مقالة منهجية

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

10.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4357

⸱

سبتمبر 29, 2014

 ,  ,  , 
1Penn Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول، ث ه التعرف على السكان رواية من خلايا تشبه الخلايا الصباغية (المعروف أيضا باسم الخلايا الصباغية القلب) في قلوب الفئران والبشر التي تساهم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني يتسبب في الفئران.

الملخص

حددنا عدد سكانها رواية من خلايا تشبه الخلايا الصباغية (المعروف أيضا باسم الخلايا الصباغية القلب) في قلوب الفئران والبشر التي تساهم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني المشغلات في الفئران. للتحقيق في الخواص الكهربائية والبيولوجية للخلايا الميلانين القلب وضعنا الداخلي لعزلهم من قلوب الماوس أننا المستمدة من تلك المصممة لعزل العضلية الفئران حديثي الولادة. من أجل الحصول على الخلايا الصباغية القلب صحية مناسبة لالمشبك التصحيح أكثر اتساعا أو الدراسات البيوكيميائية، وضعنا إجراء المكرر لعزل وطلاء الخلايا الصباغية القلب بناء على تلك المصممة أصلا لعزل الخلايا الصباغية الجلدية. ويتجلى هذا الإجراء المكرر في هذا الاستعراض، وتنتج أعدادا أكبر من خلايا تشبه الخلايا الصباغية الصحية التي يمكن مطلية حيث يبلغ عدد سكانها النقي أو مع العضلية.

المقدمة

حددنا مؤخرا سكان الخلية رواية في قلب الفئران والبشر التي تعبر عن الانزيمات الميلانين التوليف وشكليا تشبه الخلايا الصباغية الجلدية. كنا نسميها "الخلايا الصباغية القلب" وجدت هذه الخلايا كانت موجودة في مواقع تشريحية من عدم انتظام ضربات القلب الأذيني مشغلات التي غالبا ما تنشأ في البشر. وجدنا أيضا تساهم الخلايا الصباغية إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني في الفئران مع حذف سلالة الجرثومية من محول جيب التمام. وتوزع الخلايا الصباغية القلب قليلة في جميع أنحاء الأذين الماوس حيث أنهم يشكلون أقل من 0.1٪ من مجموع خلايا الأذيني. للتحقيق في الخواص الكهربائية والبيولوجية للخلايا الميلانين القلب وضعنا الداخلي لعزلهم من القلب الماوس باستخدام علامات محددة الصباغية جنة المساواة العرقية، محرض. وقد وضعت لدينا الإجراء الأولي من تلك المستخدمة لعزل العضلية الفئران حديثي الولادة وأسفرت عن أعداد صغيرة جدا من الخلايا مناسبة للتسجيلات المشبك التصحيح أو تحليل PCR. ومع ذلك، من أجل تحسين شفاءعشر وبقاء الخلايا الصباغية القلب، لأكثر تعمقا تحليل الكهربية أو الدراسات البيوكيميائية، وضعنا إجراء المكرر من تلك المصممة لعزل الخلايا الصباغية الجلدية. الإجراء الموضح وأظهرت في هذا الاستعراض في الاستفادة من إنتاج الخلايا الصباغية صحة القلب التي يمكن مطلية حيث يبلغ عدد سكانها النقي أو مع العضلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الحلول اللازمة والمعدات

  1. أولا، تعقيم الأدوات الجراحية (ملقط مستقيمة الشكل، الشكل المنحني ملقط، مقص شكل مستقيم، ومقص الشكل المنحني) بواسطة التعقيم لمدة 15 دقيقة. في درجة حرارة 121 مئوية. 2 إعداد مجموعات من الأدوات، حيث يتم استخدام مجموعة واحدة للتشريح من قلوب ومجموعة أخرى سيتم استخدامها لتنميق تصل الأنسجة.
  2. حل 1 علبة MCDB153 سائل الإعلام والثقافة في 900 مل من تعقيمها، الماء المصفى ويقلب ببطء حتى يذوب المسحوق. إضافة 1.2 ز بيكربونات الصوديوم، أو 15.7 مل من محلول بيكربونات الصوديوم [7.5٪ ث / ت]، لكل لتر من الحجم النهائي من المتوسط ​​الذي يجري إعداده ويحرك حتى يذوب. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 بإضافة إما 1 N 1 N حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم، ثم صب وسائل الإعلام من خلال كبار مرشح 0.2 ميكرومتر زجاجة تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية). ثم جمع وسائل الإعلام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد ملاحقإضافة إلى وسائل الإعلام ثقافة (قائمة المواد). يجب إضافة ملاحق إلى وسائل الإعلام قبل هناك حاجة إلى وسائل الإعلام لطلاء الخلايا.
  4. إعداد DPBS مع 10٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
  5. المقبل، إعداد محلول التربسين 0.25٪ بإضافة 0.25 غرام من التربسين (البنكرياس الأبقار، النشاط> 2،500 USP وحدة / ملغ، عالى النقاء. USB) إلى 100 مل من DPBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
  6. المعدات المطلوبة الأخرى اللازمة لإتمام هذا الإجراء تشمل stereomicroscope، أطباق بتري (10 سم)، أنابيب مخروطية 50 مل، مصافى الخلية 40 ميكرومتر، DPBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية، أطباق ثقافة 60 ملم وأطباق ثقافة 35 ملم.

2. عزل قلوب من الأطفال حديثي الولادة ماوس الجراء

  1. أولا، يجب الحصول على P0 P2 الماوس الجراء حديثي الولادة (ن = 6 إلى 8). فمن المستحسن استخدام الجراء الناتجة عن تربية DCT-لجنة المساواة العرقية الإناث مع الذكور متماثلة اللواقح التي هي متخالف سواء لR26R: EYFP أليل أو Z / EG أليل لتسميةخلايا تشبه الخلايا الصباغية. كلا R26R: تتوفر من جاكسون مختبرات (أرقام الأسهم و006148 003920 على التوالي) EYFP وZ / EG الفئران.
  2. المقبل، الموت ببطء الجراء الماوس حديثي الولادة، يمسح صدورهم مع مسحة الكحول ثم وضع الجراء في 10 سم طبق بتري مع DPBS.
  3. قطع الجلد فوق الصدر والقص مع ملقط معقم ومقص ثم فتح الصدر بعناية تحت stereomicroscope. قلوب الجراء الماوس حديثي الولادة صغيرة جدا لذا كن حذرا للتأكد من إزالة قلب كامل مع الأذينين المرفقة.
  4. غسل قلوب في DPBS ونقلها إلى طبق بتري 10 سم الجديد.

3. الأنزيمية الهضم

  1. جلب طبق بيتري مع قلوب رفعه إلى نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) ثم اتبع الخطوات التالية باستخدام تقنيات معقمة في غطاء محرك السيارة.
  2. أولا، وغسل قلوب ثلاث مرات في DPBS معقمة بالإضافة إلى المضادات الحيوية.
  3. وضع قلوب (ن = 6-8) في60 ملم صحن الثقافة وإضافة 6-8 مل من 0.5٪ محلول التربسين إلى الطبق.
  4. المقبل، وقطع القلوب الى قطع صغيرة (أقل من 1 ملم في الحجم)، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  5. بعد فترة حضانة كاملة، صب المحلول الناتج من الأنسجة القلبية والتربسين من الطبق إلى العقيمة أنبوب مخروطي 50 مل.
  6. ثم، وذلك باستخدام ماصة معقمة 10 مل، بسرعة ولكن بلطف، ويسحن الحل في أنبوب مخروطي 50 مل 30-50 مرات.
  7. تصفية المحلول الناتج من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على رأس ونظيفة أنبوب مخروطي 50 مل جديد لجمع الرشاحة.
  8. المقبل، الطرد المركزي أنبوب 50 مل في 240 ز س في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، نضح بلطف وطاف resuspend الكرية المتبقية في 6-8 مل من DPBS العقيمة. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر. هذه الخطوة الكريات في myocytes القلب الأذيني والخلايا الصباغية ولكن لا اسقاط فايbroblasts منذ الليفية هي أصغر وستبقى في طاف.

الخلايا الصباغية القلب 4. تصفيح شبيهة

  1. بعد شطف الثالث بعد الطرد المركزي، واستنزاف بعناية أو نضح قبالة محلول الغسيل (DPBS) و resuspend بيليه في 6 مل من وسائل الإعلام ثقافة MCDB التي تمت إضافتها الملاحق.
  2. الآن، واستخلاص الحل معلق في نقل ماصة معقمة ووضع الخلايا في صحن 35 ملم، أو في بئر من لوحة 6 جيدا، وتجميع خلايا القلب معزولة من 3 الفئران حديثي الولادة في واحد 35 ملم طبق أو أيضا.
  3. احتضان الأطباق ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، نضح من وسائل الإعلام الثقافة جنبا إلى جنب مع أي خلايا غير مرتبط ثم شطف الأطباق مرة واحدة مع DPBS. ثم إضافة وسائط جديدة للوحات واستبدال وسائل الإعلام كل يوم 2. خلايا معزولة من قلوب الأطفال حديثي الولادة أو الجنينية يمكن الحفاظ في الثقافة لمدة تصل إلى 3 أسابيع، في حين أن الخلايا المعزولة من يسمع الكباريمكن الحفاظ TS في الثقافة لمدة تصل إلى 10 يوما.

الخلايا الصباغية 5. عزل القلب مثل القلب من الكبار ماوس

  1. أولا، إزالة قلوب من الفئران الناضجة (3-4 أسابيع من العمر، ن = 3) من خلال القص منتصف الخط بعد إعطاء الهيبارين 100 U داخل الصفاق للفئران ثم القتل الرحيم لهم. فمن المستحسن استخدام بنتوباربيتال إلى الموت ببطء الفئران لهذا الإجراء، ولكن هذا الدواء غير متوفر في جميع المواقع.
  2. المقبل، وغسل قلوب رفعه في DPBS العقيمة التي تحتوي على المضادات الحيوية في نسيج الثقافة هود (مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية). ضغط على قلوب قليلا مع ملقط تشريح المنحنية لإزالة أي الدم المتبقي منها ثم شطف قلوب في DPBS مرة أخرى.
  3. إزالة الأذينين وبالطوق الأذينية البطينية من قلوب (هذه الهياكل تحتوي على خلايا تشبه الخلايا الصباغية) ووضع عينات الأنسجة رفعه في صحن 35 ملم.
  4. قطع قلوب الى قطع صغيرة باستخدام مقص منحني القوة وملاحظة ثم قم بإضافة 6-8 مل من 0.5٪ محلول التربسين إلى الطبق. ثم احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
  5. الآن، اتبع الخطوات من الإجراء أعلاه بدءا من الخطوة 3.6 وما بعده.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بروتوكول الموضحة في هذه المقالة هي تقنية محسنة مقارنة مع واحد ونحن سبق نشرها لعزل الخلايا الصباغية القلب من القلب الفئران. يستخدم هذا الإجراء استخدام علامات الفلورسنت يقودها الميلانين انزيم معين لجنة المساواة العرقية-recombinase لتسمية خلايا تشبه الخلايا الصباغية القلب. من المهم استخدام علامة لتسمية الخلايا الصباغية القلب عند العمل مع الخلايا الجنينية أو الوليدية المعزولة حديثا، منذ الاختلافات الشكلية التي تميز الخلايا الصباغية من myocytes القلب الأذيني لم تتطور بعد (الشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخلايا الصباغية القلب موجودة في مواقع التشريحية داخل القلب التي تعطي عادة يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني المشغلات. وتشمل هذه المناطق الأوردة الرئوية، وبالطوق الأذينية البطينية، والأذين الأيسر الخلفي والثقبة البيضوية (الشكل 4). لفهم الدور الذي تقوم به هذه الخلايا في arrhythmogenesis، ونحن نطور التقنيات لعزلهم ودراسة علم وظائف الأعضاء. ومع ذلك، أدركنا أن تحسين هذه التقنية لانتاج كميات من شأنه صحة وأكبر من الخلايا الصباغية القلب تسمح مزيد من الدراسات للتحقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL105734 إلى VVPMDL ويدعم، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للبحوث الصحية الوظيفي جائزة K08 HL094748. VVP هو باحث المبتكر من جمعية القلب الأميركية بدعم من منحة 11IRG900384.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MCDB 153Sigma-AldrichM7403يُذاب في الماء
DPBS، بدون كالسيوم وبدون مغنيسيومInvitrogen14190136تركيز المخزون: 1x
تركيز التشغيل: 1x
البنسلين-ستريبتومايسينInvitrogen15140163تركيز المخزون: 100x
تركيز التشغيل: 1x
مصل جنين البقرLife TechnologyCertifiedتركيز التشغيل: 4%
TPASigma-AldrichP1585يُذاب في DMSO
تركيز المخزون: 3.2 μM
تركيز التشغيل: 32 nM
ترانسفيرينSigma-AldrichT8158يُذاب في DPBS
تركيز المخزون: 0.1 mg/ml
تركيز التشغيل: 1 μg/ml
ديبوتيريل cyclic AMPSigma-AldrichD0627يُذاب في DPBS
تركيز المخزون: 0.5 mM
تركيز التشغيل: 5 μM
إنسولينSigma-AldrichI6634يُذاب في حمض الأسيتيك بتركيز 10 mM
تركيز المخزون: 1 mg/ml
تركيز التشغيل: 5 μg/ml
Basic FGFBD Biosciences354060يُذاب في الماء
تركيز المخزون: 4 ng/μl
تركيز التشغيل: 4 ng/ml

المراجع

  1. Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
  2. Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
  3. Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
  4. Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
  5. Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
  6. Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
  7. Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
  8. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
  9. Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
  10. Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DPBS 40 Patch Clamp

مقالات ذات صلة