء كل من الترسيب الكهربائي والوظيفية في ظل ظروف شبه فسيولوجية دون الحاجة إلى الكواشف وبالتالي تجنيب المكونات البيولوجية المتقابلة من الظروف القاسية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام كل من الشيتوزان والألجينات منذ فترة طويلة لأغراض ذات صلة بيولوجيا 12،13. بشكل عام ، يمكن استخدام التصنيع الحيوي ، وهي تقنية سريعة يمكن إجراؤها ببساطة على سطح الطاولة ، لإنشاء أنماط مقياس ميكرون للمكونات البيولوجية الوظيفية على الأقطاب الكهربائية ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من تطبيقات المختبر على الرقاقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجينات الكهربي

  1. توصيل التيار الكهربائي إلى الأقطاب الكهربائية المخصصة ملفقة عن طريق التصحيح بالحبال باستخدام مقاطع التمساح. وأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) غطت شريحة زجاجية سيكون بمثابة القطب الموجب (عامل كهربائي)، ورقائق البلاتين ستكون بمثابة الكاثود (مكافحة الكهربائي). وضع الأقطاب وبالتالي فإن سطح ITO أن functionalized تعارض القطب المضاد ويتم وضع إما عموديا إلى أن تراجع في حل من هذا القبيل أو أفقيا أن يرد حل ترسب على السطح.
  2. يعد حل ترسب الجينات عن طريق خلط الجينات 1٪ و 0.5٪ كربونات الكالسيوم 3 (وزنا) في الماء المقطر ثم جهاز الأوتوكليف الحل. فمن المستحسن أن يحرك باستمرار على حل عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  3. غمر كل من الأقطاب الكهربائية في حل ترسيب. ويمكن أن تستخدم الجينات fluorescently المسمى مع FluoroSpheres (إينفيتروجن)، وفقا لتشنغ وآخرون. 14، للسماح لfluorescenم تصوير الفيلم الناتجة عن ذلك.
  4. تطبيق كثافة ثابت الحالي (3 أ م / 2) لمدة 2 دقيقة، سوف يتحول الجهد في نطاق 2-3 V.
  5. فصل الكهربائي وإزالة حل غير المودعة. شطف بلطف الفيلم مع كلوريد الصوديوم (0.145 م) لإزالة زائدة الجينات.
  6. احتضان لفترة وجيزة فيلم (~ 1 دقيقة) في CaCl 2 (0.1 م) لتعزيز هلام. شطف مع كلوريد الصوديوم (0.145 م) واحتضان في الحل المنشود تستكمل مع CaCl 2 (1 ملم).
  7. صورة باستخدام مجهر مضان (الشكل 1B).

2. Codeposition من السكان الخلايا التواصل في الجيني

  1. ثقافة الخلية إشارة المرسل (W3110 وزن كولاي)، ونمت في وسائل الاعلام LB، وثقافة الخلية إشارة المتلقي (+ MDAI2 pCT6-lsrR - أمبير R + PET-dsRed - كان ص)، ونمت في وسائل الاعلام LB + 50 ميكروغرام / مل من كل من الكانامايسين والأمبيسيلين، لا بد من نشأوا بين عشية وضحاهاالثانية وإعادة تلقيح للنمو إلى الكثافة البصرية (في 600 نانومتر) 1. ضبط الكثافة البصرية للثقافة المتلقي الخلية إلى 0،4-0،6 مع LB قبل الاستخدام.
  2. يعد حل ترسب الجينات 2٪ و 1٪ كربونات الكالسيوم 3، والاختلاط مع كل ثقافة خلية في نسبة 1:1 إلى تركيز النهائي من الجينات 1٪، 0.5٪ كربونات الكالسيوم 3، مع خلايا مخففة لكثافة حوالي نصف في زراعة كثافة.
  3. استخدام شريحة زجاجية منقوشة مع أقطاب ITO الواردين من قبل polydimethylsiloxane (PDMS) جيد (أعدت وفقا لتعليمات Sylgard وقطع إلى الحجم المطلوب)، وقطب كهربائي عداد البلاتين. ربط واحدة ITO الكهربائي لامدادات الطاقة مع البلاتين كما هو موضح في الإجراءات 1 (الكهربي الجيني).
  4. تزج الأقطاب في محلول يحتوي على ترسيب خلايا المتلقي. وضع التيار الكهربائي إلى تيار مستمر في مناطق ذات كثافة من 3 ألف م 2 /، حيث يتم تعريف البعد مساحة السطح بواسطة قطب واحد على أي depositioوسوف تحدث ن.
  5. تطبيق الحالي لمدة 2 دقيقة للسماح للcodeposition من الخلايا في المصفوفة الجينات.
  6. شطف الفيلم كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  7. تبديل اتصال انوديك إلى الثانية، القطب، المتاخمة ITO.
  8. كرر الإجراء ترسيب (خطوات 2،4-2،7)، ولكن هذه المرة إدخال محلول يحتوي على خلايا مرسل.
  9. احتضان شريحة 2-الكهربائي التي تحتوي على خلايا codeposited والكالسيوم الجينات، بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع وسائل الاعلام LB 10٪ و 1 مم CaCl 2.
  10. بعد مرور فترة الحضانة، صورة باستخدام مجهر مضان (الشكل 2B).

3. الشيتوزان الكهربي

  1. توصيل التيار الكهربائي إلى الأقطاب الكهربائية عن طريق مقاطع التمساح. وهناك شرائح السليكون الذهب المطلي بمثابة الكاثود (القطب العمل)، ورقائق البلاتين سيكون بمثابة القطب الموجب (مكافحة الكهربائي). وضع سطح القطب الذهب حتى السابعةفي انها تعارض القطب المضاد ويتم وضع حد سواء عموديا إما أن يغمس في حل من هذا القبيل أو أفقيا أن يرد حل ترسب على السطح.
  2. يعد حل الشيتوزان عن طريق خلط الشيتوزان رقائق في الماء، وإضافة ببطء 2 M حمض الهيدروكلوريك إلى حل السكريات (درجة الحموضة النهائية 5.6)، والتأكد من اتباع الإجراءات التي حددها ماير وآخرون. 15.
  3. وضع أقطاب كهربائية في حل الشيتوزان (0.8٪)، غمر المنطقة بالكامل المطلوب للترسيب. ويمكن للمستعمل الشيتوزان fluorescently المسمى مع 5 - (و-6)، carboxyrhodamine 6G succinimidyl استر (إينفيتروجن)، ولكل وآخرون وو 8، إلى صورة الفيلم electrodeposited بواسطة الفحص المجهري مضان.
  4. تطبيق كثافة ثابت الحالي (4 أ م / 2) لمدة 2 دقيقة. وسوف يتحول الجهد في نطاق 2-3 خامسا حساب الكثافة الحالية بوصفها وظيفة من المساحة الذهب من القطب العمل يتعرضون لdepositioن حل.
  5. شطف القطب بالماء DI لإزالة زائدة الشيتوزان. ويمكن تخزين الشريحة في الماء أو في برنامج تلفزيوني (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.0).
  6. صورة باستخدام مجهر مضان (الشكل 3C).

4. الكهروكيميائية تنبيغ مع فيلم الشيتوزان Functionalized

  1. Codeposit الشيتوزان والجلوكوز أوكسيديز (GOx) من التوصل إلى حل (1٪ الشيتوزان، 680 يو / مل GOx، ودرجة الحموضة 5.6) في مناطق ذات كثافة الحالية من 4 ألف متر / 2 على القطب منقوشة وفقا للإجراءات 3 (الشيتوزان الكهربي). سيتم إنشاء فيلم الشيتوزان شرك في GOx.
  2. نعلق القطب إلى نظام المعالجة لمدة ثلاثة الكهربائي كما القطب العمل، وسلك البلاتين كما القطب المضاد وجي / أجكل مثل الإلكترود المرجعي، كما هو موضح في الشكل رقم 4A.
  3. تزج الأقطاب في الفوسفات حل العازلة (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.0) التي تحتوي على كلوريد الصوديوم (0.1 م).
  4. المتقارن Electrochemically البروتين إلى الشيتوزانفيلم عن طريق تطبيق الجهد المستمر (0.9 فولت) للاستخدام 60S chronoamperometry 10.
  5. وضع رقاقة في العازلة الفوسفات (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.0)، ويغسل لمدة 10 دقائق على شاكر المداري لإزالة أي غير المتفاعل GOx كلوريد الصوديوم وunconjugated.
  6. إلى النظام الكهربائي لمدة ثلاثة اعادة نعلق، كما هو موضح في الخطوة 4.2 وغمر في محلول الجلوكوز 5 مم. باستخدام voltammetry دوري، يجتاح محتمل في اتجاه إيجابي إلى 0.7 خامسا استخدم فيلم السيطرة التي لا تحتوي على أوكسيديز الجلوكوز وعلى سبيل المقارنة لكمية أكسدة ينظر في الاجتياح (الشكل 4B).
  7. إزالة الأقطاب من حل الجلوكوز وشطف مع العازلة الفوسفات (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.0) ثم ضع الأقطاب في كأس 10 مل تحتوي على 8 مل من الفوسفات عازلة (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.0). انحياز شرائح GOx-functionalized إلى 0.6 V لتكون بمثابة القطب العمل (4C الشكل).
  8. إضافة aliquots من الجلوكوز إلى المخزن المؤقت (كل قسامة يزيد تركيز الجلوكوز4 ملم).
  9. إنشاء منحنى قياسي بين التيار حالة مستقرة وتركيز الجلوكوز للفيلم الشيتوزان GOx-functionalized.

5. Functionalization بروتين عن طريق الجمعية الأنزيمية

  1. استخدام شريحة زجاجية منقوشة مع الذهب المجاورة والقطب ITO الواردة في بئر PDMS. انحياز القطب الذهب مع احتمال الكاثودية لelectrodeposit الشيتوزان كما هو موضح سابقا. شطف الفيلم لفترة وجيزة في المياه دي، وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني بواسطة ماصة.
  2. إضافة إلى حل من 3 ميكرومتر الزرقاء fluorescently المسمى "منظمة العفو الدولية-2 سينسيز" 16 (استخدام عدة وسم DyLight) 100 + يو / مل التيروزينات في برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم شطف الفيلم مع برنامج تلفزيوني.
  4. تطبيق محتمل انوديك إلى القطب ITO إلى codeposit حلا ترسب الجينات التي تحتوي على خلايا المتلقي (المعد في خطوات 2،1-2،2). اتبع الخطوات من 2،3-2،6 الداخلي 2 (Codeposition للسكان الخلية في الجينات).
  5. لتوليدالإشارة المرسلة (منظمة العفو الدولية-2) إنزيمي، بعد الشطف هذه الأفلام إضافة إلى حل من 500 الهموسيستين S-adenosyl ميكرومتر (SAH) في برنامج تلفزيوني، على أن تستكمل مع وسائل الاعلام LB 10٪ و1MM CaCl 2. تغطية كهربائية لمنع التبخر من الحل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. وهذا سوف يسمح لجهاز استقبال استجابة الخلية عن طريق توليد بروتين أحمر فلوري (dsRed).
  6. ويمكن تصوير أقطاب المتاخمة مع مضان المجهر من خلال تعديل المرشحات للقبض على مضان الزرقاء من سينسيز AI-2 ومضان أحمر وأعرب من قبل خلايا المتلقي codeposited (الشكل 5B).

6. ممثل النتائج

يمكن أن الإشارات الكهربائية التي فرضت خلق microenvironments محلية (على سبيل المثال، الحقول والتدرجات) بالقرب من سطح القطب وهذه المحفزات يمكن أن تؤدي إلى التجميع الذاتي من السكريات مثل الجينات والشيتوزان على أن تودع كفيلم هيدروجيل على سطح القطب. لأن تيسول له جل التحول يحدث على سطح القطب، وelectroaddressed الفيلم الناتج، مع علم الهندسة في مطابقة نمط القطب (أرقام 1B، 3C). الأفلام حيويا مثل الجينات والشيتوزان توفير الأسطح التي يمكن functionalized مع المكونات البيولوجية. باستخدام الجينات، وقد تم codeposited السكان خلية فريدة من نوعها في مكانين منفصلين. وقد لوحظ دليل على electroaddressment سفرهم لدى والتفاعل بين المرسل والمستقبل سكان الخلية. يؤخذ على جزيء autoinducer-2 (AI-2) ينشر من الخلايا المرسل وحتى من قبل خلايا المتلقي، مما أدى إلى التعبير عن بروتين فلوري dsRed أحمر (الشكل 2A). 2B في الشكل، لوحظ مضان أحمر فقط في القطب حيث يتم تناول الاستقبال.

المجموعات أمين موجودة على الشيتوزان تزويدها استجابة درجة الحموضة المطلوبة لالكهربي، فضلا عن سطح مناسب لfunctionalization. نحنيستعمل هذا النوع من خصائص فريدة من نوعها من قبل التصريف electrochemically الجلوكوز انزيم biosensing أوكسيديز (GOx) لelectrodeposited الشيتوزان الأفلام. هذا الانزيم ثم يقدم القدرة للكشف عن الجلوكوز من خلال رد فعل الأنزيمي (الشكل 4A) إنتاج بيروكسيد الهيدروجين الذي يمكن بعد ذلك تتأكسد electrochemically لإنتاج الانتاج الحالي. في هذه الطريقة، يمكن إشارة كيميائية transduced إلى الشكل الكهربائية. 4B يدل على أن الأفلام التي GOx كان مترافق electrochemically إنتاج إشارة قوية انوديك في وجود الجلوكوز في مقابل تلك الأفلام التي لا تحتوي على GOx. وتدل هذه النتائج يمكن تجميعها GOx على فيلم الشيتوزان المودعة وستحتفظ نشاط الحفاز. وعلاوة على ذلك، الشكل 4C يظهر خطوة زيادة في انوديك الحالية التي تنتج في استجابة لزيادة تركيزات الجلوكوز. المنحنى القياسي الحالي أيضا في 4C الشكل يدل على ان الزيادات خطوة شرع في فاس خطي قربوأضاف هيون تعتمد على كمية من السكر. هذه النتائج تدل على أن يحتفظ أيضا انزيم حساسيتها لزيادة تركيز الجلوكوز على اقتران لفيلم الشيتوزان. ولم يكن درس الحد الأدنى للكشف هنا كما سبق أن تتميز في السابق لهذا النظام في عمل وآخرون ماير. آل.

نحن أيضا أثبتت تجميد التساهمية من انزيم من الفائدة، والمهندسة لاحتواء عرف خماسي التيروزين العلامة، إلى الشيتوزان بطريقة إنزيمي التي تسيطر عليها. على وجه التحديد، وتتوسط هذه العملية من خلال التيروزينات الانزيم. كما هو مبين في مخطط 5A في الشكل (العلوي)، انزيم، AI-2 سينسيز يتضمن علامة خماسي التيروزين. التيروزينات يعمل على البطاقة التيروزين، المؤكسدة المجموعات بقايا "الفينول إلى O-كينونات، التي ثم ربط تساهمي إلى الأمينات الشيتوزان ل. وقد لوحظ دليل على functionalization فيلم الشيتوزان مع منظمة العفو الدولية سينسيز-2 من قبل الجمعية التيروزينات في الشكل 5B (الشكل 5A (أدنى)). مضان أحمر من خلايا المتلقي (الشكل 5B) يوضح مرة أخرى التفاعل بين عناوين بسبب نشر منظمة العفو الدولية-2 من واحدة إلى أخرى، ويشير كذلك إلى أن الإنزيمات ثبتوا على الشيتوزان الاحتفاظ النشاط مرة واحدة ملزمة تساهمي.

figure-protocol-1
الشكل 1. الكهربي الجيني. (أ) آلية من الجينات الكهربي: وكما هو منحاز anodically إلكترود، التحليل الكهربائي للماء يحدث في سطحه، وتوليد درجة الحموضة المحلية منخفضة. جزيئات من كربونات الكالسيوم تتفاعل مع فائضمن البروتونات، والإفراج عن كاتيونات الكالسيوم كما جزيئات تذوب. في ظل وجود سلاسل البوليمر الجينات، تصبح بالكلاب الأيونات في شبكة "eggbox"، وتشكيل هيدروجيل crosslinked في القطب. والمسافة من الزيادات الكهربائي، الجينات لديها ميل أكبر للبقاء في حل بسبب وجود انخفاض أيونات الكالسيوم. (ب) واستخدم على شكل حرف L القطب ITO منقوشة على الجينات electrodeposit. وكذلك تم إصلاح PDMS إلى القطب تحتوي على الجينات الخضراء fluorescently المسمى (1٪) وكربونات الكالسيوم 3 (0.5٪) محلول ترسيب. بعد electrodepositing لمدة 2 دقيقة. في الكثافة الحالية من 3A / م 2، تم تصويرها في هيدروجيل الجينات electroaddressed بواسطة الفحص المجهري مضان.

figure-protocol-2
الشكل 2. Codeposition للسكان الخلية. (أ) التفاعل بين اثنين من مخطط يبين E. سلالات القولونية: واحد سكان تنتج autoinducer-2 (منظمة العفو الدولية-2)، وهو جزيء إشارة، ويطلق عليه "منظمة العفو الدولية-2 المرسل". السكان الأخرى، ويطلق عليه "منظمة العفو الدولية-2 المتلقي،" هو مراسل صحفي من منظمة العفو الدولية-2، عند تلقي منظمة العفو الدولية-2 عن طريق الانتشار من المرسل، فإنه يعبر عن بروتين أحمر فلوري dsRed. (ب) codeposited الأحمر صورة مضان من الزوج الكهربائي مع السكان لمنظمة العفو الدولية-2 المرسل مع الجينات في القطب اليسار ومنظمة العفو الدولية-2 سكان المتلقي codeposited مع الجينات في القطب حق. رأي تضخيم يدل على التعبير dsRed من أجهزة الاستقبال فقط AI-2.

figure-protocol-3
الشكل 3. الشيتوزان الكهربي. (أ) خطة تبين الكهربي التي تعتمد على درجة الحموضة من الشيتوزان. التحليل الكهربائي للماء في القطب منحازة cathodically يسبب الحموضة محلية عالية (كما هو موضح من قبل تغيير لون المترجمة من درجة الحموضة صبغ مؤشر بالقرب من القطب السالب في صورة مجهرية) الذي يحفز انتقال سول جل من الشيتوزان في هذه المنطقة. (ب) والأمينات على تقديم منح الشيتوزان أناتي الحموضة التي تستجيب للخصائص. أعلاه الرقم الهيدروجيني من 6.3 (الباكاف الحمضية من الشيتوزان) وdeprotonated والأمينات، وتسهيل الانتقال من شكله القابل للذوبان البروتونية إلى شكله هلام غير قابلة للذوبان. (C) واستخدمت القطب الذهب منقوشة على الشيتوزان electrodeposit. ومغمورة القطب، متصلا cathodically إلى إمدادات الطاقة، وإلى الأخضر fluorescently المسمى الشيتوزان (0.8٪) محلول ترسيب. بعد electrodepositing لمدة 2 دقيقة. في الكثافة الحالية من 4 ألف متر / 2، تم تصوير الفيلم الشيتوزان electroaddressed بواسطة الفحص المجهري مضان.

figure-protocol-4
الرقم تنبيغ الكهروكيميائية 4. مع فيلم الشيتوزان functionalized. (أ) تخطيطي يظهر مجموعة المتابعة لنظام القطب الثلاثة. Functionalized الشيتوزان الفيلم بمثابة القطب العمل، وسلك البلاتين كما القطب المضاد وجي / أجكل مثل الإلكترود المرجعي. الكهروكيميائية تنبيغ العائدات الجلوكوز من خلال اله التفاعلات الأنزيمية والكهروكيميائية أظهرت حيث يمكن المؤكسدة تنتج بيروكسيد الهيدروجين، والكشف في القطب العمل. (ب) دوري voltammagram (السيرة الذاتية) في القطب مع فيلم الشيتوزان تحتوي على مترافق electrochemically أوكسيديز الجلوكوز (GOx) يظهر إشارة قوية انوديك في محلول جلوكوز 5 ملم. عمل فيلم لا تحتوي على GOx كعنصر تحكم وعرض أي إشارة في نفس الحل. (ج) منحنى القياسية الحالية بين انوديك وتركيز الجلوكوز يعرض علاقة قرب الخطية (كل قسامة زيادة تركيز الجلوكوز بنسبة 4 ملم وكذلك زيادة السعة الحالية في الرسم البياني أقحم على نحو تدريجي).

figure-protocol-5
الشكل 5. functionalization البروتين باستخدام الجمعية الأنزيمية. (A، العلوي) خطة تبين التيروزين، الموسومة "AI-2 سينسيز" يجري المربوطة تساهمي إلى فيلم من قبل الجمعية الشيتوزان التيروزينات. بقايا التيروسين أصبح OXIDأوتوماتيكية إلى O-كينونات بواسطة عمل التيروزينات، وربما تتفاعل مع مجموعات أمين على الفيلم الشيتوزان، وتشكيل الرابطة التساهمية. (A، أقل) ومنظمة العفو الدولية سينسيز-2-2 يولد لمنظمة العفو الدولية من ركيزة (SAH)، وخلايا المتلقي تقرير منظمة العفو الدولية ولدت-2 بواسطة التعبير مضان dsRed. (ب) وصور الإسفار عرض فيلم الشيتوزان على الذهب، functionalized مع سينسيز AI-2 الأزرق المسمى. مجاور، ومنظمة العفو الدولية codeposited-2 خلايا المتلقي مع الجينات في منظمة التجارة الدولية. بعد إضافة الركيزة الأنزيمية إلى البئر، وحضانة، والتعبير عن dsRed خلايا المتلقي AI-2.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجراءاتنا إثبات الكهربي وfunctionalization من الأفلام البوليمر الحيوي، وهي عملية نحن مصطلح biofabrication. من خلال functionalization مع الخلايا والجزيئات الحيوية نخلق السطوح بيولوجي قادر على التفاعل مع بعضهم البعض وعنوان القطب يتم تجميعها عليها. الخطوة الأولى، الكهربي، تتم من خلال الجمعية المصير أثار من الجينات، والبوليمرات الحيوية الشيتوزان في دراساتنا، واستجابة لإشارة كهربائية. كما ذكر في وقت سابق يتم إنشاء معامل الحموضة والتي يمكن التحكم بها كثافة والوقت الحالي ترسيب، وتوفير رقابة إضافية على أبعاد الفيلم وخصائص 6،17. لقد وجدنا أنه يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الكثافة الحالية ومجموعات وقت ترسب الأقطاب هو مبين في الجدول رقم 1. في حين أن استخدام الأقطاب الكهربائية الأخرى غير مجدية، والتعديلات التي أدخلت على إجراء يكون ضروريا. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات لتشكيل الفيلم عملية electrodeposiنشوئها هو بسيط وسريع وreagentless. ليست هناك حاجة للحصول على ذخيرة واسعة من معدات باهظة الثمن والتحضير شاقة. الأهم من ذلك، يمكن لعملية الصمود الانحرافات تجريبية طفيفة ويمكن أن تبدأ بسهولة أكثر في حالة حدوث مشكلة.

الشيتوزان غير قادرة على الاستجابة لتدرج درجة الحموضة الكاثودية واسعا نظرا لخصائص وظيفية مهمة الممنوحة لها من قبل على نسبة عالية من الأمينات الأولية. عند درجة الحموضة العالية (أكبر من الباكاف الحمضية لها من ~ 6.3) وdeprotonated والأمينات، ويصبح غير قابل للذوبان الشيتوزان، والسماح لتشكيل الفيلم. بعد الترسيب، وهذه الأفلام لا تزال تعلق على قطب كهربائي. ومع ذلك، فإن القدرة موجودة لdelaminate لهم اذا شئت. وهذه الأفلام لا تزال مستقرة طالما أن الرقم الهيدروجيني من الحل لا ينخفض ​​إلى أقل من الباكاف الحمضية. المحاليل الحمضية protonate والأمينات والنفور لاحق كهرباء تضخم الجل حتى يذوب 18. هذا هو، وعملية التجميع / التفكيك هو عكسها على الطلب وألووفاء سلطان لإزالة الأفلام أودعت وإعادة استخدامها من الأقطاب الكهربائية. ملائم، في نطاق درجة الحموضة في المرحلة الانتقالية التي سول جل تجري على مقربة من تلك التي في معظم المكونات البيولوجية تعمل على النحو الأمثل. هذا يجعل عملية مثالية للإبقاء على وظيفة خلال الجمعية 6.

ومما يسهل تشكيل الجينات فيلم بواسطة التحليل الكهربائي انوديك من المياه، فضلا عن وجود كربونات الكالسيوم 7. درجة الحموضة المترجمة منخفض عند المصعد solubilizes على كربونات الكالسيوم مما يؤدي إلى إطلاق الكاتيونات الكالسيوم. وبالكلاب هذه الأيونات بواسطة الجينات، وتشكيل شبكة crosslinked على سطح القطب. الأفلام الجينات هي انعكاس لا سيما من خلال التنافس على أيونات الكالسيوم من مركبات مخلبية الأخرى مثل سيترات أو EDTA، والتي يمكن استخدامها في حل هذه الأفلام، والسماح لإعادة استخدام الأقطاب الكهربائية الأساسية. وهكذا، والأفلام الجينات هشة نسبيا عندما تعرضوا لظروف فسيولوجية لأن أيونات الكالسيوم ليالي بسهولةcavenged من المصفوفة هلام، وإضعاف بنيتها وتعزيز فيلم التبطين أو redissolution. للتغلب على هذا القيد، أدرجنا خطوة حضانة للفيلم في CaCl M 1 2 لتعزيز هلام. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن أن تستكمل حل الفيلم حضانة (وسائل الاعلام الخلية، وغيرها) مع CaCl 2 في تركيز مم ميكرومتر، 500 3.

الإجراء الرئيسي الثاني هو functionalization من الفيلم المودعة لدى المكونات البيولوجية ذات الصلة. ويمكن تحقيق ذلك بطريقتين، الأولى اقتران الكهروكيميائية يجري، ووضع استراتيجية تسمح للجمعية، سريع reagentless من البروتينات مع سيطرة المكاني استثنائية 10. ومع ذلك، يقتصر functionalization في هذه الطريقة من قبل نشر كلور - الأيونات من خلال الفيلم إلى القطب، وكذلك نشر HOCL، فإن رد الفعل المتولدة وسيطة، والعودة بها الى حل. قدرة الجزيئات النشطة electrochemically لتمريرمن خلال هذا الفيلم يتيح للتنبيغ الكيميائية والبيولوجية في إشارات سهلة لقراءة الإشارات الكهربائية 15. لقد أظهرنا التيروزينات بوساطة اقتران كاستراتيجية الثاني لfunctionalization انزيم إلى الشيتوزان، أظهرت عن طريق ربط تساهمي AI-2 سينسيز. هذه الاستراتيجية تسمح للعملية functionalization أن يكون للرقابة وانتقائية - يعتمد على كاشف محددة، التيروزينات، والذي يعمل ينطوي على تمييز على البروتينات التي تحتوي على علامة التيروزين 9.

نعرض فائدة وتوافق مع الحياة المتعددة عنوان نظم من قبل تكرار المسارات الطبيعية على رقاقة. نظمت أول نحن سكان الخلية 2 (أي "المرسلين" و "استقبال") في عناوين مختلفة، وتبين أنها تفاعلت عبر الأقطاب الكهربائية المجاورة لتقديم AI-2 و توليد استجابة مضان. كما تم هذا المفهوم الذي أبدته تشينغ وآخرون. في 14 رقاقة ميكروفلويديك. نحن تحاكي أيضا التفاعل، ولكنها تستخدم بدلا من ذلكانزيم لتجميع AI-2 للتسليم. بهذه الطريقة، وتكرر طريقا الاصطناعية داخل الخلايا، لمنظمة العفو الدولية-2 التوليف، من خلال biofabrication وتعمل بقدر ما تفعل في حل.

في كلتا الحالتين، والتجمع من عناوين متعددة ويقدم التحدي لتجنب غير محددة ملزمة بين عناوين لأنه يجب أن يتم إدخال كل حل ترسب إلى مجموعة قطب كهربائي كامل، حتى ولو كان المقصود فقط الكهربي في عنوان واحد. ويمكن غسل لطيف حتى الآن شامل إزالة معظم المتبقي من حل غير متحيز الأقطاب الكهربائية، واستخدام تدفق في قنوات ميكروفلويديك قد تقليل مزيد من عدم الدقة. لا سيما بالنسبة للbiofabrication المجاورة الشيتوزان وعناوين الجينات، ونحن نوصي إيداع فيلم الشيتوزان الأولى، بعد هذه الخطوات مع biofunctionalization، وبعد هذا، electrodepositing الجينات. على الرغم من أننا لم نفعل ذلك هنا، وجدنا أن منع فيلم الشيتوزان مع البروتينات خامل (مثل ملك، جيش صرب البوسنة، وغيرها) يقلل إلى حد كبير غير محددة وملزمة من الجزيئات غير المرغوب فيها إلى سطح الشيتوزان لaminated.

لقد وجدنا فائدة في إنشاء أقطاب منقوشة، غالبا ما توجد في أجهزة bioMEMS، بأنها "مخططات" لترتيب معقد من الخلايا والجزيئات الحيوية. electrodeposited استخدامات الشيتوزان في الأجهزة bioMEMS يمكن أن تذهب إلى أبعد من الأمثلة المذكورة هنا 19. يمكن أن تودع الشيتوزان في هندستها الميكروسكيل المختلفة - مثل في microchannels، وعلى غير المستوية الأسطح 20،15. ويمكن أيضا أن هذه الأفلام يمكن تعديلها مع البوليمرات الأخرى ومجموعة متنوعة من البروتينات والحمض النووي، وجزيئات، والجزيئات النشطة الأكسدة لخصائص رواية 21،22،23. في أجهزة bioMEMS، وقد استخدمت الأفلام الشيتوزان لتسليم المخدرات، الأكسدة والصغيرة اكتشاف جزيء، biocatalysis، ودراسات الخلية 20،23،24،25. وبالمثل، يستخدم على نطاق واسع الجينات في شكل مصفوفة الخلايا وفخ قد تم استكشافه لاحتواء fluidic عكسها منالسكان في الخلية والأفلام immunoanalysis 26،27،28. وقد تم تلفيق الأفلام مركب للتطبيقات هندسة الأنسجة باستخدام الكهربي الجينات، التي تحتوي على مكونات مثل مع هيدروكسيباتيت لعملية زرع العظام 29.

في مظاهرات لدينا من biofabrication، لقد أظهرنا كل من التفاعلات بين المكونات البيولوجية وعبر واجهة الحيوي الالكترونية لتكون قابلة للتطبيق على حد سواء، وهذا يجلب إلى التوصل إلى احتمال دمج جميع أنواع التفاعلات لأداء متطور في إرسال الإشارات على الرقاقة. وفقا لذلك، قد biofabrication تسهيل تصنيع الأجهزة مع انخفاض "أحجام ميزة الحد الأدنى" وذلك مباشرة متابعة للتطورات المتسارعة في microfabrication، وغالبا ما بدافع من الالكترونيات الاستهلاكية. وهذا هو، ربما القادم الجيل القادم من الأجهزة في الواقع تشمل المكونات البيولوجية عطوب التي تقدم الجمعية الطبيعة الرائعة وقدرات التعرف على هيئة السلع التموينية طول أصغرليه من صنع الإنسان النظم. نحن نتصور المدى القريب التطبيقات في الأجهزة التحليلية، وأجهزة الاستشعار البيئية، والأجهزة التي تزرع في الجسم حتى حيويا.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل وزير الدفاع وكالة الولايات المتحدة للحد من الخطر.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف تمويلا من اثناء اجتماع السلطة للحصول على الدعم من هذه المخطوطة من وONR، اثناء اجتماع السلطة، وجبهة الخلاص الوطني للحصول على دعم جزئي من البحوث الأساسية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم العنصر شركة فهرس العدد
امدادات الطاقة شنيعة SourceMeter 2400
ثلاثة القطب potentiostat CH الآلات Potentiostat / Galvanostat 600D
RE-5B الإلكترود المرجعي جي / أجكل مع موصل مرن باسي MF-2052
رقاقة السيليكون الذهب المطلي، 500um سي، 12nM الكروم، 120nM الاتحاد الافريقي، شافي 2 للعزل العرف ملفقة
الإنديوم أكسيد القصدير شريحة الزجاج المطلي، مستطيلة الشكل، 8-12 أوم مقاومة سيغما الدريخ 578274
ورقة البلاتين / احباط (0.002 في) Chemetals Surepure 1897
ضئيلة الخط كليب 2 التمساح " راديو شاك 270-346
متعددة التراص الموز التصحيح الحبل التوصيل TSElectronic B-36-02
B-24-02
SYLGARD الاستومر سيليكون 184 طقم داو كورنينج NC9020938
من فيشر
Fluorescecence stereomicroscope أوليمبوس MVX10 MacroView
cellSens قياسي أوليمبوس الإصدار 1.3

الجدول رقم 1. الكهربي ومعدات التصوير مضان.

اسم كاشف شركة فهرس العدد
الشيتوزان، الوزن الجزيئي المتوسط سيغما الدريخ 448877
حمض الهيدروكلوريك، ARISTAR. ACS، NF، لجنة الاتصالات الفدرالية الصف VWR BDH3030
هيدروكسيد الصوديوم، والحل. 10.00N VWR VW3247
الألجنيك حامض، ملح الصوديوم سيغما الدريخ 180947
معجل Multifex-MM
كربونات الكالسيوم، والجسيمات 70nm 		التخصص
شركة معادن 		100-3630-3

الجدول 2. الشيتوزان والكواشف حل الجينات.

اسم كاشف شركة فهرس العدد
كلوريد الكالسيوم، وثنائي الهيدرات JT بيكر 0504
كلوريد الصوديوم، ومصدق
بلوري ACS 		فيشر
علمي 		S271
أحادى فوسفات البوتاسيوم، اللامائية سيغما الدريخ P9791
بوتاسيوم ثنائي القاعدة فوسفات، اللامائية سيغما الدريخ P3786
التخزين المؤقت فوسفات المالحة سيغما
الدريتش 		P4417

الجدول 3. مكونات الحل الآخر والكواشف العازلة.

اسم كاشف شركة / المصدر فهرس العدد
أوكسيديز الجلوكوز من النيجر الرشاشيات سيغما الدريخ G2133
التيروزينات من فطر سيغما الدريخ T3824
LB مرق، ميلر (حبيبات) فيشر العلمية BP9723-2
"AI2-سينسيز" (HGLPT) مختبر مخزون 16
W3110 الخلايا wildtype مختبر مخزون 30
MDAI2 + pCT6-lsrR - أمبير R + PET- dsRed - كان الخلايا ص مختبر مخزون 30
FluoroSpheres: 1μm قطر، EX / إم: 505/515 إينفيتروجن F8765
5 - (و-6)، carboxyrhodamine 6G succinimidyl استر، EX / إم: 525/560 إينفيتروجن C-6157
DyLight الضد وضع العلامات عدة، 405 الحرارية العلمية PI-53020

الجدول 4. الإنزيمات والخلايا، والكواشف functionalization الأخرى.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
  2. Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
  3. Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
  4. Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
  5. Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
  6. Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
  7. Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
  8. Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
  9. Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
  10. Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
  11. Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
  12. de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
  13. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
  14. Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
  15. Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
  16. Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
  17. Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
  18. Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
  19. Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  20. Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
  21. Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
  22. Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
  23. Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
  24. Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
  25. Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
  26. Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
  27. Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
  28. Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
  29. Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
  30. Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BiofabricationElectrodepositionChitosan FilmsAlginate FilmsLab on a ChipBioMEMSFluorescence MicroscopyElectrochemical DetectionSignal TransmissionBiological Components

مقالات ذات صلة