في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

ملخص

ووصف الإجراء لمعالجة النشاط الدماغي من الخلايا العصبية الهرمية القشرية optogenetically بينما رصد الكهربائي، مخطط كهربية العضل، وتركيز اللاكتات الدماغي. يتم تنفيذ تسجيلات تجريبية على الفئران، في حين أنها المربوطة الكابل الخضوع عفوية النوم / اعقاب دورات. يتم تجميع معدات Optogenetic في مختبرنا، ومعدات التسجيل متاح تجاريا.

الملخص

على الرغم من أن الدماغ يمثل أقل من 5٪ من الجسم عن طريق الإعلام، فإنه يستخدم ما يقرب من ربع الجلوكوز التي يستخدمها الجسم أثناء الراحة ^1. وظيفة العين السريعة من النوم غير حركة (NREMS)، الجزء الأكبر من النوم قبل الوقت، غير مؤكد. ومع ذلك، واحدة من أبرز سمات NREMS هو انخفاض كبير في معدل استخدام الجلوكوز الدماغي نسبة إلى اليقظة ^2-4. وقد أدت هذه النتائج وغيرها إلى الاعتقاد السائد أن النوم يؤدي وظيفة ذات الصلة الأيض الدماغي. ومع ذلك، فإن آليات التي تقوم عليها تخفيض في ايض الجلوكوز الدماغي خلال NREMS لا يزال يتعين توضيح.

واحد الظاهرة المرتبطة NREMS التي قد تؤثر الدماغي معدل الأيض هو حدوث موجات بطيئة، التذبذبات على ترددات أقل من 4 هرتز، في الكهربائي ^5،6. هذه الموجات البطيئة الكشف على مستوى الجمجمة أو القشرية الدماغية سطح تعكسالتذبذبات الكامنة بين الخلايا العصبية دولة استقطابها / يصل ودولة hyperpolarized / بنسبة ^7. أثناء حالة أسفل، الخلايا لا تخضع إمكانات العمل لفترات تصل إلى عدة مئات من ميلي ثانية. استعادة التدرجات الأيونية بعد تركيز إمكانات العمل يمثل عبئا كبيرا على التمثيل الغذائي للخلية ^8؛ غياب إمكانات العمل أثناء حالات أسفل المرتبطة NREMS يمكن أن تسهم في خفض التمثيل الغذائي النسبي لايقاظ.

كان اثنين من التحديات التقنية التي ينبغي معالجتها من أجل هذه العلاقة افتراضية لفحصها. أولا، كان من الضروري لقياس الأيض الدماغي حال السكر مع قرار الزمنية يعكس ديناميات EEG الدماغي (أي، أكثر من ثانية بدلا من دقيقة). للقيام بذلك، قمنا بقياس تركيز اللاكتات، نتاج تحلل الهوائية، وبالتالي قراءات من معدل ايض الجلوكوز في مخ الفئران. كان اللاكتاتتقاس باستخدام أوكسيديز القائمة على استشعار اللاكتات الوقت الحقيقي جزءا لا يتجزأ من القشرة الأمامية. آلية الاستشعار عن بعد يتكون من القطب البلاتين إيريديوم محاطة بطبقة من جزيئات أوكسيديز اللاكتات. استقلاب اللاكتات بواسطة أوكسيديز اللاكتات تنتج بيروكسيد الهيدروجين، التي تنتج تيارا في القطب البلاتين إيريديوم. لذلك تكثف من تحلل الدماغ يوفر زيادة في تركيز الركيزة لاكتات أوكسيديز، الذي ثم ينعكس في زيادة الحالية في القطب الاستشعار عن بعد. بالإضافة إلى ذلك كان من الضروري لقياس هذه المتغيرات في حين التلاعب في استثارة القشرة الدماغية، وذلك لعزل هذا المتغير من جوانب أخرى من NREMS.

ضعنا نظام تجريبي لقياس نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد عن طريق elecetroencephalogram، وقياس تدفق حال السكر عن طريق المجس البيولوجي اللاكتات، والتلاعب في الخلايا العصبية الدماغية القشرية النشاط عن طريق تفعيل optogenetic من PYRAميدال الخلايا العصبية. وقد استخدمت هذا النظام ونحن لتوثيق العلاقة بين الطول الموجي الكهربي النوم ذات الصلة وديناميات لحظة إلى لحظة تركيز اللاكتات في القشرة الدماغية. البروتوكول قد تكون مفيدة للكل ذي مصلحة في دراسة والتصرف بحرية في القوارض، والعلاقة بين قياس نشاط الخلايا العصبية على مستوى تخطيط كهربية و طاقة الخلوية داخل الدماغ.

البروتوكول

1. إعداد الجراحية للحيوانات

1. الموضوعات التجريبية

استخدام الفئران لB6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) خط المعدلة وراثيا 18Gfng / J ^9؛ JAX سلالة # 7612) أو الفئران الأخرى معربا عن الأزرق قناة الموجبة حساسة للضوء، Channelrhodopsin-2، في الخلايا العصبية الدماغية القشرية. تطبيق الضوء الأزرق إلى قشرة الدماغ من B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) خط المعدلة وراثيا 18Gfng / J يتسبب في الخلايا العصبية الهرمية معربا عن Channelrhodopsin-2 ليزيل الاستقطاب والخضوع العمل إمكانات ^9،10. ونتيجة لذلك من تنشيط ....

النتائج

كما هو مبين في الشكل 2، خضع ماوس مجهزة لتحفيز optogenetic واللاكتات / EEG / EMG جمع البيانات عفوية التحولات حالة سكون / في حين تم رصد أعقاب EEG، EMG وتركيز اللاكتات الدماغي بشكل مستمر. زيادة الحالية في الاستشعار اللاكتات أثناء فترات انخفاض السعة EEG وانخفضت خلال فترات السعة العالية EEG. كما هو موضح في الشكل 3، سواء من قنوات EEG تستجيب للمؤثرات optogenetic تسليمها في القشرة الأمامية.

المناقشة

عرض طرق تسمح لأحد هنا لقياس العلاقة بين النوم والتغيرات في تركيز الدماغ من اللاكتات وسيطة حال السكر على نطاق والوقت ليس من الممكن في السابق. الحيوانات الخضوع التحولات التلقائية بين NREMS، وبعد REMS. وعلاوة على ذلك، نحن قادرون على تطبيق محفزات optogenetic بينما الحيوانات الخضوع هذه التحولات. جمع البيانات حتى الآن تثبت أن تأثير الموجات التي يسببها كل من العفوية وعلى قراءات من المجس البيولوجي أوكسيديز المستندة إلى اللاكتات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
عنصر	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
باسيل ماوس دليل قنية	قمة التكنولوجيا / شركة باسيل	7032
اللاكتات المجس البيولوجي	قمة التكنولوجيا	7004
رئيس جبل	قمة التكنولوجيا	8402
النوم / نظام تسجيل المجس البيولوجي	قمة التكنولوجيا	8400-K1-SL	2 القنوات EEG، 1 EMG القناة، والمجس البيولوجي 1
ماوس المربوطة في المختبر عدة معايرة	قمة التكنولوجيا	7000-K1-T
الألياف البصرية دليل قنية	البلاستيك واحدة	C312G	21 قنية دليل المقياس
قنية همية	البلاستيك واحدة	C312DC	21 مقياس الدمية
الماس الألياف الكاتب	Thorlabs	S90W
الألياف رابط تجعيد أداة	Thorlabs	CT042
منفرق الأنابيب	Thorlabs	FT030	03.0 مم
	Thorlabs	T10S13	ماكس ضياء. 0،012
منفرق أنبوب المتعرية	Thorlabs	FTS3
الألياف العارية تكسية الصلب المتعدد	Thorlabs	BFL37-200	200 ميكرون الأساسية، 0.37 NA
سلك القصاصات / كيفلر المقص	Thorlabs	T865
الايبوكسي الألياف البصرية	Thorlabs	F112
الألياف المتعرية أداة	Thorlabs
الزجاج تلميع اللوحة	Thorlabs	CTG913
المطاط تلميع الوسادة	Thorlabs	NRS913
العين العدسة	Thorlabs	JEL10
كيم المسحات	Thorlabs	KW32
الهواء المضغوط	Thorlabs	CA3
تلميع بوك	Thorlabs	D50-XX
الألياف التفتيش نطاق	Thorlabs	CL-200
تلميع أفلام	Thorlabs	LFG5P، LFG3P، LFG1P، LFG03P
FC / PC موصل نهاية	Thorlabs	30126G2-240	حمل ميكرومتر 240، SS الطويق
MC التحفيز وحدة	متعدد القنوات أنظمة	STG-4002
MC التحفيز البرمجيات	متعدد القنوات أنظمة	MC-V 2.1.5 التحفيز
الأزرق ليزر	CrystaLaser	CL473-050-0
الليزر امدادات الطاقة	CrystaLaser	CL2005
الألياف البصرية المشتركة الروتاري	دوريسي العدسات	FRJ-V4
			الجدول 2. اللوازم والمعدات.