وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى أخرى في الجسم الحي نماذج من الأمراض التي تصيب البشر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في النواة الموجودة في proteomes التي هي الأكثر ارتباطا وثيقا وظائف مرتبطة مع تنظيم الجينات. الكبار نوى cardiomyocyte الثدييات هي فريدة من نوعها نظرا لنسبة عالية من الخلايا binucleated، 1 heterochromatic الدولة في الغالب من الحمض النووي، وطبيعة تقسيم غير من cardiomyocyte مما يجعل نوى الكبار في حالة دائمة من الطور البيني .. 2 تنظيم الترانسكربتي خلال تطوير و وقد المرض مدروسة في هذا الجهاز، 3-5 ولكن ما زال غير مستكشفة نسبيا هو الدور الذي تقوم به البروتينات النووية المسؤولة عن التعبئة والتغليف DNA والتعبير، وكيف يمكن لهذه البروتينات السيطرة تغييرات في برامج النسخ التي تحدث أثناء المرض. 6 في تطوير العالم، وأمراض القلب هي السبب الأول للوفيات لكل من الرجال والنساء .. 7 انسايت حول كيفية البروتينات النووية لتنظيم التعاون تطور هذا المرض أمر بالغ الأهمية للنهوض الحالية س العلاجيارات.
قياس الطيف الكتلي هو الأداة المثالية لمعالجة هذه الأسئلة لأنها تسمح للتعليق توضيحي متحيز للبروتيوم الكمي النووية والنسبية لكيفية وفرة من هذه البروتينات مع التغيرات المرض. في حين كانت هناك دراسات عدة عن البروتين البروتين الثدييات المجمعات النووية، 8-13 وحتى وقت قريب كان هناك 14 دراسة واحدة فقط فحص القلب النووي بروتيوم، وأنها تعتبر نواة بأكملها، بدلا من استكشاف بروتيوم على مستوى حجرات فرعية النووية 15 في جزء كبير منه، هذا النقص في العمل ويرجع ذلك إلى صعوبة عزل نواة القلب. نوى القلب تحدث داخل جهاز أكتين الميوسين-جامدة وكثيفة لأنها التي ترتبط عبر ملحقات متعددة من الشبكة الإندوبلازمية، إلى الحد الذي يغير شكل خلية عضلية تقلص بشكل عام 16 بالإضافة إلى ذلك، cardiomyocytes هي 40٪ من حيث الحجم الميتوكوندريا 17 الذي necessitaقسم التدريب والامتحانات إثراء النواة وبصرف النظر عن العضيات الأخرى. نحن هنا وصف بروتوكول للتخصيب النووي وتجزئة القلب الى مزيد من حجرات بيولوجيا ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإننا طرق بالتفصيل لتسمية خالية تشريح الشامل الكمي الطيفي لهذه الكسور تقنيات قابلة للتجريب في الجسم الحي في النماذج الحيوانية المختلفة وأجهزة الجسم حيث وضع العلامات الأيضية ليست مجدية.
البروتوكول
سير العمل التجريبي يحتوي على سبع خطوات رئيسية (الشكل 1). لأي عمل يستدعي العينات التي سيتم تشغيلها على مطياف الكتلة، يجب أن مجرب ارتداء معطف المختبر وقفازات وصافي الشعر والعناية لتجنب التلوث من الغبار وسفك الشخصية من الكيراتين.
1. التجانس القلب والعزلة النووية
والمتجانس قلوب الماوس ومعزولة وسليمة بيليه نوى (الشكل 2).
- التضحية الماوس الكبار، واستئصال القلب وشطف في الجليد ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 4 يسلط الضوء على فائدة هذا النوع من القياس الكمي النسبية. هو موضح في اللوحة اليمنى هي الببتيد الفردية قمم monoisotopic (مضافين من الفئران مختلفة)، والتي تم تعيينها على أنها تنتمي إلى HMGB1 البروتين (التي تم تحديدها من خلال البحث في قاعدة البيانات). كل الذروة، في الأساس اللوني ايون لاستخراج الببتيد معينة، يأتي من ماوس مختلفة. المجموعات تمثل ثلاث ولايات مختلفة الفسيولوجية: القاعدية، وتضخم القلب، وفشل القلب، مع ثلاثة مكررات البيولوجية لكل مجموعة. من خلال دمج ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استعرضت طريقتين رئيسيتين لعزل النووية سابقا: 27 واحد هو أسلوب بيرنس من المجانسة الأنسجة مجفف بالتجميد في المذيبات غير المائية، والثاني، وهو التعديل الذي نستخدمه هنا، من التجانس في الأنسجة السكروز المائي / محلول الملح يتبع بواسطة الطرد المركزي أو الفرق الكثافة التدرج.
Subfractionation من نوى من استخلاص الحمض على عينات الأنسجة هو أداة هامة لدراسة لونين التي استخدمت منذ 28، 1960 مع الهدف ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يتم اعتماد مختبر Vondriska من المنح المقدمة من معهد القلب والرئة والدم الوطني من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة Laubisch في جامعة كاليفورنيا. EM هو المستفيد من جنيفر S. زمالة دراسات عليا في الفسيولوجيا بوخفالد في جامعة كاليفورنيا؛ HC وهو حاصل على زمالة القلب الأمريكية ما قبل الدكتوراه جمعية؛ MP وهو حاصل على زمالة روث NIH ما بعد الدكتوراه كيرشتاين، وSF وهو حاصل على وK99 NIH جائزة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | |
| Dulbeco معدلة النسر متوسطة | إينفيتروجن | 11965 | |
| البروتيني بيليه | روش | 04 693 159 001 | |
| 100 ميكرون مصفاة | BD الصقر | 352360 | |
| Ultracut مشراح مستدق | رايشرت | ||
| 100CX ناقل الكترون مجهر | JEOL الولايات المتحدة الأمريكية، وشركة | ||
| الصفارية | BioRad | 161-0496 | |
| هيستون H2A الأجسام المضادة | سانتا كروز | SC-8648 | |
| Nucleoporin P62 الأجسام المضادة | BD العلوم البيولوجية | 610498 | |
| الأدينين nucleoالمد نقل الأجسام المضادة | سانتا كروز | SC-9299 | |
| BIP الأجسام المضادة | سانتا كروز | SC-1050 | |
| تويولين الأجسام المضادة | سيجما | T1568 | |
| هيستون H3 الجسم المضاد | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin الأجسام المضادة | خلية اشارة | C12C3 | |
| SNRP70 الأجسام المضادة | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 الضد | الحرارية فيشر | MS-879 | |
| الأجسام المضادة الشبكية | BD العلوم البيولوجية | 554136 | |
| نقص الأكسجين عامل محرض الأجسام المضادة-1 | نوفوس البيولوجية | NB100-469 | |
| BCA البروتين مقايسة | الحرارية العلمية | 23227 | |
| عكس العمود المرحلة | الكائنات الجديدةECTIVE | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks متصفح | الحرارية العلمية |
المراجع
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
