Method Article

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/4269

⸱

October 8th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم تدفق الخلوي على أساس طريقة لدراسة تطور الخلايا T في الجسم الحي باستخدام الفئران وراثيا على التلاعب wildtype أو T خلفية مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A نظام صحي المناعي يتطلب أن الخلايا T المستضدات الخارجية الرد على حين تبقى تسامحا في تقرير المصير، مستضدات. إعادة ترتيب عشوائية من مستقبلات الخلايا T (TCR) α β ومواضع يولد مرجع خلية T مع تنوع واسع في خصوصية المستضد، سواء في تقرير المصير والأجنبية. اختيار مرجع خلال التنمية في الغدة الصعترية هو أمر حاسم لتوليد خلايا T آمنة ومفيدة. عيوب في اختيار التوتة المساهمة في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية ونقص المناعة 1-4.

الأسلاف خلية T دخول التوتة كما نقرا thymocytes (DN) السلبية التي لا تعبر عن CD4 CD8 أو شارك في مستقبلات. التعبير عن كل من شارك وαβTCR مستقبلات يحدث في مرحلة (DP) إيجابية مزدوجة. تفاعل مع αβTCR الذاتي الببتيد-MHC (PMHC) قدم من قبل خلايا الغدة الصعترية يحدد مصير خلية توتية DP. التفاعلات تؤدي إلى تقارب عالية التحديد السلبية وeliminaنشوئها من ذاتية التفاعل thymocytes. انخفاض نتيجة التفاعلات الإيجابية تقارب في اختيار وتطوير CD4 CD8 واحد أو إيجابية (SP) خلايا T قادرة على الاعتراف المستضدات الخارجية المقدمة من MHC الذاتي 5.

يمكن دراستها اختيار الإيجابية في الفئران مع ذخيرة بولكلونل TCR (wildtype) من خلال مراقبة الجيل من الخلايا T الناضجة. ومع ذلك، فإنها ليست مثالية لدراسة اختيار السلبية التي ينطوي حذف السكان مستضد محددة الصغيرة. وقد استخدمت العديد من أنظمة نموذج لدراسة اختيار السلبية ولكنها تختلف في قدرتها على تلخيص الأحداث الفسيولوجية 6. على سبيل المثال، في المختبر من التحفيز thymocytes تفتقر إلى البيئة الغدة الصعترية التي تشارك عن كثب في الاختيار، في حين إدارة مستضد خارجي المنشأ يمكن أن يؤدي إلى غير محددة حذف thymocytes 7-9. حاليا، أفضل الأدوات لدراسة في الجسم الحي هي اختيار السلبية الفئران التي تعبر عن transgenic TCR محددة لمستضد الذاتية الذاتي. ومع ذلك، وتتميز العديد من النماذج الكلاسيكية المعدلة وراثيا من قبل TCR المبكرة التعبير عن سلسلة TCRα المعدلة وراثيا في مرحلة DN، مما أدى إلى اختيار سابق لأوانه السلبية. وقد وضعت مختبرنا النموذج CD4 HY، وهو ما يعبر عنه في مشروط HY المعدلة وراثيا TCRα في مرحلة DP، مما يسمح لاختيار سلبية تحدث أثناء الانتقال إلى DP SP كما يحدث في الفئران wildtype 10.

هنا، نحن تصف تدفق الخلوي على أساس بروتوكول لفحص الغدة الصعترية اختيار الإيجابية والسلبية في نموذج الفأر HY CD4. في حين اختيار سلبية في الفئران CD4 HY هو الفسيولوجية للغاية، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الأساليب لغيرها من النماذج المعدلة وراثيا TCR. سنقدم أيضا الاستراتيجيات العامة لتحليل إيجابي في اختيار ذخيرة بولكلونل ينطبق على أي تلاعب الفئران وراثيا.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرجوع إلى الشكل 1 مخطط شامل للبروتوكول التجريبية.

1. تشريح

  1. مكان الصلب شبكة العقيمة الشاشة إلى 60 × 15 مم طبق بتري. وهناك حاجة وحدة واحدة لكل عينة الأنسجة.
  2. إضافة 5 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) إلى كل طبق. إبقاء الأطباق على الجليد.
  3. الموت ببطء مع الفئران CO 2.
  4. آمنة الماوس لسطح تشريح، جنبا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الفيزيولوجية نماذج المعدلة وراثيا والفئران WT TCR، واختيار الإيجابي يبدأ في مرحلة DP مشرق قبل أن ينتقل إلى مرحلة DP مملة بعد اللقاء مستضد. thymocytes DP مملة ثم أدخل CD4 CD8 + الانتقالية المرحلة الصغرى قبل أن يصبح CD4SP أو thymocytes CD8SP (الشكل 2B). وتتميز ناضجة thymocytes SP من التعبير TCR عالية وفقدان CD24 (الشكل 2C). في حين يمكن للCD8 CD4 بواسطة الشخصي يمكن أن تكشف عن العيوب في اختيار .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية في غير المعدلة وراثيا والفئران TCR TCR المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يصف تلطيخ من المستضدات السطحية. لمزيد من التحليل للآليات الجزيئية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لأداء تلطيخ الخلايا. نستخدم العلوم البيولوجية دينار بحريني Cytofix / Cytoperm لكيت البروتينات داخل الخلايا ومعظم العلوم البيولوجية دينار بحريني Foxp3 كيت تلوين لعوامل النسخ. نكتسب عادة عينات لدينا على الفور بعد تلطيخ. ومع ذلك، يمكن تخزين العينات بين عشي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر بينغ تشانغ على مساعدته التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP-86595). TAB هو محقق جديد CIHR والباحث AHFMR. ويدعم QH من قبل على منحة دراسات عليا CIHR كندا - الدكتوراه ومنحة دراسية لAIHS بدوام كامل. ويدعم SAN بواسطة منحة دراسات عليا II الملكة اليزابيث. ويدعم AYWS بواسطة منحة دراسات عليا لNSERC - الدكتوراه.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
HyClone هانك حل متوازن الملح الحرارية العلمية SH30030.02
شاشات شبكة معدنية Cedarlane CX-0080-E-01
أطباق بتري (60 × 15 مم) فيشر العلمية 877221
المحاقن (3 مل) BD العلوم البيولوجية 309657
المخروطية أنابيب (15 مل) Sarstedt 62.554.205
مجهر زايس - بريمو ستار 415500-00XX-000
عدادة الكريات Hausserعلمي 3110
96-وحة جيدا Sarstedt 82.1582.001
ماصة الأقنية Fisherbrand 21-377-829
الجنين مصل العجل PAA A15-701
الفوسفات مخزنة المالحة فيشر العلمية SH3025802
أزيد الصوديوم IT بيكر الكيميائية المحدودة V015-05
FCR كاشف حظر استنساخ 2.4G2
مكافحة الماوس HY TCR eBioscience XX-9930-YY * استنساخ T3.70
مكافحة الماوس CD4 eBioscience XX-0042-YY * استنساخ RM4-5
Aالمعهد القومي للاتصالات الماوس CD8α eBioscience XX-0081-YY * استنساخ 53-6،7
مكافحة CD24 الماوس eBioscience XX-0242-YY * استنساخ M1/69
مكافحة الماوس TCRβ eBioscience XX-5961-YY * استنساخ H57-597
مكافحة CD69 الماوس المعقدة البيروكسيديز eBioscience 13-0691-YY * استنساخ H1.2F3
مكافحة الماوس CD5 المعقدة البيروكسيديز eBioscience 13-0051-YY * استنساخ 53-7،3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY *
تدفق عداد الكريات BD العلوم البيولوجية - FACS كانتو 338962
FACS أنابيب BD العلوم البيولوجية 352052
برامج تحليل تدفق الخلوي TreeStar - Flowjo FlowJo V7 / 9
HyClone RPMI - 1640 متوسطة الحرارية العلمية SH30027.01

* يختلف حسب XX YY ملون تألقي ويختلف حسب حجم القارورة.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and or....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thymic SelectionFlow CytometryT Cell DevelopmentPositive SelectionNegative SelectionDouble Positive ThymocytesSingle Positive T CellsTCR Transgenic ModelsAntibody Cocktail StainingHYcd4 Mouse Model

Related Articles