ونحن نقدم طريقة جديدة للحفاظ على الغشاء المخاطي المعوي الإنسان في الثقافة ورصد استجابة لأنواع مختلفة من المحفزات أكثر من 24 ساعة على الأقل. مع أسلوبنا، يتم الحفاظ على قطبية من الأنسجة، والسماح لالتحفيز الفسيولوجية عبر الطريق القمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وجود عدد قليل من النماذج حاليا لمحاكاة واقعية أمعاء الإنسان المجمع الجزئي للبيئة، حيث مجموعة متنوعة من التفاعلات تأخذ مكان. التوازن السليم يعتمد بشكل مباشر على هذه التفاعلات، لأنها تشكل استجابة مناعية بأكمله يحفز التسامح ضد المستضدات الغذائية بينما في الوقت نفسه تصاعد الاستجابات المناعية فعالة ضد الميكروبات المسببة للأمراض بلعها عن طريق الخطأ مع الغذاء.
هو الحفاظ على توازن الأمعاء أيضا من خلال مختلف التفاعلات المعقدة بين مجهريات البقعة (بما في ذلك المواد الغذائية المرتبطة السلالات البكتيرية النافعة) والدولة المضيفة، التي تنظم المرفقات / تدهور مخاط، وإنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات من حاجز الظهارية، و "التعليم" من الخلايا الظهارية 'التي تسيطر على النمط الظاهري مولد للتحمل أو مناعة فريدة من نوعها، الأمعاء مقيم الخلايا اللمفاوية' السكان. وكانت هذه التفاعلات حتى الآن صعبة للغاية مع تكرار في فحوصات المختبرسواء باستخدام خطوط خلايا مستنبتة أو الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس تختلف اختلافا جوهريا في مكونات الغشاء المخاطي المعوي (منظمة طبقة المخاط، المجتمع البكتيريا المتعايشة) مع الاحترام لأمعاء الإنسان. وهكذا، كانت دراسات من مجموعة متنوعة من العلاجات في المثول في عيادات للظروف المهم المرتبطة بالتوتر أو المرضية مثل متلازمة القولون العصبي، مرض التهاب الأمعاء أو سرطان القولون والمستقيم من الصعب القيام بها.
لمعالجة هذه القضايا، ونحن وضعت نظاما الرواية التي تمكننا من حفز إإكسبلنتس من الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية التي تحتفظ بها تكييف في الموقع من قبل مجهريات البقعة المضيفة والاستجابة المناعية، بطريقة الاستقطاب. التحفيز قمية الاستقطاب هو من أهمية كبيرة بالنسبة لنتائج أثارت استجابة مناعية. وقد تبين مرارا وتكرارا أن نفس المحفزات يمكن أن تنتج استجابات مختلفة تماما عندما تجاوز وجه قمية من برنامج التحصين الموسع المعويةحلمة، وتحفيز الخلايا الظهارية basolaterally أو ملامسة مباشرة مع مكونات الصفيحة المخصوصة، والتحول من النمط الظاهري مولد للتحمل لمناعة والتسبب في التهاب غير الضرورية والمفرطة في المنطقة.
حققنا التحفيز الاستقطاب من قبل الإلتصاق اسطوانة الكهف الذي محدد مجال التحفيز على وجه قمية من الغشاء المخاطي كما سيتم موضح في البروتوكول. استخدمنا هذا النموذج لدراسة، من بين أمور أخرى، والآثار التفاضلية من ثلاث سلالات البكتريا المكونة مختلفة. وتبين لنا أن هذا النموذج هو نظام قوي جدا لتقييم الخصائص المناعية من البروبيوتيك في ظروف صحية والمرض.
البروتوكول
1. الحصول على وإعداد الأنسجة
- يتم الحصول على الأنسجة (صحية أو مرض التهاب الأمعاء المخاطي) أثناء الجراحة. مرة واحدة يتم رفعه العينة نقل إلى المختبر في أسرع وقت ممكن، والحفاظ عليها في كا + + / + المغنيسيوم العازلة HBSS مجانا +-تستكمل مع القلم / بكتيريا في 4 درجات مئوية أو على الجليد.
* حجم العينة يعتمد على توافر النسيج: جزء من الأنسجة التي تم الحصول عليها، هو حصرا ما ليست هناك حاجة للتشخيص ويمكن أن تختلف بشكل كبير بين الاشخاص الاصحاء ومرض التهاب الأمعاء. يتم استئصاله الأنسجة السليمة من المرضى الذين يخضعون لجراحة لسرطان القولون.
- غسل الأنسجة بلطف وتنظيفه من جميع المواد المساريقي. فصل طبقة الغشاء المخاطي من تحت المخاطية باستخدام مقص العقيمة وملقط مع الحفاظ على الأنسجة العازلة في HBSS في طبق بتري (وليس بالضرورة immerged). تلمس سطح الغشاء المخاطي مع ملقط أقل قدر ممكن.
- قطع الغشاء المخاطي في المشارب لا يقل عن 1 جمترا وأطول فترة ممكنة. استخدام اثنين من المشارط معقمة، بكثير كما لو كنت قطع المواد الغذائية الخاصة بك.
- غسل تنظيف الغشاء المخاطي بلطف في HBSS وتمديده على طبق بيتري مع الجانب قمية متجهة لأعلى.
2. تركيب الأنسجة
- إعداد متوسطة جديدة (tisDMEM). استخدام DMEM تستكمل مع الجلوتامين (2 ملم) وNaPyr (1 ملم)، وإضافة 15٪ FBS نا (الجنين المصل البقري - أمريكا الشمالية)، 1٪ ITS-X و 200 نانوغرام / مل EGF في وقت الاستخدام.
- ملء سم طبق بتري 10 مع بقية FBS نا (استخدام حوالي 30 مل بحيث تكون مغمورة تماما شبكات معدنية) وغمر شبكات معدنية. الحفاظ على لوحة فتح ودعم اسطوانات من البلاستيك على الصنبور لها.
* مصنوعة من شبكات معدنية من الحديد. شبكة هو على شكل مربع مع جانب من 0.5 مم.
- يستغرق 3 ميكرولتر من الغراء الجراحية مع 10 أو 20 ماصة ميكرولتر. تطبيقه بعناية إلى واحد من الحدود من اسطوانة بلاستيكية في حين عقد ذلك [ف]IRM مع ملقط.
- وضع بلطف الاسطوانة على الجانب قمية من الغشاء المخاطي، أقرب إلى واحد من حدود قطاع ممكن.
- لإتاحة الوقت الغراء لنعلق بحزم الاسطوانة على النسيج، وإعداد مركز جيدا الجهاز لوحة ثقافة: الاستغناء عن 850 مل ميكرولتر-1 من المتوسطة في مركز جيد ودعم الشبكة المعدنية على حواف لوحة المركزي أيضا.
- قطع بعيدا الأنسجة الزائدة عن الحدود من الاسطوانة باستخدام اثنين من المشارط معقمة كما كان من قبل.
- رفع بلطف الاسطوانة مع النسيج المرفقة ووضع الجانب basolateral على شبكة معدنية في وسط اللوحة.
3. تنبيه
- استخدام المنبهات من اختيارك في تركيز المفضل لديك.
- تطبيق حجم مناسب في وسط الاسطوانة البلاستيكية دون إزعاج اسطوانة أو على سطح المخاطية مع طرف ماصة. تأكد من حجم اخترتها يغطي بشكل موحد على السطح داخل الاسطوانة. فيأحجام dicated:
كبير الاسطوانة البلاستيكية: 200 ميكرولتر
متوسطة البلاستيك اسطوانة: ميكرولتر 100
اسطوانة بلاستيكية صغيرة: 50 ميكرولتر - احتضان لمدة تصل إلى 3 ساعة في حاضنة التقليدية.
* إذا كنت ترغب في احتضان للحصول على نقاط وقتا أطول، تأكد من استخدام حجم أصغر بكثير من المحفزات (10-20 ميكرولتر) ووضعه مباشرة على الأنسجة في جو من 100٪ O 2 في ضغط 1 ATM (انظر 3.5) .
- خذ المتوسطة مع المحفزات من السطح القمي في الأنسجة وعدم استبدال مع متوسطة جديدة، وذلك لأن الأنسجة لا تحصل على ما يكفي O 2 إذا طبقة سميكة من المتوسطة على وجه قمي يمنع تبادل الغازات. تغطية لوحة.
- وضع الأنسجة في جو من 100٪ O 2 في ضغط 1 ATM.
4. حصاد
- بعد 24 ساعة من إجمالي الوقت للثقافة (± 2.5 ساعة) إزالة بعناية الاسطوانة من اله الأنسجة بمساعدة مشرط كشط بلطف الغراء قبالة وتخزينه اعتمادا على التحليل المطلوب (إصلاح لالمناعية و / أو المقايسات المناعي، أو تجميد المفاجئة في N2 السائل لتنقية RNA والجينات التنميط التعبير أو تنقية البروتين والمقايسات لطخة غربية ).
- حصاد المتوسطة basolateral للخلوى إفراز التنميط. الطرد المركزي في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق لتكوير الحطام، ونقل طاف في أنبوب إيبندورف (بدلا من قسامة) وتخزينها على الفور في -20 درجة مئوية.
* إذا كنت تريد أن تبقي supernatants لفترة أطول، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نجحنا في الحفاظ على الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية السليمة وIBD في الثقافة لمدة 24 ساعة على الأقل الحفاظ على رفاهية الأنسجة. وفقا للملاحظات السابقة 1، وكان هذا ممكنا إلا إذا أخذت معظم الوقت ثقافة (لا يقل عن 85٪ من المجموع) في مكان O 2، والنسيج لم البقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة في الحاضنات التقليدية (الشكل 2). لقد أظهرنا أيضا أن استجابات مختلفة من إإكسبلنتس يمكن ملاحظتها على هذا النموذج اعتمادا على قطبية من التحفيز (قمية مقابل basolater...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم التأكيد على الحاجة إلى النماذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي علاجات لمخاطية الأمعاء الإنسان يمكن اختبارها بصورة صحيحة طويلة. وقد حدد كثير من الباحثين التحف والعيوب المحتملة في كل خلية 5 و 6 نماذج الماوس المستخدمة حتى الآن لهذا الغرض. في الواقع، حتى لو تم الحصول على بيانات قبل السريرية الواعدة في كثير من الأحيان، وهذه نادرا ما يترجم إلى فائدة سريرية كبيرة.
الطريقة الموضحة في هذ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر اريكا Mileti حصول على الدعم الفني ممتاز والدكتور أنطونيو دي Sabatino لتوفير غرف الأكسجين.
التمويل: وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج الاتحاد الأوروبي 7 إطار (IBDase، ERC: Dendroworld) وFONDAZIONE Cariplo إلى MR والدعم من قبل شبكة كوري التنقل الدولي للتدريب ماري (عبر الحديث، اتفاقية منحة رقم: 21553-2) إلى KT.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكواشف | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| المواد | |||
| أسطوانات استنساخ 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| أسطوانات استنساخ 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| أسطوانات استنساخ 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| شبكات معدنية | صناعة منزلية | ||
| طبق استزراع أعضاء بوسط مركزي | BD Falcon | 353037 | |
| غراء جراحي (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| جرار أكسجين | صناعة منزلية | ||
| خزانات أكسجين | Air Liquid Sanità |
المراجع
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056(2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
