مقالة منهجية

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/4355

⸱

ديسمبر 4, 2012

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم العلاقة بين الاستجابة المناعية والسلوك، ونحن تصف طريقة لقياس السلوك الحركي في ذبابة الفاكهة خلال العدوى البكتيرية وكذلك قدرة الذباب على شن استجابة مناعية من البقاء على قيد الحياة الرصد والحمل البكتيري، في الوقت الحقيقي ونشاط منظم الرئيسية المناعة الفطرية، NFκB.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وصفت تفاعل معقد بين الاستجابة المناعية والسلوك المضيفة في مجموعة واسعة من الأنواع. النوم الزائد، على وجه الخصوص، ومن المعروف أن تحدث كاستجابة للإصابة في الثدييات (1) وأيضا في الآونة الأخيرة تم وصفها في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 2. ومن المسلم به عموما أن النوم هو مفيد إلى المضيف خلال وجود عدوى، وأنه من المهم للحفاظ على جهاز المناعة قويا 3،4. ومع ذلك، فإن الأدلة التجريبية التي تدعم هذه الفرضية هو محدود 4، ووظيفة النوم الزائد خلال استجابة مناعية لا تزال غير واضحة. وقد استخدمنا نهج متعدد التخصصات لمعالجة هذه المشكلة المعقدة، ولقد أجريت دراسات في النظام النموذجي الجينية البسيطة، وذبابة الفاكهة ذبابة الدروسوفيلا. نستخدم الفحص القياسية لقياس السلوك الحركي والنوم في الذباب، وتبين كيفية استخدام هذا الاختبار لقياس السلوك في بالعدوى الذبابد مع سلالة من البكتيريا. هذا الفحص مفيد أيضا لرصد مدة بقاء الفرد في الذباب أثناء العدوى. تدابير إضافية من وظائف المناعة تشمل القدرة من الذباب لمسح وجود عدوى وتفعيل NFκB، وهو عامل النسخ المفتاح الذي تم المركزي للاستجابة المناعية الفطرية في ذبابة الفاكهة. كل نتيجة بقاء وإزالة البكتيريا خلال العدوى معا مؤشرات المقاومة والتسامح للإصابة. المقاومة يشير إلى قدرة الذباب لمسح وجود عدوى، بينما يتم تعريف التسامح وقدرة المضيف للحد من الأضرار الناجمة عن وجود عدوى، وبالتالي البقاء على قيد الحياة على الرغم من مستويات عالية من الممرض داخل النظام 5. في الوقت الحقيقي رصد النشاط NFκB خلال العدوى رؤية ثاقبة آلية الجزيئية للبقاء على قيد الحياة خلال العدوى. استخدام ذبابة الفاكهة في هذه المقايسات مباشرة يسهل التحليل الجيني والجزيئي من النوموتتأثر بالتبادل الاستجابة المناعية وكيفية هذين النظامين المعقدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يستخدم اثنين من الاجهزة (الشكل 1) لشراء اربع قراءات مختلفة تم جمعها من الذباب التعرض للعدوى البكتيرية. وتشمل هذه المخرجات 1) النوم / اعقاب السلوك، 2) نتيجة بقاء؛ 3) الحمل البكتيري في الطيران، و4) في الوقت الحقيقي قياس النشاط مراسل NFκB في الجسم الحي. بالاشتراك مع الأدوات الوراثية التي تتوفر في ذبابة الفاكهة، وهذه القياسات توفير نظرة الآلية الجزيئية في الرابط بين وظائف المناعة والسلوك.

1. قياس النشاط الحركي والنوم في الذباب

  1. وقد وصفت الإعداد المستخدمة لقياس النشاط الحركي والنوم في الذباب، والذي يتضمن رصد نشاط ذبابة الفاكهة النظام (DAM2، Trikinetics)، وحاضنات، غرفة مظلمة، وإعداد حيوانات التجارب ومواسير النشاط، سابقا 6. يتم استخدام نفس النهج هنا، مع بعض التعديلات الطفيفة.
    1. يتم التحكم في الإضاءة من الحاضنة من قبل الحاضنة نفسها. ولذلك، فمن المهم لمزامنة إعداد الوقت بين الكمبيوتر والحاضنات.
    2. يتم تنظيف أنابيب النشاط لإعادة استخدامها من قبل الغليان على طبق ساخن في دي المتأينة المياه. يتم إضافة كمية صغيرة من المنظفات ليغلي الأولى، هي أنابيب تشطف جيدا ويغلى مرتين أكثر من ذلك. إذا تم استخدام الغزل لسد أنبوب، يمكن تنظيف أنابيب الأنشطة المستخدمة (التي تحتوي على المواد الغذائية، والشمع، ويطير والغزل) من دون إزالة مسبقة من الغزل.
  2. قبل الشروع في التجربة، قام الثقافات التي تحتوي على مكان العذراء أواخر الذباب في حاضنات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام على التكيف مع الإضاءة التجريبية والظروف البيئية الأخرى. ضوء: تم الظروف المظلمة أو ثابت تستخدم عادة لقياس سلوك النوم. في هذا المثال، يتم تأقلم الذباب إلى الضوء المستمر للقضاء على تأثير الساعة البيولوجية على مدار الساعة على الاستجابة المناعية والسلوك 2،7،8. كما هو موضح في الشكل 1A ، تحميل الذباب يوم 1-4 القديم إلى النشاط DAM2 Trikinetics إلى 6، وسجل مدة لا تقل عن ثلاثة أيام قبل الإصابة.

2. إصابة الذباب مع سلالة من البكتيريا

  1. بروتوكول الموصوفة هنا هي محددة لS. الذابلة، والتي هي من السهل أن تنمو والمحافظة عليها. سوف البروتوكولات على المدى الطويل التخزين وظروف تربية الأنواع البكتيرية الأخرى تختلف. S. يتم تخزين الذابلة في الجلسرين 15-50٪ في C. ° -80 للتحضير للتخزين على المدى الطويل، ومزيج من الثقافة 2 مجلد البكتيرية بين عشية وضحاها (OD 600 = 0،5-1،0) إلى 1 حجم تعقيمها الجلسرين 50٪ في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. وهذا يؤدي إلى تركيز النهائي من الجلسرين 17٪. تخزين أنابيب في -80 ° C. لإعداد قصيرة الأجل في استخدام مصدر البكتيريا، تتخلص من الأسهم المجمدة مع تلميح ماصة معقمة 200 ميكرولتر وتنفيذ خط ثلاثي على لوحة LB أجار. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 و دعلى سبيل المثال؛ C للحصول على مستعمرات معزولة. تخزين لوحة في C. ° 4
    قبل يوم واحد من المقرر العدوى، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة LB أجار مع تلميح ماصة معقمة 200 ميكرولتر ويغرق الطرف في أنبوب الثقافة تحتوي على 5 مل المتوسطة LB. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها، أو ما يصل إلى 16 ساعة داخل الحاضنة في 37 شاكر. ° C و 250 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي قياس تركيز مع الطيف في OD 600. التركيز في هذه المرحلة يتراوح 0،5 حتي 1. إذا كان تركيز عالية جدا، ثقافة فرعية البكتيريا وتنمو لمدة عدة ساعات للحصول على تركيز الأمثل. تنفيذ الإجراء بالقرب من مصدر اللهب. صممت بعض سلالات بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية لوتزرع وتحديد المضادات الحيوية المناسبة لإضافتها إلى المتوسط. S. الذابلة (ATCC # 8100) ليست المقاومة للمضادات الحيوية وبالتالي تزرع في وسط معقم دون المضادات الحيوية. للتحقق من تقنية معقمة، القيام cultu وهميةإعادة البكتيريا دون كمجموعة تحكم.
    الحل لتصيب الذباب يحتوي على البكتيريا (مخفف لOD 600 = 0.1) و 1٪ تلوين الطعام (بريليانت الأزرق FCF) في برنامج تلفزيوني. إعداد الحل للسيطرة حقن عن طريق إضافة مبلغ يعادل المتوسطة LB المستخدمة في حل العدوى و1٪ تلوين الطعام الأزرق في برنامج تلفزيوني. تخزين الحلول على الجليد.
  2. إعداد الإبر لحقن الزجاج الذباب. سحب الزجاج الشعيرات الدموية (OD = 1 مم، رقم = 0.58 مم، WPI) إلى تلميح غرامة باستخدام مجتذب micropipette (Narishige). تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط غرامة لكسر قبالة رأس الإبرة بحيث يكون الافتتاح كبيرة بما يكفي لملء مع السائل الحقن من خلال تطبيق الشفط مع حقنة، ولكن صغيرة بما يكفي للحد من الأضرار التي لحقت ذبابة أثناء عملية الحقن. بعد كسر الطرف، ينبغي أن يكون حجم تلميح حوالي 40-50 ميكرومتر. يتم إرفاق الإبرة إلى حقنة زجاجية بلاستيكية 3 سم مكعب بطول الأنابيب. يتم التحكم في تدفق المتوسطة الحقن يدويا تطبيق الضغط الايجابي أو Suction مع الحقنة. تجنب تلوث أنابيب المطاط مع السائل الحقن، ويستخدم الجهاز حقنة لكل من العدوى والحقن السيطرة.
  3. تخدير الذباب من خلال وضعها على وسادة 2 CO. يتم تمرير CO 2 إلى وعاء مختوم من الماء لترطيب لوحة والحد من الكهرباء الساكنة، والتي يمكن التلاعب تعقيد من الذباب على لوحة. حقن الذباب من قبل بدس الإبرة الزجاج في المنطقة فوق scutellum من القفص الصدري الظهري. يتم التحقق من مرور المتوسطة الحقن في الطيران من قبل تلوين الطعام - الذباب الأزرق بدوره، في ظل انتشار تلوين الطعام من خلال النظام. ويمكن قياس جرعة من البكتيريا التي تحصل الذباب كما هو موضح في القسم 3 أدناه. بعض التصاميم التجريبية وتشمل المجموعة الضابطة التي تتلقى إصابة الذباب العقيم عن طريق حقن مع تلوين الطعام وPBS ولكن من دون البكتيريا.

3. تحديد الحمل البكتيري

نهج واحد لevaluatinز الاستجابة المناعية ضد العدوى البكتيرية هي تحديد آخر الحمل البكتيري العدوى. D. الدروسوفيلا هو نموذج عظيم لتحديد هذه المعلمة لأنه يمكن المتجانس الطاير كله لتقدير أعداد الكلي للبكتيريا داخل الفرد. الأساس المنطقي وراء هذا البروتوكول هو أنه عندما نمت على وسيط الصلبة مثل مرق لوريا (LB) أجار على طبق بتري (لوحة LB)، جرثومة واحدة تشكل مستعمرة مرئية مميزة. ولذلك، من خلال التجانس الذباب المصاب في وسط سائل LB، وتوليد التخفيفات التسلسلي للجناسة، ونشر لوحات جناسة المخفف على LB، يمكن تحديد عدد الخلايا البكتيرية اصابة ذبابة. وينبغي استخدام مجموعة مراقبة من الذباب مع حقن التلوين PBS والغذاء ولكن من دون التحقق من أن البكتيريا لم الملوثة العدوى البكتيرية مع الأنواع الأخرى. يجب أن يكون هناك مستعمرات على لوحة LB أجار في هذه الحالة.

  1. الأوتوكلاف جميع المواد التي سيتم استخدامها لهذاالإجراء قبل تنفيذ الخطوة التجانس الفعلي. هذه تشمل 200 ميكرولتر ماصة نصائح قطع مع مقص، ووسائل الإعلام LB، والمدقات المستخدمة في التجانس. إعداد لوحات عن طريق سكب تعقيمها LB / أجار المتوسطة في أطباق بتري 10 سم معقمة على الأقل قبل 1 يوم المجانسة الذباب.
  2. تخدير وجمع الذباب في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وأنابيب متجر على الجليد.
  3. أداء التجانس بالقرب من اللهب لمنع التلوث. ينصح التجانس التحكم التي تحتوي على الذباب دون الإصابة خاصة عند استخدام سلالة بكتيرية مثل S. الذابلة، والتي ليست مقاومة للمضادات الحيوية. التجانس الحد الأدنى من 2 مجموعات من 10 حالة في كل الذباب التجريبية. يتم تحديد عدد من الذباب المستخدمة في جناسة من قبل المجرب. وقد استخدمت بعض الجماعات المرء أن يطير في جناسة، وهو أمر مفيد لتقييم التباين في الحمولة الجرثومية بين الذباب الفردية 8، في حين أن آخرين قد استخدمت 3-10 الذباب في جناسةللمقارنة عبر راثى أو شرط التجريبية 9-12.
    1. إضافة 400 ميكرولتر المتوسطة LB إلى كل أنبوب microcentrifuge تحتوي على الذباب والتجانس باستخدام محرك الصغيرة ومدقة (Kontes).
    2. باستخدام ماصة معقمة نصائح قطع، المسلسل تمييع 1:10 جناسة بإضافة 20 ميكرولتر المتجانس LB / متوسطة البكتيرية إلى 1.5 ميكرولتر تحتوي على أنبوب microcentrifuge 180 ميكرولتر المتوسطة LB. قطع ماصة نصائح يمنع انسداد الحطام المتطاير من ويضمن أن يتم نقله وحدة تخزين مناسبة.
    3. يتم تحديد عامل تخفيف تجريبيا ويعتمد على التركيب الوراثي لذبابة، والسلالة البكتيرية المستخدمة، وحالة تجريبية. لذباب مصاب نوع البرية مع S. الذابلة، استخدم التخفيفات من 2 أو 1:10 1:10 3 للالذباب المتجانس فورا بعد الإصابة، والتخفيفات من 4 أو 1:10 1:10 5 لالذباب المتجانس 24 ساعة بعد العدوى.
    4. إضافة 100 ميكرولتر LB / متوسطة البكتيرية من هيئة التصنيع العسكريتنتشر أنابيب rocentrifuge يحتوي على التخفيف النهائية والمتوسطة على صفيحة LB باستخدام كرات الزجاج (VWR) لضمان توزيع عادل.
    5. تجاهل كرات زجاجية في حل EtOH 100٪. وضع لوحات LB في حاضنة 37 درجة ° يلة وضحاها.
    6. وكخطوة اختيارية، استخدام نظام التصوير بالضوء المرئي للحصول على صورة لوحات LB (FluorChem 8900؛ Innotech ألفا). عد الأرقام من المستعمرات إما على لوحة نفسها أو من صورة لوحة باستخدام أداة تعتمد على برنامج فوتوشوب (أدوبي فوتوشوب CS3).
    7. حساب عدد مستعمرة تشكيل وحدة في الطيران باستخدام الصيغة: [ن / (N * D * V)] * V؛ حيث n = عدد المستعمرات نمت على لوحة LB؛ N = عدد من الذباب في واحدة مجمعة أنبوب microcentrifuge؛ D = معامل التخفيف، وV = حجم محلول تنتشر على كل لوحة؛ V = حجم الأولي للجناسة.

4. تقييم النوم والبقاء على قيد الحياة بعد الإصابة المدة

  1. إلىالذباب الذي لا تحصد لقياس الحمل البكتيري، مواصلة رصد السلوك لمدة 7-10 أيام. ويتأثر مدة البقاء على قيد الحياة من قبل النمط الوراثي للظروف، ويطير البيئية، والأنواع البكتيرية المستخدمة للعدوى.
  2. بعد 10 يوما ~، إنهاء التجربة، قم بتحميل ومعالجة البيانات السلوكية كما هو موضح سابقا 6. يتم استخدام برامج مخصصة Insomniac2، التي يوجد مقرها في ماتلاب، لتحليل المعلمات النوم. من المهم للقضاء على الذباب الميت من التحليل السلوكي. عادة، وهذا يحد من التحليلات إلى خلال اليوم الأول بعد الإصابة، وهذا يتوقف على نوع الإصابة وراثى الطاير. يشار إلى الموت في مقايسة من قبل جميع التهم الموجهة إليه وقت النشاط وصلت الصفر. لتسهيل تحليل البقاء على قيد الحياة، Drosonex، برامج مخصصة المكتوبة في Microsoft Visual C + + 6.0، يتم استخدامها لمعالجة البيانات الخام الملفات من نظام DAM Trikinetics. التقارير البرمجيات وملفات Excel، ومدة بقاء كل ذبابة (في ساعة)، يجمع النشاط داتلمن جميع المراقبين في جدول واحد، والتقارير في المئة الذباب على قيد الحياة على مر الزمن والتي وضعها المستخدم. تم تصميم ملفات اكسل للاندماج في حزم البرامج الإحصائية الأخرى لمزيد من التحليل.

5. قياس نشاط NFκB خلال العدوى باستخدام الفحص مراسل وسيفيراز

وقد تم توليد الذباب المعدل وراثيا المستخدمة كيلوبايت لوك في هذا الاختبار من قبل كما هو موضح في كو وآخرون، 2010 2. لفترة وجيزة، لمراسل كيلوبايت لوك يحتوي على 8 من تكرار تسلسل ملزم NFκB التي تم إدراجها في المروج المنبع من إطار القراءة المفتوح وسيفيراز.

  1. ضبط الذباب لظروف الإضاءة التجريبية كما هو موضح في القسم 1.2. في هذا المثال، يتم الجمع 1-4 يوم كيلوبايت القديمة لوك الذباب في قارورة تحتوي على السكروز 5٪ و 2٪ أجار المتوسطة الغذائية وضعت في ضوء ثابت (LL) لمدة 2 ايام للوصول الى نفس عمر الذباب الأخرى خلال العدوى.
  2. إعداد صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا لالذباب. كل بئر يحتوي على 2 طبقات من المواد الغذائية المتوسطة (الشكل 2)، والطبقة العليا يحتوي وسيفيرين، الركيزة من وسيفيراز. إضافة 300 ميكرولتر من السكروز 5٪، 2٪ محلول الآجار إلى كل بئر والسماح لترسيخ. المقبل، إضافة على 50 ميكرولتر إلى الطبقة العليا التي تحتوي على كل السكروز بشكل جيد 5٪، 1٪ أجار، و2 مم وسيفيرين (الذهب التكنولوجيا الحيوية، وشركة). وقد اختلفت تركيزات وسيفيرين المستخدمة لقياس النشاط مراسل في ذبابة الفاكهة في الأدب، وكانت منخفضة تصل إلى 100 ​​ميكرومتر 13. يمكن تحديد تركيز المطلوب تجريبيا. بين طبقات الاستغناء الغذاء، وتغطي لوحة بقطعة قماش غرامة شبكة لتسهيل تجفيف مع الحفاظ على العقم. وينبغي أن يسمح لوحة لتجف جيدا، وتصل إلى ساعة واحدة، وذلك لمنع الذباب من أن يعلقوا في قطرات التكثيف. لأن وسيفيرين هو حساسة للضوء، لوحات تجنب تعريض للضوء أكثر من اللازم.
  3. تطبيق لاصقة الفيلم واضحة (أعلىالختم-A؛ بيركن إلمر) إلى لوحة microwell 96-خرم جيدا وباستخدام إبرة رفيعة في كمية من 2 الثقوب لكل بئر. وسوف تسمح هذه الثقوب لا فقط إلى تبادل الهواء كل بئر، ولكن سوف توفر أيضا وسيلة لتخدير الذباب على أساس فردي. باستخدام شفرة حادة وحافة مستقيمة، وإدخال قطع بين كل عمود. هذا وسوف توفر طريقة سهلة لتحميل / تفريغ الذباب في مجموعات من 8 في كل مرة.
    لتحميل الذباب في لوحة microwell، إزالة قارورة من الحاضنة والذباب تخدير على وسادة 2 CO. تحميل الذباب واحدا تلو واحد إلى كل بئر على حدة العمود العمود. يجب أن تطير دون قصد تتعثر لختم لاصقة، وترك الطاير وحده لأنها غالبا ما تكون قادرة على تحرير نفسها دون تدخل. العودة إلى لوحة microwell الحاضنة في LL 8-24 ساعة لللتكيف مع البيئة الجديدة وتستهلك الركيزة وسيفيرين.
  4. البكتيريا الثقافة، S. الذابلة، وإعداد حل للعدوى كما هو موضح أعلاه.
  5. تخدير ريطير باستخدام تلميح micropipette تعلق على خط الضغط المنخفض 2 CO. وضع تلميح micropipette مباشرة فوق فتحات التهوية التي لكل بئر. أخذ الحيطة والحذر للتأكد من أن ضغط CO 2 مرتفع بما يكفي لتخدير الطاير، ولكنها منخفضة بما يكفي لتجنب إصابة الطاير. في مجموعات من ثمانية، ونقل كل على حدة تطير إلى لوحة 2 CO، وتصيب كما هو موضح أعلاه. بعد الإصابة، والعودة إلى كل ذبابة الأصلي بشكل جيد وختم على صفيحة ميكروسكوبية.
  6. التلألؤ التدبير (TopCount-NXT التلألؤ ومكافحة التألق؛ بيركن إلمر-). العداد التلألؤ TopCount يحتوي على راديو كاسيت التراص لوحات، والذي يسمح للقراءات والمبرمجة الآلي بشكل مستمر في الزيادات المطلوبة لأية فترة من الوقت (عادة ما يصل إلى خمسة أيام). هذه الميزة غير متوفرة في جميع الصكوك، وجمع البيانات اللازمة لإجراء التجارب مع أدوات أخرى قد تكون بالتالي أقل تواترا. يقع العداد التلألؤ في ريال عمانيأم مع حرارة يتم التحكم فيها وجدول الإضاءة. عند تحميل لوحات التراص في الكاسيت، كومة لوحات تحتوي على لوحات فارغة بين الذباب واضحة لضمان تلقي الضوء الذباب. برنامج luminometer وفقا لمواصفات الشركة المصنعة لجمع قراءات كل ساعة لمدة لا تقل عن 24 ساعة. في هذا المثال، يتم برمجتها للكشف عن قراءة كل بئر لمدة 10 ثانية والنتيجة كما تعبر عن التهم (وحدات التعسفي) في الثانية الواحدة. وبلغ متوسط ​​قيمة هذه القراءات عبر 3 لكل بئر. تصدير ملفات البيانات إلى جدول بيانات وإجراء تحليل القياسية، الرسوم البيانية نتائج التلألؤ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. العدوى تعزز النوم. في هذا المثال ، تم تحميل الذباب البري من النوع البري في كانتون-S (CS) والذباب المتحور الذي يفتقر إلى جين NFκB ، Relish (RelE20) 14 ، في جهازي مراقبة نشاط DAM2 (ن = 32 لكل نمط جيني) وأصيبوا كما هو موضح أعلاه. تم الحفاظ على الذباب في ضوء مستمر للقضاء على تأثير الساعة البيولوجية على السلوك والعدوى2،7،8. تم تزوجين طفرات RelE20 إلى CS كما هو موضح سابقا11. أصيبت كلتا المجموعتين من الذباب ب S. marcescens والنتائج موضحة في الش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يحدد هذا النهج للتحقيق في كيفية السلوك، ولا سيما النوم، يرتبط المعلمات الاستجابة المناعية. وتشمل هذه المعايير الحمل البكتيري، نتيجة بقاء، والنشاط كما تقاس NFκB مراسل وسيفيراز في الجسم الحي. معا هذه المعلمات توفير المعلومات حول مدى ذبابة يمكن محاربة العدوى. الحمل البكتيري والنتيجة هي بقاء المعلمات الاستجابة المناعية التي تنطوي على قياس واضحة في ذبابة الفاكهة. الرطوبة E20 المسوخ، والتي تفتقر إلى عامل النسخ NFκB التي هي أمر محوري في الاستجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية في إطار منحة # IOS-1025627 وقبل المعاهد الوطنية للصحة في إطار منحة # 1R21NS078582-01 إلى JAW

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم المادة شركة كتالوج رقم تعليقات
معدات
حاضنات بيرسيفال العلمية، وشركة I30BLLC8
I36VLC8 		أي حاضنة قادرة على تشغيل ضوء المبرمجة / جداول درجة الحرارة المناسبة.
ذبابة الفاكهة Activitiy شاشات Trikinetics شركة، التايم، MA DAM2 كما هو موضح في مكان آخر 6، يتطلب هذا النظام واجهة الكمبيوتر، والبرمجيات، وغيرها من الملحقات.
بيركس زجاج أنابيب Trikinetics شركة، التايم، MA PGT-5x65
التلألؤ صفيحة ميكروسكوبية ومكافحة التلألؤ بيركن إلمر TopCount NXT
12 كاشف 		ويمكن استخدام أي قارئ صفيحة ميكروسكوبية قادرة على اكتشاف التلألؤ لهذا النوع من الفحص مراسل. TopCount يحتوي على أجهزة الكشف عن عدة ومكدس الآلي، بل هو قادر على المبرمجة لقراءة لوحات باستمرار من متعددة.
FluorChem 8900 ألفا Innotech التصوير الثقافات البكتيرية اختيارية؛ أي نظام التصوير الرقمي مع القدرة البصرية ضوء كافية.
Micropipette بولير Tritech البحوث، وشركة Narishige PC-10
مؤن
البورسليكات الزجاج الشعيرات العالم آلات دقيقة شركة 1B100F-4
3 مل الحقنة فيشر العلمية BD 305482
حقنة الإبر فيشر العلمية BD 305196 18 غرام - قطع رأس الإبرة لمنع تلف الأنبوب.
أنابيب السيليكون، رقم (0.030 ") التطوير التنظيمي (0.065" سمك الجدار) (0.018 ") VWR 60985-706 تستخدم لربط الإبر الزجاج الشعرية لحقنة
3 طريقة محبس Pharmaseal شركة أمريكية K75
Kontes بيليه مدقة للسيارات اللاسلكي فيشر العلمية K749540-0000
Kontes بيليه مدقة فيشر العلمية K749521-1590
كرات زجاجية 3MM VWR 26396-630
صفيحة ميكروسكوبية Microlite 1 + الحرارية العلمية 7571 سلك96-T وحات جيدة تتناسب التلألؤ - يجب أن تكون مبهمة.
TopSeal :96-A-Microplates جيدا PerkinElmer 6005185 صفيحة ميكروسكوبية الصحافة، وفي فيلم لاصق ختم
D-وسيفيرين وملح البوتاسيوم الذهب التكنولوجيا الحيوية، وشركة LUCNA
البرمجيات
Insomniac2 متوفرة عند الطلب للمؤلفين مخصص؛ أشمور كتبها ليزلي، دكتوراه (وستمنستر كلية) MATLAB البرمجيات القائمة التي استخدمت بشكل روتيني لتحليل النوم 2،6،11
Drosonex متوفرة عند الطلب للمؤلفين مخصص؛ Coradetti كتبها توماس (برمجيات الرصيف) A PC MSVC6 برنامج يستخدم لتحليل البقاء على قيد الحياة من ملفات البيانات الخام التي تم جمعها معTrikinetics النظام
فوتوشوب CS3 لبن المفيدة للحصول على أرقام لوحة / كفو من الصور الرقمية (اختياري)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
  2. Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7(2009).
  4. Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
  5. Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305(2008).
  6. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).
  7. Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
  8. Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).
  9. Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
  10. Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
  11. Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
  12. Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
  13. Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
  14. Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
  15. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
  16. Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
  17. Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
  18. Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
  19. Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
  20. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
  21. Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  22. Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
  23. Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
  24. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1(2002).
  25. Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150(2009).
  26. Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
  27. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
  28. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  29. Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
  30. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  31. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Immune ResponseSleep MeasurementBacterial ClearanceNF Kappa B ActivityLocomotor Activity MonitoringSurvival AssayColony Forming UnitsLucifer Reporter TechniqueConstant Light ConditionsFly Infection Protocol

مقالات ذات صلة