مقالة منهجية

تشريح والثقافة، وتحليل

13.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4377

⸱

ديسمبر 23, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.

الملخص

العملية التي من خلالها المنطقة الأمامية من لوحة تثير العصبية في الشبكية الفقارية لا يزال يشكل محورا رئيسيا من البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. بالإضافة إلى أهمية واضحة الطبية لفهم وعلاج مرض الشبكية، وتطوير شبكية العين الفقارية تواصل لتكون بمثابة نظام نموذجا هاما وأنيقة لفهم الخلية العصبية والتمايز تقرير نوع 1-16. العصبية في الشبكية تتكون من ستة أنواع الخلايا المنفصلة (العقدة، مبصرات عديم الاستطالات، الأفقي، وخلايا القطبين، والخلايا الدبقية مولر) مرتبة في طبقات النمطية، وهو النمط الذي يتم حفظها بشكل كبير بين جميع الفقاريات 12،14-18.

أثناء الدراسة في الشبكية سليمة في الجنين النامية هو مطلوب بوضوح لفهم كيفية تطور هذا الجهاز المعقد من بروز الدماغ الأمامي في هيكل الطبقات، وهناك العديد من الأسئلة التي تفيد جيئة وذهابام توظيف النهج باستخدام زراعة الخلايا الأولية من خلايا الشبكية المفترض 7،19-23. على سبيل المثال، وتحليل الخلايا من الأنسجة وإزالة فصلها في مراحل مختلفة يسمح احد لتبين حالة تحديد الخلايا الفردية في مراحل نمو مختلفة، وهذا هو، مصير الخلايا في غياب التفاعل مع الأنسجة المجاورة 8،19-22 ،24-33. زراعة الخلايا الأولية كما يسمح المحقق لعلاج الثقافة مع الكواشف محددة وتحليل النتائج على مستوى خلية واحدة 5،8،21،24،27-30،33-39. القيطم المورق، ونظام النموذج التقليدي لدراسة التنمية في وقت مبكر العصبية 19،27،29،31-32،40-42، بمثابة مناسبة خاصة لنظام الشبكية زراعة الخلايا الأولية 10،38،43-45.

الأنسجة الشبكية الافتراضي يمكن الوصول إليها من المراحل الأولى من التنمية، مباشرة بعد تحريض العصبية 25،38،43. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا عشرفي كل خلية في الجنين يحتوي على توريد صفار، يمكن زرعها في خلايا شبكية العين وسائل الإعلام تعريف بسيط جدا يتكون من محلول ملحي مخزنة، وبالتالي إزالة آثار الخلط من الحضانة أو غيرها من المنتجات القائمة على الأمصال 10،24،44-45 .

ومع ذلك، فإن عزل الأنسجة الشبكية من الأنسجة المحيطة والمعالجة اللاحقة يمثل تحديا. هنا، نقدم طريقة لتشريح وتفكك خلايا الشبكية في المورق القيطم التي سيتم استخدامها لإعداد الثقافات الخلية الأولية التي من شأنها، في المقابل، يتم تحليلها لنشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في الخلايا القرار واحد. في حين أن الموضوع المقدمة في هذه الورقة هو تحليل الكالسيوم العابرين عفوية، والتقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية والنهج (الشكل 1).

البروتوكول

يتم تنفيذ جميع التجارب التالية البروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام في كلية وليام وماري. مراحل نمو المشار إليها في هذا البروتوكول، وفقا لفابر وNieuwkoop 46.

1. تشريح

  1. السماح للخلية ثقافة المتوسط ​​والمتوسطة الكالسيوم المغنيسيوم مجاني (CMF) لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. سوف تحتاج أيضا ل0.1X مارك معدلة رينغر (MMR) 7،4-7،6 درجة الحموضة.
  2. تعقيم العناصر التالية عن طريق تطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة في غطاء خلية ثقافة تدفق الصفحي. (رش كل بند مع الايثانول 70٪ قبل ان يضع في غطاء محرك السيارة.)
    • 35 ملم أطباق بتري بلاستيكية.
    • 60 مم أطباق بتري بلاستيكية.
    • 35 مم سطح Nunclon الأطباق.
    • 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج.
    • P1000 micropipette (1،000 micropipette ميكرولتر).
    • الهباء الجوي مقاومة P1000 نصائح (1،000 الهباء الجوي نصائح micropipette مقاومة ميكرولتر).
    • كحولمقاومة القلم.
    • غرامة ملقط تشريح.
    • * 15 مل المخروطية أنابيب (فقط للنشاط الكالسيوم التصوير).
    • * فقط من أجل التصوير النشاط الكالسيوم.
  3. مرة واحدة وقد تم تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية غطاء محرك السيارة والحلول لها معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة، بدوره على تدفق الهواء الصفحي في غطاء محرك السيارة، رش أسفل القفازات وزجاجات وسائل الاعلام مع الايثانول 70٪ ومكان الزجاجات وسائل الإعلام في غطاء محرك السيارة.
  4. داخل غطاء محرك السيارة إعداد التالية مع micropipette P1000 لكل لوحة من الخلايا، وضمان وضع العلامات المناسبة.
    • واحد 60 مم طبق بتري بلاستيكية تحتوي على 10 خلية ثقافة متوسطة مل - لوحة تشريح.
    • واحد 35 مم سطح Nunclon طبق يحتوي على 2 مل خلية ثقافة متوسطة - لوحة الثقافة. (لم يتم الصحون البلاستيكية Nunclon تعامل مع أي مواد لاصقة أخرى.)
    • واحدة فارغة ميكروسنتريفوج 1.5 مل أنبوب أنبوب يزدرع التفكك.
    • * واحد 15 مل المخروطية الصقرأنبوب يحتوي على 15 خلية ثقافة متوسطة مل. لغسل الزائدة من الكالسيوم Fluo4-AM التصوير عندما النشاط.
  5. داخل غطاء محرك السيارة، وإعداد ما يلي مع micropipette P1000 لكل دورة تشريح (يمكن تشريح أكثر من دورة واحدة في شبكية العين).
    • واحد 35 مم طبق بتري بلاستيكية تحتوي على 2 مل CMF - يزدرع شطف اللوحة.
    • واحد 35 مم طبق بتري بلاستيكية تحتوي على 2 مل CMF - يزدرع التفكك اللوحة.
  6. خارج غطاء محرك السيارة إعداد ما يلي:
    • واحد 60 مم طبق بتري بلاستيكية في لوحة من الخلايا التي تحتوي على 10 مل 0.1X MMR - لوحة القابضة.
    • واحد 60 مم طبق بتري بلاستيكية في لوحة من الخلايا التي تحتوي على 10 مل MMR 0.1X - لوحة الشقيق.
    • واحد 60 مم طبق بتري بلاستيكية تحتوي كل دورة تشريح 10 مل 0.1X MMR + 0.5 ملغ / مل MS-222 (tricaine) - لوحة التخدير.
  7. اضافة 40 ميكرولتر التربسين 5٪ في CMF إلى لوحة التفكك يزدرع (مما أدى إلى حل التربسين 0.1٪)، دوامة لخلط، وتوضع جانبا.
  8. إذا تشريح الجنين الذي هو أصغر من المرحلة 30، 10 ملغ إضافة كولاجيناز B إلى لوحة تشريح (مما أدى إلى 1 مغ / مل حل B كولاجيناز)، دوامة حل وتوضع جانبا.
  9. تحديد الجنين المرحلة المطلوب، نقل إلى لوحة القابضة مع ماصة نقل معقمة غير، وإزالة الغشاء المحي (إذا كان الجنين لم تفقس بعد) باستخدام ملقط غرامة.
  10. نقل الأجنة عدة مراحل مماثل إلى لوحة الشقيق مع ماصة نقل غير معقمة.
  11. إذا كان الجنين هو المرحلة 25 أو في وقت سابق، تابع مباشرة مع تشريح، وإلا نقل الجنين إلى لوحة التخدير مع ماصة نقل معقمة وغير سماح للجنين أن يجلس حتى الحركة واستجابة لمحفزات يتوقف. وهذا يمكن أن تأخذيصل إلى دقيقة.
  12. المضي قدما في تشريح (الشكل 2) تحت نطاق تشريح (الهدف 4X، 10X العدسة).

لأجنة المرحلة 25 أو أصغر سنا:

  1. نقل الأجنة إلى لوحة تشريح مع ماصة نقل غير معقمة.
  2. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وجعل قطع سهمي ناصف على الجانب البطني للجنين، التي تبدأ في نهاية الخلفي والمستمر من خلال الغدة الاسمنت في الجزء الأمامي من الجنين.
  3. فتح بعناية من قبل الجنين استيعاب إما حافة قطع ونشر اليسار واليمين. نشر هذه النتائج في الجنين مع الجانب الظهري التي تواجه في لوحة التشريح، ومع الأديم الظاهر بطني مفتوحة لتكشف عن والأديم الباطن الأديم المتوسط ​​داخل.
  4. بدء إزالة الأديم الباطن والأديم المتوسط ​​(الشكل 2A و 2B). الطبقة الأولى والأكبر من هذا النسيج جدا "رقيق" في المظهر معكبير الخلايا وتنظيم واضحة قليلا.
  5. بعد إزالة هذه الطبقة، وو somites والقردود تصبح مرئية. لأفضل النقيض من ذلك، نقل الجنين الى طبق منفصل بيتري 60 ملم البلاستيكية التي تحتوي على 10 خلية ثقافة متوسطة مل و 100 ميكرولتر من محلول 1٪ من سلفات النيل الأزرق (في الماء) لمدة 2-3 دقيقة قبل نقل مرة أخرى إلى لوحة تشريح. وهذا وصمة عار في الأديم الظاهر، somites، والقردود لتسهيل تحديد والتوجه.
  6. مع التركيز على الجزء الأمامي من الجنين، وإزالة بعناية القردود وأي الأديم المتوسط ​​المتبقية تعريض الدماغ والحويصلات البصرية (الشكل 2C).
  7. مرة واحدة يتعرض لها تماما الدماغ والحويصلات البصرية، استخدم ملقط لقطع الأنبوب العصبي والأديم الظاهر الكامنة الخلفي فقط إلى الدماغ.
  8. تحويل هذا الجزء (الدماغ والحويصلات البصرية) بحيث تكون الأديم الظاهر هو على القمة.
  9. مع الحرص على عدم الإضرار الحويصلات الكامنة البصري، إعادة بعنايةنقل الأديم الظاهر (الشكل 2D).
  10. وأخيرا، وذلك باستخدام ملقط، فصل الحويصلات البصرية من الدماغ (الشكل 2D و 2E).

لأجنة أقدم من المرحلة 25:

  1. في حين أن الجنين هو في لوحة التخدير، وإزالة الجزء البطني للجنين مع ملقط.
  2. لأفضل النقيض من ذلك، نقل الجنين الى طبق بتري بلاستيكية تحتوي على 60 مم 10 مل و 100 0.1X MMR ميكرولتر من 1٪ كبريتات النيل الأزرق لمدة 2-3 دقيقة قبل ان ينتقل الى لوحة تشريح. وهذا وصمة عار في الزرقاء الأديم الظاهر.
  3. مرة واحدة في لوحة التشريح، والتراجع الأدمة الشبكية التي تغمر (أو الحويصلة البصرية للمرحلة الأجنة 26-30) (الشكل 2F و2G). إذا تم استخدام كبريتات النيل الأزرق، سيتم ملطخة الزرقاء الأديم الظاهر ولكن الأنسجة الكامنة الشبكية لن.
  4. إزالة الحويصلة البصرية الشبكية أو بعناية مع FOrceps (الشكل 2H، 2I، 2J و). فإنه من المفيد أن تعقد الجنين في مكان مع زوج واحد من الملقط وإزالة الحويصلة البصرية الشبكية أو مع الآخر.

2. تفكك الأنسجة والخلايا تصفيح

ملاحظة هامة - عند نقل الأنسجة، لا تسمح شبكية العين أو الحويصلة البصرية للمس أي حدود الهواء السائل، وإذا حدث هذا سوف ليز الخلايا.

  1. مرة واحدة وقد تم تشريح الحويصلة البصرية أو شبكية العين، ونقل بعناية لشطف يزدرع اللوحة مع micropipette P100 باستخدام مقاومة نصائح الهباء الجوي والسماح للجلوس لمدة 30 ثانية.
  2. نقل 80 ميكرولتر من التربسين 0.1٪ في CMF من لوحة التفكك يزدرع إلى أنبوب التفكك يزدرع.
  3. باستخدام micropipette P100 ونصائح مقاومة الهباء الجوي، ونقل شبكية العين أو الحويصلة البصرية من يزدرع شطف اللوحة إلى Dissociati يزدرععلى الأنبوبة، وتجنب نقل إإكسبلنتس شطف الحل.
  4. السماح للأنسجة لفصل في أنبوب التفكك يزدرع ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام واحد في لوحة شبكية العين، ولكن نلاحظ أنه من الممكن استخدام أكثر من لوحة واحدة في حال رغبت في ذلك لزيادة عدد الخلايا في اللوحة.
  5. لوحة الخلايا، أولا إزالة ببطء 40 ميكرولتر من محلول من أنبوب التفكك وتجاهل يزدرع باستخدام micropipette P100 ونصائح مقاومة الهباء الجوي. باستخدام مجموعة P100 إلى 40 ميكرولتر ونصائح مقاومة الهباء الجوي، ونقل الخلايا (الآن أن الأنسجة نأت) إلى لوحة الثقافة. عندما الشفط الخلايا على طبق، ماصة ببطء والحفاظ على خلايا في منطقة صغيرة في وسط اللوحة.

ملاحظة: إذا صور متعددة من الخلايا هي التي يتعين اتخاذها في كافة مراحل التجربة، ونعلق شبكة (Cellattice) على الجانب السفلي من لوحة الثقافة مع انخفاض صغير من superglue. وهذا يسمح باتخاذ صور من الخلايا متطابقة في توجهات مماثلة في نقاط مختلفة في الإجراء.

  1. السماح للخلايا على الجلوس دون عائق لمدة لا تقل 1 ساعة على الانضمام إلى لوحة Nunclon. بعد هذا الوقت، لا بد من معاملتهم بلطف شديد أو أنها يمكن أن تصبح منفصلة.
  2. الخلايا إلى مرحلة الثقافة المرجوة من خلال مراقبة الأجنة الأخوة، والتي تربى في نفس درجة حرارة الخلايا. إذا لم يتم الخلايا الحية التي تستخدم للتلاعب كذلك، يمكن إصلاحها في حل MEMFA في هذا الوقت.

ملاحظة هامة: يتم إصلاح معظم تجاربنا في غضون 6 ساعة من الطلاء الخلايا. طول عمر الخلايا في الثقافة يتوقف على المرحلة التي تم تشريح الأنسجة وكمية صفار لا تزال موجودة في الخلايا وخلايا تشريح من الأصغر سنا (المراحل العصيبة) البقاء بصحة جيدة في الثقافة لمدة 5-6 أيام في حين أن الخلايا تم الحصول عليها من أقدم أجنة (السباحة الشرغوفسوف المراحل) لا تزال قابلة للحياة في الثقافة لمدة 2-3 أيام.

3. التصوير الكالسيوم 47-49

هذا البروتوكول يستخدم الكالسيوم الحساسة المجهر Fluo4-AM ومبائر لقياس العابرين الكالسيوم في الخلايا الفردية. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام Fluo4-AM بعيدا عن الضوء، وFluo4-AM خفيف الحساسة. وينبغي أن يضاف أو يغسل كل إزالتها باستخدام micropipette P1000 الهباء الجوي ونصائح مقاومة. وينبغي أن يتم ببطء وPipetting نحو حافة لوحة لتجنب تعكير الخلايا. لم يتم تغيير وسائل الاعلام ليتم إصلاحها بشكل عام الثقافات في غضون 6 ساعة من التعرض للتشريح. على المدى البعيد الثقافات، يجب تغيير وسائل الإعلام يوميا.

  1. يتم تخزين Fluo4-AM في -20 درجة مئوية، ونقترح تخزين في 5 ميكرولتر مأخوذة. قبل استخدام، ذوبان الجليد 5 ميكرولتر من Fluo4-AM بعيدا عن الضوء وإضافة 2 ميكرولتر من بلورونيك F-127 مباشرة الى هذا قسامة.
  2. بعد زراعة الخلايا للالمبلغ المطلوب من الوقت (على الأقل1 ساعة)، وإزالة 1 مل من مستنبت الخلية من لوحة الثقافة. إضافة إلى هذا Fluo4-AM وبلورونيك، والخلط من قبل pipetting لطيف.
  3. نقل ببطء كل هذا حل عودة إلى حافة اللوحة ثقافة الخلايا ليمكن تصوير وترك الخلايا في هذا الحل دون عائق لمدة 1 ساعة لامتصاص Fluo4-AM.
  4. لتغسل الزائدة Fluo4-AM من خلية ثقافة المتوسط، واستكمال سلسلة غسل التالية:
    • إزالة 1 مل من وسائل الإعلام من لوحة.
    • أضف 3 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة خلية (من أنبوب 15 مل المخروطية) لوحة.
    • إجراء عمليتين يغسل إضافية، في كل مرة إزالة ببطء 3 مل من محلول من لوحة وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة الخلية.
  5. يجب أن تكون الخلايا الآن في 4 مل من مستنبت الخلية وتحتوي على Fluo4-AM. والمشقوق إنزيمي Fluo4-AM مرة واحدة داخل الخلية، ومنعه من الخروج من الخلية نشرها أو في أي حجرات غشاء محدد.
  6. قبل تحميل لوحة من على خشبة المسرح المجهر مبائر للتصوير، رسم خط عمودي أحمر مع علامة دائمة على طبق مع الحفاظ على الغطاء لمنع جزيئات علامة من تلويث الثقافة. يوجه خط رأسي إلى أسفل الجانب من طبق بتري (قاعدة طبق بتري، وليس غطاء). والغرض منه هو للدلالة على اتجاه لوحة الثقافة فيما يتعلق مجال الرؤية حتى يمكن التوجه دقيقة والمواءمة بين الخلايا الفردية إعادة تأسيس في مرحلة لاحقة.
  7. لوحة جاهز الآن للتحميل على خشبة المسرح من المجهر مبائر للتصوير. تصور الخلايا باستخدام إعدادات الحقل مشرق على ليزر متحد البؤر المسح الضوئي المجهر (20X الهدف). العثور على منطقة كثيفة من الخلايا التي لا تحتوي على كتل، ويفضل مع مجال الرؤية الذي يحتوي على أرقام شبكة كبيرة على ساترة Cellatice لجعل العثور على نفس المجال من السهل مشاهدة في وقت لاحق عندما التصوير الثقافة الاشتراكية بعد فيتو التهجين. قبل التصوير، والتركيز عليها من خلال الثقافة والتقاط صورة مشرقة مجال من شبكة الخلايا أدناه لتسجيل موقع واتجاه الثقافة الخلية. وهذا يسمح لإعادة تنظيم خلايا لتحليل اللاحقة.
  8. رفع المستوى البؤري والتقاط صورة مشرقة مجال الخلايا قبل بداية التصوير الكالسيوم (الشكل 3A).
  9. مرة واحدة في الطائرة وسط الخلايا هو في التركيز، لوحة مستعد لتصوير نشاط الكالسيوم. سوف تختلف تبعا لإعدادات المجهر والتطبيق. نحن صورة الخلايا باستخدام الليزر الأرجون نانومتر 488: 1، 2، أو 12 ساعة مع المعلمات التالية:
    • 1 ساعة الصور:
      • الأرجون ليزر 488 نانومتر بالاشعة على 4٪ من الطاقة القصوى 30 ميغاواط.
      • مسح مرة واحدة كل ثانية 4 (900 بالاشعة في ساعة).
    • 2 صورة ساعة:
      • الأرجون ليزر 488 نانومتر بالاشعة على 4٪ من الطاقة القصوى 30 ميغاواط.
      • مسح مرة واحدة كل8 ثانية (450 بالاشعة في ساعة).
    • 12 صورة ساعة:
      • الأرجون ليزر 488 نانومتر بالاشعة على 2٪ من الطاقة القصوى 30 ميغاواط.
      • مسح مرة واحدة كل ثانية 48 (75 بالاشعة في ساعة).

وهذه المعايير يؤدي إلى مجموعة من 900 صورة الإطار لا تزال لكل الإطار الزمني. ويمكن بعد ذلك يتم تسجيل النشاط الكالسيوم من خلال تحليل مستويات مضان على الصور بالطبع الوقت (الشكل 3B) مع استخدام صورة تطبيق معالجة مثل يماغيج 50.

4. تحديد خلايا

  1. بعد التصوير، ويمكن أن تكون ثابتة لمدة 30 دقيقة الخلايا عن طريق إزالة 3 مل من محلول من لوحة وإضافة 1 مل 2X MEMFA إلى 1 مل المتبقية من وسائل الإعلام والثقافة.
  2. بعد التثبيت، وإزالة الخلايا MEMFA ويذوى مع سلسلة من يغسل 5 دقائق، وبلغ حجم التداول كل 1 مل:
    • 25٪ من الإيثانول في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS).
    • 50٪ من الإيثانول في 1X PBS.
      • <لى الإيثانول> 75٪ في 2 دينار O H (العقيمة منزوع الأيونات الماء المقطر).
    • استبدال غسيل الماضي مع الإيثانول مل 1 100٪ وتخزينها في لوحة -20 ° C.

ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم الميثانول لهذه يغسل وللتخزين.

5. الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH)

يمكن يعاير الثقافات باستخدام بروتوكول FISH القياسية لوصف القيطم إلى 51 مع بعض التعديلات لزراعة الخلايا على النحو المبين من قبل مختبر اندرسون 52. يتم سرد تعديلات على بروتوكول مختبر اندرسون أدناه. وتجرى جميع يغسل على لوحات مم Nunclon 35 في حجم ما يقرب من 1 مل، ما لم يذكر خلاف ذلك. تعرف بأنها حلول في SIVE وآخرون 53 ما لم يذكر خلاف ذلك.

ملاحظة هامة: لا تستخدم فلوريسئين-RNA تحقيقات المسمى عند تنفيذ التهجين في الموقع على الخلايا المصورة للالكالسيوم النشاط. والأجسام المضادة لمكافحة فلوريسئين ربط المتبقية Fluo4-AM في الخلايا ويمكن أن يتسبب إشارة إيجابية في جميع الخلايا في الثقافة.

يوم 1: والتهجين Permeabilization

  1. يجب أن تكون متدرجة يغسل الإماهة للمذيب الجفاف تستخدم للتخزين. لتجاربنا، ومتدرج ليغسل في برنامج تلفزيوني 1X الإيثانول.
  2. بعد الإماهة، وغسل الخلايا ثلاث مرات إضافية في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة.
  3. خلط 25 مل من ترايثولامين M 0.1 (درجة الحموضة 8.0) مع 62.5 ميكرولتر من أنهيدريد الخل في أنبوب فالكون وتخلط بسرعة حتى فرقت تماما كما نوقش في البروتوكول أندرسون 52 مختبر. احتضان الثقافات في هذا الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد العلاج أنهيدريد الخل، وغسل الخلايا في 1X سترات الصوديوم المالحة (SSC) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة غسل SSC مشاركة واستبدالها مع حمض الهيدروكلوريك M 0.2 (SDD في O 2 H) لمدة 10 دقيقة لpermeabilize الخلايا.
  5. تغسل حمض الهيدروكلوريك مع اثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
  6. Prehybridize في المخزن المؤقت ISH في 60 درجة مئوية في حمام مائي تهز مدة لا تقل عن 6 ساعة، ولكن لا prehybridize بين عشية وضحاها لأن ذلك يقلل بشدة الإشارة.
  7. بين عشية وضحاها في هجن 60 درجة مئوية لمدة 8-14 ساعة في 750 ميكرولتر من التحقيق المخفف (1:250 التخفيف من تحقيق المطهرون). ويتراوح تركيز التحقيق تنقية 1،0-1،5 ميكروغرام / ميكرولتر.

يوم 2: إزالة دقق غير منضم والحضانة جسم

  1. إزالة التحقيق وشطف الثقافات لمدة 5 دقائق في SSC 0.2X في 60 ° C. يغسل في SSC 0.2X جديدة ل1 ساعة 60 ° C. في
  2. إزالة الثقافات من حمام الماء وتسمح لهم للتكيف مع درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. شطف في SSC 0.2X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. يغسل لمدة 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X مع 0.1٪ تريتون 100-X-(PBT).
  5. لتعطيل الإنزيمية الذاتية، وغسل لمدة 1 ساعة في 2٪ H 2 الحل 2 O في PBT.
    6. شطف الغسيل مع 15 دقيقة في تريس مخزنة المالحة 1X بنسبة 0.1٪ توين 20 (TBST).
  6. منع في 2٪ الكاشف حجب العازلة في حمض المالئيك (MAB) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لقد وجدنا أن هذا الأسلوب يزيد من حساسية حجب بالمقارنة مع الطرق السابقة في حجب مصل الأغنام 20٪ في PBT.
  7. احتضان الثقافات في 1 مل من الكاشف 2٪ في حجب MAB تحتوي على التخفيف من الأجسام المضادة 1:1،000 POD، مترافق بين عشية وضحاها في C. ° 4

يوم 3: إزالة الأجسام المضادة غير منضم والتنمية الإسفار

  1. إزالة الأجسام المضادة وشطف حل 3 مرات في TBST لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. يغسل 4 مرات في TBST لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين تعصف باستمرار بسرعة بطيئة.
  3. يغسل مرتين في PBT في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. تطبيق 750 ميكرولتر من 1:200 tyramide Cy3 فلوريسئين-tyramide أو مخففة في PBT 1:25. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإضافة 2.5 ميكرولتر 0.3٪ H 2 O 2. صخرة لمدة 40 دقيقة للسماح للإشارة إلى تطوير.
  5. غسل ما لا يقل عن 4 مرات لمدة 15 دقيقة في كل من TBST في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
  6. مرة واحدة وقد وضعت إشارة بالكامل، وغسل لمدة 5 دقائق في PBT 1X.
  7. إصلاح في MEMFA 1X لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في C. ° 4

6. النتائج FISH الصورة ومع شركة تسجيل للبيانات التصوير الكالسيوم

  1. وعند الانتهاء من الأسماك، وتصوير لوحات زراعة الخلايا لتحديد الخلايا التي تعرض إشارة إيجابية لتحقيق مضان معين. استخدام ساترة Cellattice لإيجاد مجال الدقيق لمشاهدة درس خلال التصوير الكالسيوم ومحاذاة لوحة لاتجاه إطارات الصور الكالسيوم.
  2. التركيز على الطائرة وسط الخلايا وتأخذ واحدة ذات دقة وضوح الصورة باستخدام الهيليوم النيون HeNe الليزر نانومتر 543 في 15٪ من الطاقة القصوى ميغاواط 1 (الشكل 3C).
  3. في الإطار الأصلي 900 مجموعة من الصور المأخوذة من الكالسيوم بروتوكول التصوير،تحديد الخلايا الفردية والمناطق ذات الاهتمام (رويس) من خلال استخدام برنامج معالجة صورة (مثل يماغيج 50). استخراج البيانات ROI مضان على أنها مجموعة من نقاط البيانات التي تمثل القيم الزوج وقت مضان (الشكل 4).
  4. تراكب الصور FISH النتائج مع تحديد رويس من الصور الكالسيوم (الشكل 3D).
  5. تسجيل كل ROI بأنها إيجابية لتحقيق، سلبية على التحقيق، أو غير معروف - في حالة أنه لم يعد الخلية المقابلة لROI يمكن العثور عليها داخل مجال الرؤية للصورة FISH.
  6. عملية ROI البيانات باستخدام البرامج النصية مضان التحليل الإحصائي (كما تم تصميمها من خلال MATLAB أو غيرها لغة البرمجة) لمقارنة مستويات النشاط بين مختلف مراحل الكالسيوم تشريح (5A الشكل و5C) أو الخلايا إيجابية للتحقيقات FISH مختلفة (الشكل 5B 5D و). جميع النصوص المستخدمة في المختبر لدينا هي متاحة بحرية على الطلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وترد أمثلة على الحويصلات البصرية تشريح بنجاح (المرحلة 25) والشبكية (المرحلة 35) في أرقام 2E و2J. في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول في مراحل مختلفة من التنمية، فإن من الأهمية بمكان الحصول على الأنسجة الشبكية فقط لضمان الدقة لتجارب أخرى. إزالة بعناية البشرة في جميع مراحل والتأكد من أن لديك ملقط لا ثقب الأنسجة الشبكية. في المرحلة 35 أو أقدم، ويمكن أن ينظر إلى عدسة كطبقة واضحة على الجزء العلوي من شبكية العين ويمكن إزالتها عن طريق تجريف الحذر باستخدام ملقط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مع أنواعه الخلية جيدا أن تتميز من الحفظ في جميع الفقاريات، وشبكية العين يوفر نموذجا مفيدا لدراسة العمليات الجزيئية الخلوية التي تنظم خلية مواصفات نوع والتمايز. زراعة الخلايا الأولية تتيح وسيلة قوية للتحقيق في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك التعبير الجيني، وديناميات البروتين، والكالسيوم والنشاط الكهربائي على مستوى القرار خلية واحدة. يمكن هنا نقدم تقنية بسيطة لزراعة الخلايا الأولية من الأنسجة تشريح الشبكية المفترض في القيطم المورق، كائن قابلة لمثل هذه الدراسات لا سيما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور جون هايز تكرمت للمخطوطات؛ الدكاترة. اريك برادلي وكريستوفر ديل نيجرو للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر؛ درو هيوز، لورا Odorizzi، Garafalo اليكس، Lowden ريبيكا، وليز ماكموراي على عملهم في تطوير المشروع وتوفير البيانات الأولية، والدكتور جريج سميث للحصول على اقتراحات مفيدة على التحليل الإحصائي. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (NINDS IR15N5067566-01) إلى MSS ومعهد هوارد هيوز الطبي العلوم منحة التعليم في كلية وليام وماري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
لتشريح والتثقيف
BD الصقر الأنسجة أطباق سهلة قبضة الثقافة، 35 مم الصياد 08-772A
المتاح أطباق بتري البوليستيرين، 60 × 15 مم الصياد 0875713A
35 مم السطح Nunclon أطباق بتري (مع Airvent) الصياد 12-565-91
دومون الجميلة الملقط (Dumostar # 55) الصياد NC9341917
Cellattice الصغرى، حكمت ساترة من البلاستيك، 25 مم الصياد 50-313-17
إيثيل-M-أمينوبنزوات Methanesulfonate الملح (MS-222) MP Biomedicals، LLC 103106
جنتاميسين سلفات انزو العلوم الحياتية 380-003-G025
Gibco التربسين (1:250) مسحوق الحياة تكنولوجيز 27250-018
كولاجيناز نسج كلوستريديوم B من روش 11088831001
البنسلين الستربتوميسين Gibco 15140-122
النيل الأزرق كبريتات (اختياري) Pfaltz وباور N05550
500 مل زجاجة فراغ نظام تصفية / التخزين، 0.22 ميكرومتر مسام غشاء 33،2 سم CN ​​2 كورنينج 430758
لتصوير الكالسيوم
فلوو-4 AM 1 ملم في DMSO الحل، خلية الدائم الحياة تكنولوجيز F-14217
الحل بلورونيك F-127 10٪ في المياه الحياة تكنولوجيز P-6866
LSM 510 نظام مجهر متحد البؤر زايس نموذج وقف العمل
منع الكاشف روش 11096176001
نيون لفي الموقع التهجين (FISH)
مكافحة Digoxigenin-POD، شظايا فاب روش 11207733910
مكافحة DNP-HRP جسم بيركن إلمر- NEL747A
Cy3NHS استر GE للرعاية الصحية PA13101
NHS-فلوريسئين الحرارية العلمية 46409
الفورماميد، منزوع الأيونات Amresco 0606-950ML
المستخفية RNA، نوع IX سيغما الدريخ R3629
الهيبارين ملح الصوديوم، من مخاطية الأمعاء لحم الخنزير سيغما الدريخ H3393-250KU
CHAPS سيغما الدريخ C3023

الجدول 2. الكواشف محددة والمعدات.

حل مرجع محتويات
خلية مستنبت تشانغ وسبيتزر، 2009 54 116 مم كلوريد الصوديوم
0،67 ملي بوكل
2 مم CaCl 2
1.31 مم MgSO 4
4.6 ملم تريس
1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك.
تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22.
تخزين في C. ° 4
الكالسيوم والمغنيسيوم مجاني متوسطة (CMF) غو وآخرون، 1994 42؛. قو وسبيتزر، 1995 55 116 مم كلوريد الصوديوم
0،67 ملي بوكل
4.6 ملم تريس
0.4 ملم EDTA
1٪ (V: V) البنسلين / الستربتوميسين
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 مع حمض الهيدروكلوريك.
تصفية تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرومتر CN 0.22.
تخزين في C. ° 4
المالئيك حمض العازلة (MAB) SIVE وآخرون، 2000 53 100 ملم حمض المالئيك
150 مم كلوريد الصوديوم (7.5 درجة الحموضة).
مارك لقارعو الأجراس معدلة (MMR)، 10X SIVE وآخرون، 2000 53 100 ملي مول كلوريد الصوديوم
ملي بوكل
1 ملم MgSO 4
2 مم CaCl 2
5 ملي HEPES
درجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم
0.1X MMR يحتوي أيضا على 50 ملغ / مل يتم ضبط جنتاميسين سلفات ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
MEMFA الحل، 10X SIVE وآخرون، 2000 53 0،1 M اجتماعات الأطراف (PH 7.4)
2 مم EGTA
1 ملم MgSO 4
3.7٪ الفورمالديهايد
A حل 10X، دون الفورمالديهايد، يمكن تخزينها في C. ° 4 يضاف الفورمالديهايد جديدة (1/10 من حجم المخزون القياسي 37٪).
في الموقع التهجين العازلة SIVه آخرون، 2000 53 50٪ الفورماميد
5X SSC
1 ملغ / مل RNA المستخفية
100 ملغ / مل الهيبارين
1X Denhart في الحل
0.1٪ توين 20
0.1٪ CHAPS
10 ملي EDTA.

حلول. * يستخدم جنتاميسين، والمضادات الحيوية، في حين لدينا حلول MMR يتم استخدام البنسلين والستربتوميسين في وسائل الإعلام ثقافتنا.

المراجع

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus

مقالات ذات صلة