يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المحببات التي تعتمد على الأجسام المضادة عنيفا الجلد الناجم عن

10.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4250

⸱

أكتوبر 12, 2012

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Freiburg , 2Kepler High School Freiburg, 3Centre for Biological Signalling Studies (BIOSS), University of Freiburg

في هذه المقالة

ملخص

في نموذج حيواني وصفها في عملنا الحالي، وتنقية الأجسام المضادة IgG ضد تمتد من 200 الأحماض الأمينية (أ أ 757-967) من السابع الكولاجين يتم حقن الفئران مرارا إلى إعادة إنتاج النمط الظاهري عنيفا وكذلك histo والسمات المميزة لimmunopathological الإنسان انحلال البشرة الفقاعي المكتسب (EBA) 1.

الملخص

الظواهر المناعة الذاتية تحدث في الأفراد الأصحاء، ولكن عندما يفشل التسامح الذاتي، استجابة المناعة الذاتية قد يؤدي إلى أمراض محددة. وفقا لفي Witebsky المسلمات، واحدة من المعايير في تشخيص مرض المناعة الذاتية كما هو استنساخ هذا المرض في حيوانات التجارب عن طريق نقل الأجسام المضادة من السلبي. لانحلال البشرة الفقاعي المكتسب (EBA)، وهو الجهاز prototypic محددة من أمراض المناعة الذاتية الأغشية المخاطية والجلد، وأنشئت مؤخرا نماذج تجريبية عدة. في نموذج حيواني وصفها في عملنا الحالي، وتنقية الأجسام المضادة IgG ضد تمتد من 200 الأحماض الأمينية (أ أ 757-967) من السابع الكولاجين يتم حقن الفئران مرارا إلى إعادة إنتاج النمط الظاهري عنيفا وكذلك histo والسمات المميزة لimmunopathological الإنسان EBA 1. وينظر عادة كاملة المرض على نطاق واسع 5-6 أيام بعد الحقن الأول ومدى انتشار المرض يرتبط مع جرعة من ج تدارVII-ollagen محددة مفتش. وتلف الأنسجة (تشكيل نفطة) في EBA التجريبية واعتمادا على تجنيد وتنشيط الأجسام المضادة من قبل المحببة محدد الأنسجة 2، -4. لذلك، هذا النموذج يسمح للتشريح لمسار محببة التهابات التي تعتمد على المشاركة في تلف الأنسجة الذاتية، باعتباره نموذجا يستنسخ فقط T-خلية مستقلة المرحلة من استجابة المناعة الذاتية صادر. علاوة على ذلك، أكد قيمته من قبل عدد من الدراسات التي تدلل على إمكانية نفطة الذي يحفز الأجسام المضادة في الجسم الحي من والتحقيق في آلية تشكيل نفطة في EBA 1،3، -6. وأخيرا، فإن هذا النموذج يسهل إلى حد كبير في تطوير علاجات جديدة مضادة للالتهابات التي يسببها الأجسام المضادة في أمراض. وعموما، فإن الحيوانات السلبي نقل نموذج EBA هو نموذج يمكن الوصول إليها المرض ومفيدة وسوف تساعد الباحثين على تحليل ليس فقط EBA المرضية ولكن للرد على بيولوجيا الأساسية والسريريةالأسئلة الأساسية المناعة الذاتية.

البروتوكول

1. إعداد الأجسام المضادة الإمراض

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ تنقية وتركيز الأجسام المضادة في نفس اليوم، والأجسام المضادة ليست ليتم تخزينها في 0.1 درجة الحموضة جليكاين M 2،5-3 (شطف العازلة) بين ليلة (ON).

تنقية تقارب من مفتش الحكومة: استخدام 25 مل من مصل الأرنب المناعي:

  1. ذوبان الجليد في مصل الأرنب ON في 4 درجات مئوية، ومزجها 1:1 مع 1xPBS (تشغيل المخزن المؤقت) وأجهزة الطرد المركزي في 1260 XG ذلك لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 20 º اختياريا، يمكن إدراج خطوة الترشيح مع ورق الترشيح بعد الطرد المركزي في حالة المصل هو الدهنية.
  2. وفي الوقت نفسه، يغسل البروتين G مصفوفة ملء عمود السرير مع وحدات التخزين 10 (حجم السرير حجم المصفوفة =) من 1XPBS (تشغيل المخزن المؤقت).
  3. تطبيق المخفف وتصفية المصل إلى العمود واحتضان 1 ساعة على منصة متحركة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. جمع التدفق من خلال (FT) في أنبوب 50 مل القنينة. لا تخلص منه حتى تركيزوكما هو معروف من عيار مفتش المنقى.
  5. غسل المصفوفة مع وحدات التخزين السرير 5 من 1XPBS وفي هذه الأثناء إعداد 50 مل أنابيب الصقر لجمع الكسر مفتش مزال. ماصة 1 مل العازلة الرقم الهيدروجيني تحييد: 1 M TRIS الرقم الهيدروجيني 10 في كل أنبوب (وإلا نسبة العازلة TRIS 1:20 النسبية لكمية شطافة التي يتعين جمعها).
  6. تطبيق 100-150 مل العازلة شطف: 0.1 M الرقم الهيدروجيني 2،5-3 جليكاين إلى العمود وجمع 50 مل جزء (ق). الوجه الأنبوب 2-3X، وقياس درجة الحموضة وإضافة العازلة تحييد حتى كنت قد وصلت إلى درجة الحموضة 7،2-7،4.
  7. جمع قطرات قليلة من شطافة مفتش واستخدام شطف العازلة كما ETALON قياس OD في 280 نانومتر. إذا كان OD هو <جمع توقف 0.1.
  8. تجديد المصفوفة G بروتين وتخزينه باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

تركيز من الترشيح الفائق مع أنابيب Amicon:

  1. غسل الترا Amicon (15 مل / 30KDa) أنابيب الترشيح الفائق مع 1XPBS بواسطة الطرد المركزي 15-20 دقيقةفي 3220 XG في C. ° 4 تجاهل FT من Amicon.
  2. ملء Amicons مع 15 مل من جزء مفتش مزال وأجهزة الطرد المركزي لمدة 25-30 دقيقة في XG 3220 و 4 ° C؛ الوقت الطرد المركزي يعتمد دائما على البروتين المتواجد في شطافة.
  3. FT تجاهل وتكرار الترشيح الفائق حتى لديك أي جزء مزال اليسار.
  4. غسل مفتش المركزة على نطاق واسع، مرتين، مع الحد الأدنى من 25-30 1XPBS الطرد المركزي.
  5. جمع "لزجة"، الحل الأجسام المضادة مصفر من تصفية Amicon في الحجم النهائي من 1،500-2،000 ميكرولتر من 1XPBS.
  6. تركيز قدر من إعداد مفتش باستخدام الطيف أو NanoDrop:
    اضرب. (ملغ / مل) = A (280 نانومتر) × عامل تخفيف / 1،4
  7. غسل وتخزين Amicons باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

2. حقن الكولاجين من السابع محددة مفتش في الفئران

قبل البدء في إجراء التجارب الفعلية، تأكد من أن برو التجريبيةهو مكتوب tocol ونحن على استعداد لجميع المواد التجربة.

  1. إعداد ورقة البيانات للسجل المرض، ELISAs، المناعي (IF) وتحليل الميلوبيروكسيداز (MPO) فحص 4.
  2. تسمية أنابيب للدم والأعضاء، وكذلك cryomolds الأنسجة تجهيز الأشرطة وتضمينها.
  3. وينبغي إعداد الحلول الأجسام المضادة طازجة أو إذابة من الأسهم وتتميز فيما يتعلق نشاطها (عيار بواسطة / IF والمجهري أو ELISA). يجب تخفيفه والعقيمة الحل الأجسام المضادة التي تمت تصفيتها في PBS بطريقة الجرعة المطلوبة للحقن يتراوح بين 250-1000 ميكرولتر. تأكد من أن لديك ما يكفي من مفتش الحكومة لتنفيذ التجربة بأكملها.
  4. إعداد جديدة للتخثر: الهيبارين 20 سنة FIFA / مل و 8.7 ملغ / مل الكيتامين / 1.3 خليط زيلازين ملغ / مل للتخدير. عندما التضحية الفئران وصفت أنابيب مع الفورمالديهايد 3.7٪ إعدادها.
  5. تعقيم الأدوات الجراحية (مشرط، مقص، ونقطة والمنحنيات الجميلةforcipes ED) وإعداد الحقن (الحقن الأنسولين، 1 مل والمحاقن 2)، والإبر، وكاميرا رقمية بطاقة الذاكرة الإضافية و.

ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات مخدر الكيتامين على الفئران / زيلازين أو isoflurane Isoflurane هو الخيار المفضل لتخدير الجلد الشيكات اليومي، حيث الفئران يتعافى سريعا. ومع ذلك، يتم حقن عادة عند التقاط الصور، 87 الكيتامين ملغ / كغ و 13 زيلازين ملغ / كغ تحت الجلد. القتل الرحيم ليتم زيادة الجرعة الكيتامين / زيلازين لالكيتامين ملغ / 130 كيلوجرام و 20 زيلازين ملغم / كغم.

  1. تحقق من الحيوانات تميزت بالفعل للبشرة في مجال الصحة العامة، وظهور حالة الفراء، وقياس وزن لهم سمك على الأذن (عصا دائما إلى الأذن نفسها).
  2. تسجيل القيم المرصودة والتغيرات في ورقة التقييم السريري.
  3. جمع 20-30 ميكرولتر (2-3 نقطة) الدم من الوريد ذيل حقنة تحتوي على في نفس الحجم من تخثر.
  4. تطهير الفراء والجلد باستخدام الايثانول 80٪.
  5. حقن تحت الجلد الحل الأجسام المضادة في الجزء الخلفي باستخدام حقنة الأنسولين. (لمواقع معينة (على سبيل المثال، الأذنين) حجم صغيرة فقط (10-50 ميكرولتر) قابلة للتنفيذ ليتم حقنه.)

وينبغي تكرار الحقن كل يوم الثاني على التوالي، 4 مرات. BALB / ج الفئران وC57BL6 من وزن الجسم ما يقرب من 20 غراما بداية لتطوير هذا المرض 3-4 أيام بعد أول إدارة من 400-500 تصل إلى 750 ميكروغرام / غرام وزن الأجسام المضادة / حقن الجسم.

عندما الانتهاء من التجربة:

  1. وضع الفئران تحت الخدر العميق عن طريق حقن 130 ملغ / كغ و 20 ملغم / كغم من الكيتامين / زيلازين تحت الجلد، يستنزف منهم من الوريد الأجوف الخلفي وقطع القلب بها.
  2. جمع الأجهزة / عينات الأنسجة مثل الجلد: الذيل، والدم والأذن والمريء ووضعها في أنابيب المسمى سابقا وشغل PBS أو 3.7٪ الفورمالديهايد.

عند عودته إلىالمختبر:

  1. أجهزة الطرد المركزي في الدم XG 1200، 10 دقيقة في RT لبلازما منفصلة، ​​نقل البلازما إلى أنابيب صفت وتخزينها بشكل صحيح وفقا لذلك.
  2. تضمين الجلد خزعة في درجة الحرارة المثلى من القطع الوسط باستخدام cryomolds، صحيح التسمية، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. وضع عينات الأنسجة المخصصة للعلم الأنسجة في قوالب صفت التضمين والاحتفاظ بها في الفورمالديهايد 3.7٪ حتى تضمين البارافين.

3. السريرية تقييم شدة المرض

ينبغي دراسة الفئران يوميا لآفات الجلد والغشاء المخاطي ويجب تسجيل النتائج باستخدام الأشكال المناسبة. معايير القتل الرحيم في وقت مبكر هو الآفات الجلدية التي تؤثر على أكثر من 20٪ من سطح الجسم وفقدان الوزن من 5-10٪ من وزن الجسم الكلي في ثلاثة أيام متتالية، عد لدرجة المرض من 5 (الجدول 1).

  1. ضع الماوس على بطنها. تبدأ منطقة الرأس، وهي مع الحقالأذن وتحقق من وجود بثور وتقرحات والقشرة الداخلية على وكذلك على الجانب الخارجي. تواصل بنفس الطريقة مع الأذن اليسرى.
  2. يتم التحكم العينين اليمنى واليسرى بحثا عن علامات على حمامي، وثعلبة، تقرحات و / أو القشرة.
  3. ونحى الجبهة ومنطقة خطم من خلال المقبل، واستمرار مع الجزء البطني من الخطم، والشفة والغشاء المخاطي للفم.
  4. دراسة الساق الأمامية اليمنى بدءا من مخلب، تتحرك صعودا؛ التبديل إلى الساق الأمامية اليسرى. نفس الإجراء مع الساقين الخلفيتين الأيمن والأيسر.
  5. فرشاة من خلال الفراء على الرقبة ومنطقة الظهر مع ملقط غرامة نقطة منحنية.
  6. تحويل الماوس على ظهرها وتحقق الجزء البطني وكذلك بطني الجانبين في الأطراف بنفس الطريقة من قبل.
  7. تحقق من الذيل.
  8. التقاط صور لأجزاء الجسم ذات الصلة حيث الفئران يصابون بالمرض. ويجب إيلاء الاهتمام لنوعية وكمية من الصور.
  9. حساب عشرات الأمراض السريرية.

4. تحليل عينات الجلد والبلازما

  1. إعداد وتخزين وو / أو معالجة جميع الأنسجة التي تم جمعها وفقا لهذه الخطة.
  2. قطع الأنسجة المجمدة لأقسام IF الكشف عن الأجسام المضادة الأرنب والفأر مكونات نظام مكمل.
  3. تحليل محتوى البروتين والانزيم مختلفة (مقايسة MPO) من المجمدة و / أو الأنسجة مستخلصات عضوية.
  4. جزءا لا يتجزأ من البارافين قسم الأنسجة وصمة عار مع H & E لتصور مدى الضرر الأنسجة.
  5. تحليل البلازما بواسطة ELISA، طخة مناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نقل نتائج سلبية المستضد محددة الأجسام المضادة في مرض مهب كاملة في الفئران، تشبه في مستويات السريرية والنسيجية وجمعية رجال الأعمال المصريين immunopathological الإنسان. بثور، قشور، تقرحات وتطوير ثعلبة على أذنيه، الخطم، الكفوف، والساقين والظهر وحول العينين من الفئران. وأول علامات سريرية للمرض على الارجح تظهر على الأذنين و / أو منطقة الرأس. تم الكشف عن ترسب الأرانب مفتش محددة، والماوس C3 تكملة مباشرة بواسطة IF في تقاطع للطريق الجلد البشرة من الجلد في محيط بالآفة cryosections. في ظهور ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقل الأجسام المضادة من السلبي إلى حيوانات التجارب هو نهج الرئيسية لإثبات المرضية الخاصة بهم 7، -12. النماذج الحيوانية التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة، بالإضافة إلى كونه دليلا غير مباشر لالمناعة الذاتية 13، تسمح التحقيق في المرحلة صادر الآلية المسببة للأمراض. تم استخدام نموذج نقل السلبي من الجلد التي تعتمد على الأجسام المضادة محببة الناجم عن ظهور تقرحات في انحلال البشرة الفقاعي المكتسب (EBA) لتشريح آليات تلف الأنسجة في الجلادات المناعة الذاتية. اتضح أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

الكتاب نعترف دعم من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث وSI-1281/4-1 BIOSS من كلية الطب في جامعة فرايبورغ (لCS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
المؤتلف مستضد الترميز البلازميدات لأشكال المؤتلف السابع الكولاجين الفئران متاحة من مؤلف كتاب المقابلة.
مصل الأرنب المناعة www.eurogentec.com كان لدينا أرانب نيوزيلندا الابيض تحصين مع 200 ميكروغرام من مستضد، 3 مرات على فترات الأسبوع 2. لهذا الغرض استخدمنا خدمات SA Eurogentec، بلجيكا.
بروتين G الاغاروز روش العلوم التطبيقية 11243233001
BALB / ج الفئران نهر تشارلز المختبرات
مجمع أكتوبر، الأنسجة تيك ساكورا Finetek 4583 OCT، درجة الحرارة المثلى القطع
Cryomold القياسية ساكورا Finetek 4557 25 مم × 20 مم × 5 مم
Cryomold المتوسطة ساكورا Finetek 4566 15 مم × 15 مم × 5 مم
أحادي الارتباط Einbettkassette R. Langenbrinck 09-0503 تجهيز الأنسجة الأقراص المدمجة والتضمين
SPEZIAL-Tatowierfarbe شفارتز H. Hauptnerund وريتشارد Herberholz GMBH & KG شركة 71492000 الوشم معجون
Tatowierzange TZ1 EBECO E. بيكر وشركة محدودة الوشم الجهاز
الهيبارين كارل روث GMBH & CO. 7692،1
الفورمالديهايد 37٪ كارل روث GMBH & CO. 7386
الكيتامين هيدروكلوريد سيغما الدريخ CHEMIE GMBH K2753-1G
زيلازين هيدروكلوريد سيغما الدريخ CHEMIE GMBH X1251-1G
العقيمة PBS Biochrom L182-50
كاميرا رقمية نيكون COOLPIX 5400
حقنة مدفوعة حدة تصفية 0،45 ميكرون ميليبور
الفرجار ميتوتويو 7309 1667338 فارنيل (الموزع)
مرض التهديف ورقة المثال encloSED

المراجع

  1. Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
  2. Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
  3. Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
  4. Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
  5. Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
  6. Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
  7. Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
  8. Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
  9. Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
  10. Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
  11. Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
  12. Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
  13. Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
  14. Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
  15. Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
  16. Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
  17. Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

VII
المحببات التي تعتمد على الأجسام المضادة عنيفا الجلد الناجم عن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.