على<em&gt; في المختبر</em&gt; إعداد والحث على تسجيل البرامج موتور تغذية مع الحركات الفسيولوجية في<em&gt; Aplysia californica</em

ملخص

وصفنا تقنية لتسجيل خارج الخلية وتحفيز من الأعصاب والعضلات، والخلايا العصبية التي تم تحديدها الفردية في المختبر مع طلب ومراقبة أنواع مختلفة من السلوكيات التغذية في الجهاز تغذية Aplysia.

الملخص

تعدد الوظائف، قدرة هيكل واحد الطرفية لتوليد متعددة، والسلوكيات المتميزة ^1، يسمح الحيوانات على التكيف بسرعة مع تغير تصرفاتهم البيئات. والرخوي البحري Aplysia californica يوفر نظام لين العريكة لدراسة تعدد الوظائف. أثناء الرضاعة، Aplysia يولد العديد من أنواع متميزة من السلوكيات باستخدام جهاز تغذية نفسه، كتلة الشدق. العقدة التي تتحكم في هذه السلوكيات تحتوي على عدد من الخلايا العصبية، التي تم تحديدها كبيرة التي يمكن الوصول إليها لدراسة الكهربية. وقد وصفت نشاط هذه الخلايا العصبية الحركية في برامج التي يمكن تقسيمها إلى نوعين، برامج ابتلاعي وegestive، استنادا إلى توقيت النشاط العصبي الذي يؤدي إلى انغلاق النسبي الممسك الغذائية إلى أن النشاط العصبي أو يطيل أمد تتراجع في الممسك ^2. ومع ذلك، في العقد المعزولة، وحركات العضلات التي من شأنها أن تنتج هذه السلوكيات غائبة، مما يجعل منمن الصعب أن تكون على يقين ما إذا كانت البرامج هي المحرك لاحظ يرتبط من السلوكيات الحقيقية. في تسجيلات الجسم الحي، الأعصاب والعضلات قد تم الحصول عليها الموافق برامج التغذية ^2،3،4، ولكن من الصعب جدا لتسجيل مباشرة من الخلايا العصبية الفردية ^5. بالإضافة إلى ذلك، في الجسم الحي، يمكن ابتلاعي برامج تقسيمها الى مزيد من لدغ ويبتلع ^1،2، وهو التمييز الذي جعل من الصعب في معظم موضح سابقا في الأعمال التحضيرية المختبر.

وعلقت كتلة إعداد الشدق (الشكل 1) يسد الفجوة بين العقد المعزولة والحيوانات سليمة. في هذا الإعداد، والسلوكيات ابتلاعي - بما في ذلك كل من العض والبلع - يمكن والسلوكيات egestive (الرفض) أثارت، في نفس الوقت الذي يمكن تسجيلها من الخلايا العصبية الفردية وتحفيز استخدام الأقطاب الكهربائية خارج الخلية ^6. يمكن تغذية الحركات المرتبطة بهذه السلوكيات المختلفة تكون RECORدائرة التنمية الاقتصادية، كميا، وتتصل اتصالا مباشرا البرامج الحركية. البرامج الحركية في إعداد الشامل الشدق علقت تبدو أكثر مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي من برامج والمحركات أثارت في العقد المعزولة. وهكذا، يمكن للبرامج في هذا المحرك تكون أكثر استعدادا تتعلق مباشرة في السلوك الجسم الحي، وفي الوقت نفسه، الخلايا العصبية الفردية في متناول تسجيل والتحفيز مما كانت عليه في الحيوانات سليمة. بالإضافة إلى ذلك، كما يمكن خطوة وسيطة بين العقد المعزولة والحيوانات سليمة والنتائج من كتلة الشدق المساعدات في تفسير البيانات التي تم الحصول عليها في بيئات أكثر انخفاض كل من وسليمة أكثر. وعلقت كتلة إعداد الشدق هو أداة مفيدة لتحديد خصائص التحكم العصبي في تعدد الوظائف في Aplysia.

البروتوكول

1. إعداد حلول

1. لإعداد محلول كلوريد المغنيسيوم وهذا هو متساوي التوتر إلى مياه البحر التي يتم الاحتفاظ الحيوانات (~ 1000 millosmolar)، مارك إبريق كبير على مستوى حجم المطلوب. ملء إبريق الماء المقطر مع ما يقرب من 80٪ من هذا المستوى، وتزن من كمية مناسبة من هيدرات كلوريد المغنيسيوم لإيجاد حل ملي 333 في الحجم النهائي. إضافة إلى كلوريد المغنيسيوم إبريق، أغلق غطاء ويهز بقوة حتى يذوب تماما كلوريد المغنيسيوم، ومن ثم إضافة الماء المقطر حتى يتم الوصول إلى الحجم النهائي.
2. لإعداد Aplysia المالحة، بمناسبة مرة أخرى إبريق كبير على مستوى حجم المطلوب، وملء مع الماء المقطر إلى ما يقرب من 80٪ من هذا المستوى. وضع إبريق على طبق من ضجة، ضع قضيب تحريك في إبريق، وتشغيل لوحة ضجة.
3. واحدا تلو الآخر، وتزن من إبريق إضافة إلى الكميات المناسبة من المواد التالية لإنشاء هذه يخدعcentrations في الحجم النهائي: 460 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي كلوريد البوتاسيوم، 22 ملي كلوريد المغنيسيوم هيدرات، 33 كبريتات المغنيسيوم امائية مم، 10 مم كلوريد الكالسيوم ثنائي الماء و 10 ملي الجلوكوز، والمماسح ملي 10.
4. مرة واحدة يتم حل كاملا المواد المذابة، درجة الحموضة متر استخدام لقياس الرقم الهيدروجيني من الحل. إضافة ببطء 1 هيدروكسيد الصوديوم M لرفع الرقم الهيدروجيني إلى قيمة النهائية لل7.5. إذا قمت بإضافة الكثير من غير قصد هيدروكسيد الصوديوم، يمكنك إضافة 1 M حمض الهيدروكلوريك إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني.
5. إضافة الماء المقطر حتى يتم الوصول إلى الحجم النهائي.
6. لإبطاء نمو البكتيريا، وحلول تخزين في الثلاجة لحين الحاجة إليها لتجربة. لاحظ أن درجة الحرارة يمكن أن تؤثر على البرامج Aplysia السيارات. نحن لا ترصد بدقة في درجة الحرارة، ولكن بعد اكتمال الإعداد، وعادة ما تكون بالقرب من الاستعدادات درجة حرارة الغرفة.

2. إعداد طبق تسجيل

1. أثناء التجربة، سيتم تعليق كتلة الشدق في الحل فيجولة 100 مم (قطر) × 50 مم (الارتفاع) بيركس الطبق. يجب أن يكون هذا الطبق غرفة اجهة لكتلة الشدق، ضيقة، ومنصة مرتفعة الأوسط حيث مقيد العقد الشدق على Sylgard، ومنفصلة، ​​وغرفة مرتفعة حيث يتم الرجوع عزل العقدة المخية. وينبغي أن يكون الشق في Sylgard توصيل منصة العقد الشدق إلى الدائرة العقدة المخية. انظر الشكل 1، مشيرا إلى الأبعاد المفتاح المحدد عند بناء الطبق.
2. لإنشاء هذا الطبق، مع بدء جولة 100 × 50 مم طبق بيركس. إعداد Sylgard اتباع الإرشادات المتوفرة مع المنتج. وبناء الطبق تتطلب عدة يصب من Sylgard، وبين التي يجب أن يسمح للSylgard لتعيين.
3. وبور الأول هو لإنشاء أعلى مستوى من Sylgard في الصحن، وسور في بين الغرف والشدق الدماغي (راجع الشكل 1). اغلاق هذا الجزء من طبق من الأقسام الأخرى. ويمكن استخدام الطين لبناء النمذجةالجدران لأغلقوا الأبواب. لجدار شقة، ويمكن استخدام قطعة من الورق المقوى، مع دعم النمذجة الطين. لجدار منحني (مما يقلل من حجم الغرفة التي تحتوي على العقدة المخية)، استخدم الطين النمذجة وحدها كأساس للجدار. معطف جميع الجدران مع غلاف بلاستيكي حيث سيتصل Sylgard لتسهيل إزالتها.
4. مرة واحدة وقد تم حظر الفضاء للجدار بين الغرف والشدق الدماغية قبالة كما هو موضح في 2.3، ضمان الاختام مشددة على حواف للحد من التسرب، صب Sylgard في هذه المساحة ما يقرب إلى أعلى الطبق. السماح للمجموعة Sylgard بين عشية وضحاها، وتأكد من أن يتم تعيين بشكل كامل قبل المتابعة. ووضع الطبق في مكان دافئ حمل أسرع الإعداد.
5. المقبل، يجب سكب منصة العقد الشدق وغرفة العقدة المخية (مرة أخرى، راجع الشكل 1، مما يدل على مواقع هذه العقد في صحن الانتهاء). إزالة الجدران السابقة حظر، وإنشاء جدار جديد على ديموقف 0.5 سم من الحائط Sylgard شقة من الجزء الأوسط لاغلاق منصة العقد الشدق. لا الجدران اللازمة لإنشاء غرفة الظهر التي ستعقد العقدة المخية. صب Sylgard في كل من الفروع تصل إلى ارتفاع حوالي 3 مم تحت مستوى أعلى. ينبغي أن يكون مجرد غرفة الدماغية أقل قليلا من منصة العقد الشدق. مرة أخرى، والسماح للتعيين Sylgard بين عشية وضحاها.
6. وأخيرا، صب الدائرة أمام (أي الدائرة التي سيتم تعليق كتلة الشدق). لا جدران ضرورية. صب إلى الارتفاع المناسب كما هو محدد في الشكل 1.
7. والخطوة الأخيرة هي لقطع الاتصال من الدرجة منصة العقد الشدق وغرفة الدماغي. يجب أن عمق الشق يكون نفس المستوى من منصة العقد الشدق. ويمكن استخدام شفرة مشرط لقطع الشق. ويبين الشكل 1 صحن الانتهاء.

3. القطب إعداد

1. سحب البريد خارج الخليةlectrodes من واحد الماسورة الشعرية الزجاجية باستخدام المشتعلة براون micropipette مجتذب. يجب بأقطار الأقطاب "الداخلية تكون حوالي 40 ميكرومتر والمقاومة ينبغي أن يكون لها حوالي 0.1 MΩ. مع خيوط FT345B في مجتذب، لدينا برنامج نموذجي مجتذب الإعدادات الحرارة 480، سحب 50، فيل 13، والوقت 20، ولكن لاحظ أن إعدادات ستكون مختلفة عن خيوط مختلفة. هذا البرنامج يخلق الأقطاب في سحب واحد مع عدم وجود مرحلة تلميع النار. قبل البدء في التجربة، الردم الأقطاب خارج الخلية مع المالحة Aplysia.
2. خلق أقطاب للربط الأعصاب والعضلات ² بعد تسجيل بروتوكول مماثلة لتلك التي وصفها كولينس وChiel ^4، إلا أن أقطاب الفردية لا يجب أن تكون ملفوفة حول بعضها البعض. الخطوات لإنشاء هذه الأقطاب في متابعة 3،3-3،13.
3. قطع قطعة من المينا المغلفة، الأسلاك 0،001 بوصة الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها إلى طوله حوالي 60 سم. إرفاق الكرة من الطين النمذجةإلى كل نهاية السلك، سلك عقد في الهواء في نقطة الوسط، وتدور الكرات اثنين من الطين حول بعضها البعض للالتفاف الأسلاك حول بعضها البعض (وهذا يقلل العابرين capacitative).
4. عقد طرفي السلك معا من خلال الانضمام إلى اثنين من الكرات الطينية في واحدة الكرة، والشريط الطرف الآخر من السلك إلى السلك تعليق.
5. معطف على طول السلك في الغراء سيليكون المنزلية من خلال وضع الكرة من الغراء على الإبهام، ولمس الإبهام والسبابة معا على السلك، وتشغيلها عبر السلك. اسمحوا الغراء جافة بين عشية وضحاها.
6. بعد أن يجف الغراء، ووضع الأسلاك على سطح مستو تحت المجهر مجهر تشريح. قطع نهاية السلك الذي كان في السابق الأوسط، مما أدى إلى اثنين من الأسلاك الملتوية منفصلة معا. هذا هو الفرق الكهربائي.
7. استخدام الشريط لعقد واحد من طرفي القطب في المكان. باستخدام ملقط لتجريدها من الغراء والمينا، وإعداد وأسلاك في نهاية واحدة لحوالي 2 سم سو سلك الحرة مع 1 سم عن السلك تجريده من المينا. جندى دبوس موصل الذهب إلى كل من الأسلاك، ومكان الشريط المختبر حول دبابيس للحفاظ على فصل.
8. في الطرف الآخر من القطب، وإعداد أسلاك لدينا حوالي 3 مم من الأسلاك مجانا. إزالة المينا من حوالي 1 ملم الأخير من سلك واحد، وثني هذا السلك والعودة للخروج من الطريق. هذا هو سلك المرجعية. فمن الأهمية بمكان أن السلكين لم يكن لديك سلك عارية لمس كل منهما الآخر.
9. إزالة المينا من الأسلاك الأخرى على طول الطريق إلى الغراء السيليكون. تطور هذا السلك في ربط وقطع عليه لطول حوالي 1 مم. وهذا ربط نعلق على الأعصاب أو العضلات. باستخدام خطاف توفر قدرا أكبر من الاستقرار قصيرة عندما يتم إرفاق العصبية إلى القطب.
10. استخدام متعدد للتحقق من أن يتم إنشاء بشكل صحيح القطب وسليمة. ينبغي للمرء أن يكون الذهب موصل قراءة مقاومة تقريبا 200-500 أوم فيما يتعلق غيض من سلك واحد، وربط الذهب الأخرى أو ينبغي أن يكون قراءة مماثلة بالنسبة لسلك أخرى.
11. إذا لم يكن هناك اتصال سليمة على سلك واحد، فإنه قد يكون من الممكن إعادة تجريد نهاية السلك وإعادة جندى واحد أو كلا الموصلين الذهب لعمل هذه الاتصالات. إذا كان كل من الموصلات الذهبية لديهم اتصالات مع كل من أسلاك، قد يكون القطب اثنين من الأسلاك العارية مما يجعل الاتصال. قد يكون من الممكن لإصلاح الطرف الآخر للقضاء على هذه المشكلة، وإلا، يجب التخلص من القطب.
12. كرر هذا الإجراء لأنه كما العديد من الأقطاب الكهربائية اللازمة لهذه التجربة. ويمكن ربط أقطاب إعادة استخدامها من التجربة في تجربة بقطع النهاية أن تعلق على الأعصاب وخلق السنانير جديدة، حتى يصبح السلك قصيرة جدا بعد العديد من الاستخدامات. في كل مرة يتم ذلك، استخدام متعدد للتحقق من أن القطب سليمة.
13. لتتبع الأقطاب المختلفة خلال التجارب، الأقطاب الكهربائية والكابلات التسمية الخاصة بهم. باستخدام ألوان مختلفة من الشريط مختبر مفيد.

ق = "jove_title"> 4. تشريح الحيوان وإعداد الشدقي الشامل

1. اختيار حيوان صحية من الوزن حوالي 200-300 غرام. عندما قدم مع الأعشاب البحرية، ينبغي أن الحيوانات تنتج دغات قوية مع protractions على فترات منتظمة من 3-5 ثوانى.
2. وضع الحيوانات في علبة تشريح وتخدير عن طريق حقن حوالي 50٪ من وزن الجسم متساوي التوتر محلول كلوريد المغنيسيوم. جعل حقن الحقنة الأولى مع درجة في الزاوية نحو 15 إلى 30، وبالقرب من منتصف لافتا نحو ذيل الحيوان. بعد الحقن، والتدليك برفق سطح الحيوان لنشر كلوريد المغنيسيوم. جعل حقن إضافية حسب الحاجة مع حقنة مشيرا نحو الرأس من الحيوان.
3. بعد توقف عن الاستجابة الحيوان للمؤثرات عن طريق اللمس اللطيف، دبوس الحيوان إلى الجانب، علبة الظهرية فوق، مع واحد دبوس في الذيل دبوس واحد في كل اللامسة الأمامية.
4. استخدام ملقط لقرصة ورفع الجلد الحيوان في منتصف الرأس، وراء rhinophores. Mأك شق الإكليلي عبر رأس الحيوان، خلف محتجزين نقطة. ثم جعل شق سهمي ناصف للمضي قدما في rhinophores بين نحو الفم، ويعرض الشامل الشدق.
5. استخدام ملقط لسحب رفرف من الجلد أقرب إليك بعيدا عن الكتلة الشدق، وقطع طريق الأعصاب والأنسجة الضامة التي تربط لجدار الجسم بالكامل لفصل هذا رفرف من الجلد من كتلة الشدق. تأكد من عدم قطع أي الأعصاب أو الأنسجة الذاتية للكتلة الشدق.
6. استخدام ملقط لانتزاع عقد والمريء. قطع طريق المريء الخلفي لدرجة محتجزين. سحب ما يصل على المريء لرفع كتلة الشدق كما يتم إجراء التخفيضات التالية.
7. وراء الشامل الشدق، والدماغية، الجنبي، ودواسة شكل حلقة العقد، مع العقدة المخية التي تعلق على العقد من قبل حروف العطف الشدق المخي الشدق (CBCs). ترك هذه العقد التي تعلق على حلقة الشامل الشدق، وقطع جميع الأعصاب إسقاط من هذه العقد إلى أجزاء أخرى منالجسم.
8. قطع طريق النسيج الضام في جميع أنحاء الشامل الشدق، ومواصلة رفع الشدق الشامل على النحو يصبح أقل ارتباطا الجسم. مرة واحدة فقط يتم إرفاق كتلة الشدق في الفم، ينبغي أن تعقد المريء والشامل على التوالى بزيادة الشدق.
9. جعل خفض النهائي الأمامي فقط لفكي لتحرير الشامل الشدق من الجسم. وضع الشدق الشامل في حل من 50٪ محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر و 50٪ المالحة Aplysia من أجل الحفاظ على التخدير الجزئي بينما تعلق الأقطاب الكهربائية.
10. وضع كتلة الشدق، مع الحل، في طبق بتري مع Sylgard أسفل. إزالة العقد الجنبي ودواسة بقطع صلاتهم إلى العقدة المخية. ترك العقدة المخية التي تعلق على العقد الشدق والشدق كتلة عبر الوصل المخي الشدق (CBCs)؛ بقطع الاتصالات الأخرى بين العقدة المخية والشامل الشدق. تقليم المريء والغدد اللعابية لأطوال قصيرة حتى لا زوآخرون في الطريق.

5. ربط الكهربائي مرفق

1. للتسجيل والتحفيز، يمكن إرفاق أقطاب هوك لعدد من الأعصاب والعضلات المختلفة، بما يتناسب مع التجربة (الشكل 2).
2. لتوصيف أنماط كما هو موضح في الجسم الحي من قبل كولينس وChiel ^4، نعلق الأقطاب الكهربائية في العصب radular، والعضلات I2، والأعصاب الشدق 2 و 3. معا، وهذه التسجيلات تظهر على نشاط الخلايا العصبية الحركية للعضلات الرئيسية الجوهرية لكتلة الشدق ^3،7،8، ويمكن التعرف على المرحلة مطل من تسجيل I2 ^3، مرحلة تراجع من الأعصاب الشدق 2 و 3 تسجيلات ^{2 ، 5،8،} وتوقيت إغلاق الممسك الغذائية من ال ² العصب تسجيل radular. إرفاق القطب ربط إضافية لفرع من 2 العصب الشدق لتحفيز نمط. المرفقات من الأقطاب الكهربائية يلي إجراء مماثل لذلك demonstratيوصف بقلم كولينس وChiel ^4، والخطوات التالية.
3. لكل مرفق الكهربائي، ضع الكهربائي على تتلاعب الخشنة. إلى مناور، والشريط عصا خشبية مع مقطع التمساح على نهايتها واستخدام مقطع لعقد نهاية القطب. يجب إرفاق مقطع إلى مقطع سيليكون المغلفة من القطب، وحوالي 1 سم قبل نهاية طلاء السيليكون. استخدام مناور لوضع القطب الكهربائي هوك بالقرب من الشدق الشامل.
4. مع كتلة الشدق على جانبها وضعت ضد جانب من الطبق للاستقرار، تبدأ مع العصب radular، الذي يعرض المرفق القطب الأكثر صعوبة. هناك خياران للوصول إلى هذا العصب.
5. المشاريع عصب radular من تحت العقدة الشدق ويمر تحت العضلة I2 في فرعين. أولا، معرفة ما إذا كان يمكن الوصول إلى العصب radular دون قطع العضلات. دفع برفق جانبا غمد الأبيض إرفاق العقد الشدق لعضلة I2؛ ديا غير مقطعة هذا الغلاف. إذا كان يمكن الوصول إلى العصب، واستخدام ملقط مع بنت تلميح إلى هوك لرفع فرع واحد من العصب.
6. إذا كان العصب radular لا يمكن الوصول إليها بهذه الطريقة، والخيار الثاني هو لتحديد موقع العصب تحت العضلات I2 رقيقة، وجعل شق صغير في I2 لفضح العصبية. يجب أن تذهب من خلال هذا الشق طبقتين من العضلات. استخدام ملقط مدمن مخدرات لسحب فرع من العصب radular من تحت العضلات.
7. استخدام مناور لوضع هوك القطب القادم في العصب. لوضع العصب في هوك، فإنه من المفيد عقد العصبية في ملقط مدمن مخدرات في وقت واحد أثناء استخدام زوج آخر من ملقط لخلق فصل بين شطري العصب محتجزين.
8. بعد العصب هو آمن في هوك، استخدم تتلاعب لرفع العصب بعيدا عن الكتلة الشدق حتى يتم مشدود، ولكن لا الإطالة الزائدة لا.
9. اتخاذ Kimwipe وتطور بإحكام زاوية واحدة لتشكيل الفتيل الصغيرة. استخدام هذا الفتيل لتجفيفنهاية القطب وقسم من العصبية التي يتم التوصيل.
10. استخدام مجموعة أخرى من منحني ملقط غيض لتطبيق الكرة من جل سوبر الغراء السريع في العصب مدمن مخدرات. بدء تطبيق عند نقطة الاتصال بين الأسلاك والعصبية. تأكد من أن يتم تغطيتها بالكامل مع ربط الغراء، والتي لا تغطي طرف السلك المرجعية مع الغراء (الشكل 3).
11. استخدام حقنة مع البولي ايثيلين أنابيب مرفق لتطبيق الحل على طبق من الغراء، والتي من شأنها أن تحفز على سطح الغراء لتعيين. لا شك أن يستحم جيدا الغراء مع الحل للتأكد من أن يحدد بشكل صحيح الغراء.
12. استخدام مناور للافراج عن التوتر في الأعصاب، ثم حرر القطب من مقطع. هذا يكمل إجراءات ربط أحد القطبين هوك.
13. يجب أن يرفق القطب العضلات I2 المقبل. نسجل النشاط EMG من العضلات بدلا من I2 ENG النشاط من أعصابها بسبب التعصيب العصب المتوسط ​​المتحرك هو I2 جداليرة لبنانية والتي يصعب الوصول إليها في كتلة والشدق سليمة. بالقرب من العصب الشدق 2، استخدام ملقط لرفع مدمن مخدرات واحد أو شريطين من العضلات I2، واستخدام زوج آخر من ملقط للمساعدة في فصلها عن بقية العضلات. ينبغي أن فصل جزء من I2 تكون مشابهة في السمك إلى العصب الدهليزي 2 أو 3. يجب الحرص على عدم الإفراط منفصلة (والتي قد يزيل التعصيب العضلات). إرفاق هوك الكهربائي للإجراءات نفسها التي استخدمت لالعصب radular.
14. القطب بجانب هو أن نعلق لفرع من العصب الشدق 2. ويمكن حفز هذا الفرع كهربائيا للحث على برامج موتور ^9. قبل الأعصاب الشدق 2 يذهب تحت العضلات I1 في الأخدود الأفقي، والعصب trifurcates؛ فرع هو أول فرع لتقسيم قبالة. فروع صغيرة جدا، لذلك يجب أن يتم الحجز الكهربائي مع الرعاية. اتبع نفس الإجراء لإرفاق القطب.
15. يتم الوصول بسهولة الأعصاب الشدق 2 و 3. اتبع الإجراء نفسه، ربط كهربائيفي منتصف الطريق تقريبا بين trodes العقدة الشدق والأخدود الأفقي.
16. للمساعدة في التمييز بين الخلايا العصبية مع توقعات من جانب واحد مقابل الثنائية، فمن المفيد أيضا أن نعلق الأقطاب الكهربائية إلى الأعصاب الشدق 2 و 3 على الجانب الآخر من كتلة الشدق، وكذلك الشدق العصب 2 فرع، لأن بعض الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف لمباراة المماثل . المقابل BN2-A التحفيز.

6. العقدة المواقع والتخفيف من غمد

1. سيتم نقل الجماعي الشدق الى الدور 100 × 50 مم طبق بيركس وصفها في القسم 2. انظر الشكل 1.
2. تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم فراغ إلى الدرجة بين الدوائر الدماغية والشدق، وذلك باستخدام معلومات سرية الماصة لالتقاط الكرة من الشحوم فراغ وانتشر أكثر من الشق. لقد وجدنا أن يقلل الشحوم فراغ تسرب أفضل من الفازلين. ملء غرفة الجبهة مع المالحة Aplysia. تحرك بحذر كتلة الشدق من طبق بتري إلى chamb الجبهةإيه هذا أكبر صحن، والتأكد من أن يتم سحبها أي من الأقطاب الكهربائية بإحكام، مما قد كسر الأعصاب.
3. إذا يجب أن يتم نقل الطبق إلى آخر المجهر مجهر تشريح لترقق غمد، نكون حذرين للغاية مع الأقطاب هوك. مجموعة الأقطاب الكهربائية على جانب واحد من كتلة الشدق معا، وأيضا مجموعة من الأقطاب الكهربائية على الجانب الآخر من كتلة الشدق معا. عقد بعناية من قبل الأقطاب استيعاب الشريط المختبر الذي يغطي أسنان في الموصل، مما يجعل مرة أخرى من أن يتم سحب أي من الأقطاب الكهربائية بإحكام.
4. عندما يتم وضع صحن تحت المجهر، ينبغي رايات الأقطاب برفق على جانبي الصحن والباقي على المنصة بجوار الطبق.
5. وأثناء فترات الراحة بين مراحل التجربة، تهوية المياه المالحة في قاعة الشامل الشدق باستخدام airstone الحوض.
6. دبوس العقدة المخية في الجزء الخلفي مع الوصل المخي الشدق (CBCs) يمر عبر الشق. تطبيق أكثر ز فراغrease على CBCs، ثم يضاف محلول ملحي أكثر Aplysia إلى كل أجزاء من الطبق، بحيث يتم المغمورة تماما العقد. تأكد من أن كمية الشحوم فراغ المضافة هي أعلى من مستوى الملوحة في غرف إما الدماغي أو الشدق حتى لا يحدث تسرب بين الدوائر. في هذه المرحلة، ينبغي أن يستريح الشامل الشدق على الجزء السفلي من الغرفة الأمامية حتى لا تسحب بقوة أيضا على الأعصاب والعقد العصبية.
7. يعلقون عليه العقد الشدق على منصة الأوسط. لتجنب إتلاف الأعصاب التي لا تزال تعلق على كتلة الشدق، ضع فقط دبابيس على غمد بين اثنين من الأعصاب. إضافة رقمين آخرين على جانب CBCs لتمتد وترسيخها.
8. الحفاظ على شقة العقد الشدق أو تدويرها استنادا إلى موقع الخلايا العصبية في المصالح. لتدوير العقدة الشدق، استخدم ملقط غرامة لانتزاع بعض الزيادة في غمد CBC ويعلقون عليه بين الأعصاب الشدق 2 و 3. ثم أكثر من أجسام الخلايا التي هي قريب من غرفة الى الوراء ويمكن أن يكون EASIويمكن ملاحظة لاي الوصول إليها من الجزء العلوي من العقدة الشدق. وأخيرا، إضافة اثنين من دبابيس على غمد من العقدة الشدق قريب من الجانب الشدق الشامل للحد من حركة العقدة الشدق. انظر الشكل 4.
9. استخدام ملقط غرامة للاستيلاء على غمد من العقدة الشدق قريب من غرفة إلى الخلف، ثم قطع غمد الزائدة مع مقص غرامة دون تعريض الهيئات الخلية. من أجل تقليل الضرر، فقط إزالة كمية غمد اللازمة لرؤية أجسام الخلايا.

7. التحفيز وتسجيل

1. بعد ترقق اكتمال غمد، ونعلق كل دبابيس الكهربائي لمآخذ على الكابلات التي تتصل مكبرات الصوت. مرة أخرى، تأكد من أن لا يتم سحب الأقطاب بإحكام أثناء القيام بذلك. تأكد من أن يتم بشكل صحيح تعلق الأقطاب إلى الكابلات على النحو المناسب وأن أقطاب صحيحة.
2. لتغسل أي كلوريد المغنيسيوم المتبقية، استبدال Aplysiوالمالحة في قاعة الشامل الشدق مع المالحة Aplysia الطازجة.
3. الخيط الحرير وخياطة من خلال الأنسجة الرخوة في الجزء الأمامي من كتلة الشدق، أمامي ظهراني إلى غضروف الفك، واستخدام قطعتين من الصلصال لإرفاق خياطة إلى حافة الطبق، وبالتالي تعليق كتلة الشدق من نهايتها الأمامية. لاحظ أن يتم تعليق الخلفي من نهاية الأعصاب الشدق تعلق على العقد الشدق.
4. وضع تضارب فى عقد القطب الزجاج خارج الخلية بحيث غيض الكهربائي بالقرب من العقدة الشدق.
5. لاكتشاف وتحديد الخلايا العصبيه، استخدم مناور للضغط بلطف غيض من القطب خارج الخلية أسفل على غلاف الخلايا العصبية على سوما (الشكل 5). تطبيق الحالي تحفيز، ومن ثم التبديل القناة والذي يتم استخدامه لإثارة سوما لوضع التسجيل من أجل تسجيل النشاط الكهربائي في خارج الخلية والنشاط المقابلة على الأعصاب (الشكل 6). الرجوعإلى خرائط العقدة نشرت ووصف الخلايا العصبية، بما في ذلك التوقعات الأعصاب والعضلات innervations، (على سبيل المثال ^7،8) للمساعدة في تحديد الخلايا العصبية.
6. لتسجيل الفيديو من برامج التغذية، موقف مرآة على جانب الطبق بحيث يمكن رؤية أن وجهات النظر الأمامية والجانبية من كتلة الشدق في وقت واحد (ويرد موقع مرآة تخطيطي في الشكل 1). وضع كاميرا فيديو مع كل من الجبهة وجهات النظر في الجانب الميداني نظره.
7. يمكن مزامنة الفيديو والتسجيلات الكهربية عن طريق إرسال نبضة TTL على حد سواء لجهاز توقيت الإلكترونية من وجهة نظر الكاميرا ومسجل المحاور في قناة، وبرنامج كمبيوتر يستخدم لتسجيل وتحليل البيانات الكهربية. هذا النبض يوفر نقطة الوقت الذي هو نفسه تماما في تسجيلات الفيديو ومسجل المحاور، التي على أساسها يمكن مزامنة الملفات.
8. بعد يقع على الخلايا العصبية، يمكن تسجيل النشاط في السلوكيات مثل الرضاعة المختلفة، والتي كاليفورنيان أن أثار على النحو المبين أدناه.
9. للحث على رفض مثل برامج السيارات، وتحفيز BN2 ألف. مع قطار طويل من 2 هرتز، 1 ميللي ثانية البقول ⁹ (تجربتنا هو أن هذا التحفيز يولد موثوق أنماط egestive في هذا الإعداد) أنماط يستمر لمدة التحفيز، وربما تستمر حتى بعد فترة وجيزة من انتهاء التحفيز.
10. للحث على برامج مثل السيارات العض ^12، وضع بلورات قليلة من كرباكول الصلبة مباشرة على العقدة المخية. بدلا من ذلك، إذا كان مستوى التعرض للرقابة كرباكول ضروري، واستخدام محلول كرباكول ملي بين 1 و 10 في المياه المالحة Aplysia. تركيزات أعلى من المرجح أن تسفر عن الردود. أنماط متكررة تبدأ عادة في غضون 5 دقائق، وتستمر لمدة ما يقرب من 10 إلى 15 دقيقة قبل البدء في الجري.
11. للحث على البلع مثل برامج موتور ^13، تطبيق كرباكول، والانتظار حتى يولد الشدق الشامل لدغات قوية. ثم، خلال لدغة، ضع الشريطمن الأعشاب البحرية (المرحضة المجففة) في فم الحيوان بحيث RADULA القبضات الأعشاب البحرية (الشكل 7). وعادة ما تكون شرائح واسعة 0.5 سم في 5 سم في الطول.
12. بعد السلسلة الأولى من كرباكول الناجم عن أنماط، غالبا ما يكون من الممكن الحصول على ردود كرباكول إضافية. اغسل خارج المالحة Aplysia في غرفة العقدة المخية، وإزالة واستبدال المالحة ثلاث مرات على الأقل. الانتظار على الأقل 20 دقيقة قبل تطبيق كرباكول مرة أخرى. قد الانتظار تصل إلى 40 دقيقة تسفر عن نتائج أكثر موثوقية.

في هذا الوقت في الولايات المتحدة، والحيوانات اللافقارية لا تتطلب موافقة رسمية من قبل استخدام الحيوان المؤسسية واللجنة الصحية. ومع ذلك، فقد تأكدنا من أن جميع العلاجات من Aplysia تقليل الضرر والمعاناة للحيوان، والتي تتم عن تشريح الحيوانات في حين أن للتخدير الكامل.

النتائج

عندما يتم وضع قطب كهربائي خارج خلوي فوق جسم الخلية العصبية واستخدامه لتحفيز هذه العصبون، يمكن ملاحظة تطابق تام بنسبة واحد إلى واحد بين النبضات في قناة جسم الخلية والنبضات في العصب (أو الأعصاب) التي يبرز إليها هذا العصبون (الشكل 6، اللوحة اليسرى، تحفيز العصبون المحدد B9). يتم ضبط قناة جسم الخلية (القناة العلوية) على وضع التحفيز عند تطبيق التيار (الزمن 1 في الشكل)، ثم يتم تحويلها بسرعة إلى وضع التسجيل (الزمن 2). ومن خلال الحفاظ على موقع القطب الكهربائي، يمكن تسجيل نشاط العصبون أثناء البرامج الحركية (

المناقشة

وقد تميزت الأعمال السابقة Aplysia البرامج الحركية في الحيوانات سليمة وانخفاض في الأعمال التحضيرية، مثل العقد المعزولة. في الحيوان سليمة، على الرغم من التسجيلات قد تم الحصول عليها من الخلايا العصبية الفردية ^5، مثل هذه التجارب هي صعبة للغاية، ولا يمكن أن يتم نقل كهربائية إلى الخلايا العصبية من الخلايا العصبية أثناء الرضاعة. في العقد المعزولة، لا يمكن أن الحركات التغذية الناجم عن النشاط العصبي يمكن ملاحظتها. وعلقت كتلة إعداد الشدق يسد الفجوة بين هذين النقيضين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كلوريد الصوديوم	Fisher Scientific	S671	بيولوجي، معتمد
كلوريد البوتاسيوم	Fisher Scientific	P217	معتمد ACS
كلوريد المغنيسيوم سداسي الهيدرات	Acros Organics	19753	99%
كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدرات	Fisher Scientific	M63	معتمد ACS
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات	Fisher Scientifc	C79	معتمد ACS
جلوكوز (ديكستروز)	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
محلول MOPS المنظم	Acros Organics	17263	99%
كارباكول	Acros Organics	10824	99%
هيدروكسيد الصوديوم	Fisher Scientific	SS255	معتمد
حمض الهيدروكلوريك	Fisher Scientific	SA49	معتمد
أنابيب زجاجية شعرية أحادية الأنبوب	A-M Systems	6150
سحب الماصات الدقيقة باللهب موديل P-80/PC	Sutter Instruments		الفتيل المستخدم: FT345B
سلك من الفولاذ المقاوم للصدأ مغطى بالمينا	California Fine Wire		0.001D، غطاء h
غراء السيليكون المنزلي II	GE
غراء Duro Quick-Gel الفائق	Henkel corp.
مضخم A-M Systems موديل 1700	A-M Systems		إعدادات المرشح: 300-500 Hz للأعصاب، 10-500 Hz لعضلة I2
محفز Pulsemaster متعدد القنوات	World Precision Instruments	A300
عازل المحفز	World Precision Instruments	A360
AxoGraph X	AxoGraph Scientific
عداد إجمالي Veeder-Root	Danaher	C342-0562
دبابيس توصيل ذهبية	Bulgin	SA3148/1
مقابس توصيل ذهبية	Bulgin	SA3149/1
إلاستومر السيليكون Sylgard 184	Dow Corning
طبق تبلور 100 × 50 mm	Pyrex
شحم تفريغ عالٍ	Dow Corning
رؤوس ماصات	Fisher Scientific	21-375D
دبابيس Minutien	Fine Science Tools	26002-10
صلصال تشكيل	Sargent Art	22-4400
خيوط جراحية حريرية	Ethicon	K89OH
مضخة هواء Whisper	Tetra	77849
أنابيب أحواض السمك	Eheim	7783	12/16 mm
حجر هواء Elite	Hagen	A962
مقصات Vannas الزنبركية	Fine Science Tools	15000-08
ملاقط Dumont #5 دقيقة	Fine Science Tools	11254-20
أعشاب بحرية Yaki Sushi Nori	Rhee Bros
مناديل Kimwipes	Kimberly-Clark	34155