يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

35.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4425

⸱

يناير 14, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University

في هذه المقالة

ملخص

سرطان الخلايا الليفية المرتبطين بها (سي أي إف إس) تسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الأسلحة النووية، الأوعية الدموية، والتهاب. نحن هنا وصف طريقة لعزل السكان نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية عن طريق الفرز الخلية، وذلك باستخدام PDGFRα كعلامة السطح.

الملخص

سرطان الخلايا الليفية المرتبطة (سي أي إف إس) هي نوع من الخلايا أبرز داخل الورم سدى من العديد من أنواع السرطان، سرطان الثدي في وجه الخصوص، وكثيرا ما يرتبط وجودهم بارز مع 1،2 بسوء التشخيص. سي أي إف إس هي حيوانية تنشيط الخلايا الليفية اللحمية، وكثير منها تعبر عن علامة الأرومة الليفية العضلية α-SMA 3. سي أي إف إس الأنسجة الليفية تنبع من المحلية وكذلك من خلايا نخاع العظام المستمدة من المعينين داخل الورم تطوير واعتماد النمط الظاهري CAF تحت تأثير الورم المكروية 4. عرضت سي أي إف إس لتسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الخلايا السرطانية، الأوعية الدموية، وغزو 5-8. أثبتنا أن سي أي إف إس تعزيز نمو الورم عن طريق الوساطة الورم المعززة للالتهاب، بدءا من المراحل المبكرة ما قبل الورمية 9. رغم وجود أدلة متزايدة من سي أي إف إس تلعب دورا رئيسيا في تسهيل نمو الورم،وكانت دراسة سي أي إف إس تحديا الجارية نظرا لعدم وجود علامات محددة CAF وعدم التجانس العظمى من هذه الخلايا، مع العديد من الأنواع الفرعية تتعايش في المكروية ورم 10. وعلاوة على ذلك، ودراسة الخلايا الليفية في المختبر يعوقها حقيقة أن في كثير من الأحيان يتم تبديل الشخصي التعبير الجيني في مجال زراعة الأنسجة 11،12. لمعالجة هذه المشكلة والسماح منحازة التنميط التعبير الجيني من الخلايا الليفية الماوس من الطازجة والأنسجة البشرية، وضعنا طريقة يعتمد على البروتوكولات السابقة للفرز الخلايا مضان المنشط (FACS) 13،14. نهجنا تعتمد على استخدام PDGFRα كعلامة سطح الخلايا الليفية لعزل من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية. وأعرب تماما من قبل كل من الخلايا الليفية PDGFRα العادية ومقاهي 9،15. هذا الأسلوب يسمح للسكان العزل نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس، بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على α-SMA + تنشيط myofibroblasts. يمكن أن تكون معزولة الخلايا الليفية ثمتستخدم لتوصيف ومقارنة لتطور التعبير الجيني التي تحدث في أثناء سي أي إف إس تكون الأورام. في الواقع، نحن وغيرنا عن التنميط التعبير عن الخلايا الليفية معزولة من قبل الخلية فرز 16. تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح لعزل السكان وإنشاء ملف عالي التخصيب من الخلايا الليفية من أنسجة الجلد، الثديية والبنكرياس والرئة. وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب يسمح أيضا زراعة الخلايا فرزها، من أجل إجراء تجارب الفنية وتجنب التلوث من قبل خلايا الورم، والتي غالبا ما تكون عقبة كبيرة عندما تحاول سي أي إف إس الثقافة.

البروتوكول

1. تشريح الأنسجة الثديية أو الجلد من الفئران

  1. قبل تشريح الأنسجة المطلوب من الفئران، وإعداد اللوازم والكواشف بعد:

    اللوازم:

    • أدوات جراحة (غسلها بالمنظفات وتراجع بعد ذلك في الايثانول 70٪).
    • الستايروفوم سطح للراحة خلال الماوس على تشريح.
    • دبابيس أو الإبر لعقد الفئران خلال تشريح.
    • عاء زجاجي مع غطاء لعملية الهضم، التي تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي (تعقيمها).
    • حمام الماء عند 37 ° C، تحتوي على النمام المغناطيسي الغاطسة وكمية كافية من الماء لغمر الجرة الهضم، في حين يستريح على لوحة ضجة.

    الكواشف:

    • FACS العازلة I: (4 ° C): الفوسفات مخزنة المالحة في Dulbecco CMF (المغنيسيوم الكالسيوم مجاني) + 0.5٪ BSA
    • كولاجيناز الحل (على الفور قبل الاستخدام):
      0.05 غ كولاجيناز II
      0.05 غ كولاجيناز IV
      0.01 جرام ديوكسي ريبونيوكلياز
      20مل العازلة FACS I. نضع الحل كولاجيناز على الجليد حتى الاستخدام.
    • PharmLyse (الكاشف الأمونيوم كلوريد Lysing).
    • التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة CMF + 1٪ FCS: FACS العازلة II.
  2. تشريح الغدد الثديية (انظر أيضا 17).
    • الموت ببطء إناث الفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO 2).
    • على سطح الستايروفوم، ضع الماوس على ظهرها ويعلقون بقوة جميع الأطراف الأربعة باستخدام الإبر قياس 25 (الشكل 1A). رش بسخاء الماوس مع الايثانول 70٪.
    • باستخدام ملقط، سحب ما يصل الجلد في البطن في خط الوسط وجعل شق صغير مع مقص حاد.
    • بدءا من شق، قطع الجلد تصل إلى عنق الحيوان مع تجنب ثقب تجاويف البطن أو الصدر.
    • قطع الجلد على الأرجل الخلفية من شق خط الوسط نحو المحطة، مما أدى إلى "شكل Y".
    • سحب الجلد بعيدا عن الجسم الماوس وماهيتها، وفضحالغدد الثديية تعلق على الجانب السفلي من الجلد (1B الشكل).
    • استخدام Q-نصائح لفصل بلطف الجلد من الغدد الثديية في حين خفض الأنسجة حرف عطف مع مقص حاد صغير لفصل الغدة الثديية نحو العمود الفقري من الفأرة.
    • الغدد البطن (# 4، 5) هي أفضل لهذا البروتوكول. يمكنك أيضا استخدام الغدة الثديية 2 الثانية، ولكن نأخذ في الاعتبار أن تقع هذه الغدد في تشريحيا مقربة من العضلة الصدرية التي قد يكون من الصعب فصل، مما أدى إلى خلايا المنشأ الأنسجة المختلطة.
    • ملاحظة: عند تشريح أنسجة الورم، فمن المستحسن لإزالة المناطق نخرية.
  3. تشريح الأنسجة الجلدية: أسهل طريقة للحصول على أنسجة الجلد، دون الحاجة إلى التعامل مع إزالة الشعر هو استخدام ميكي ماوس. إذا كنت بحاجة لكمية أكبر من النسيج، يمكنك يحلق الشعر من الجذع الماوس وتشريح الجلد.
    • الموت ببطء الفئران باستخدام CO 2 طnhalation.
    • باستخدام مقص حاد، وقطع الأذنين ومكان على الفور في جرة تحتوي على الهضم وحدة تخزين صغيرة (~ 0.5 مل) من PBS على الجليد.

2. الغدة الثديية إعداد / الجلد تعليق خلية واحدة

  • وضع الغدد الثديية / الجلد في جرة تحتوي على الهضم وحدة تخزين صغيرة من PBS على الجليد. إذا الأنسجة الدموية هو غسل X2 مع PBS، ومن ثم تجاهل PBS الزائدة.
  • المفروم جيدا مع مقص منحني.
  • إضافة (ملاحظة: هذه الكمية من حل كولاجيناز سوف تنأى بكفاءة حوالي 5 غرام من الأنسجة الثديية أو ورم وآذان من ما يصل الى 15 الفئران) 20 مل حل كولاجيناز.
  • وضع لوحة على الفور تحريك في 37 ° C حمام مائي، واحتضان لمدة 15 دقيقة مع التحريك بمعدل المتوسطة.

ملاحظة: أوقات الحضانة الأمثل قد تختلف إذا هضم الأنسجة الأخرى.

  • لوقف رد الفعل، إضافة 30 مل الباردة DMEM + 10٪ FCS.
  • سترافي خليط الأنسجة / وسائل الإعلام من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب مخروطي 50 مل.
  • أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي لمدة 5 دقائق في 450 XG في 4 درجات مئوية.

3. أحمر الدم خلايا يزيس

ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية إذا كانت الفئران القلب perfused مع PBS قبل التضحية بها.

  • نضح طاف باستخدام ماصة الزجاج تعلق على فراغ، دون الإخلال بيليه الخلية.
  • لليز RBC، إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل حل PharmLyse واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  • تحييد الحل PharmLyse عن طريق إضافة ما يقرب من 40 مل من FACS العازلة I.
  • تدور في أنبوب مخروطي مع الخلايا لمدة 5 دقائق في 450 XG في C. ° 4
  • نضح طاف.

4. حظر لنادي الذاتية

  • اختياري: خلايا العد لتحديد حجم مناسب للخطوات التالية.
  • الخلايا في إعادة تعليق1-3 مل العازلة FACS I (اعتمادا على عدد الخلايا، وكمية من الأجسام المضادة التي تريد استخدامها).
  • إضافة FcBlock (الماوس المضادة للCD16/CD32) لتصل إلى 1:50 التخفيف (10 ميكروغرام / مل)، واحتضان على الجليد لمدة 10-20.
    لا حاجة لغسل قبالة FcBlock.

5. تلطيخ

  • إخراج 100 ميكرولتر مأخوذة لأنابيب إيبندورف لاستخدامها كعنصر تحكم من الامم المتحدة والملون والضوابط لون واحد (وفقا لعدد من الأجسام المضادة الفلورسنت المستخدمة).
  • لتسمية الخلايا الليفية: إضافة المضادة للPDGFRα (مترافق مباشرة إلى fluorophore) إلى التخفيف من 1:50 (10 ميكروغرام / مل).
  • لتسمية السكان الخلية الأخرى (الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية، الخلايا البطانية الخ): إضافة أجسام مضادة مناسبة مترافق fluorescently إلى علامات السطحية، إلى تخفيف 1:50.

ملاحظة: على الرغم من PDGFRα هو علامة قوية لالليفية، فمن المستحسن أن تدرج الأجسام المضادة للخلايا المناعية والخلايا الظهارية في ORDإيه لاستبعاد أي ضعف سكان الإيجابية وبالتالي تعزيز نقاء الخلايا الليفية معزولة.

  • إضافة 2 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة لكل من لون واحد السيطرة أنابيب إيبندورف.
  • احتضان خلايا الأجسام المضادة مع ل1 ساعة على الجليد في الظلام.
  • لغسل: ملء الأنابيب العازلة FACS مع الأول وتدور لمدة 5 دقائق في 450 XG في C. ° 4
  • نضح طاف، resuspend في الخلايا FACS العازلة الأول لتركيز حوالي 2 × 6 10 خلايا / مل، أو أيهما أنسب تركيز لفرز مع فارز الخاص FACS المتاحة.

اختياري: يمكن معلق الخلايا في FACS العازلة II لمدة الفرز. هذا قد تحسين بقاء الخلية. ومع ذلك، قد تعرض إلى عوامل في مصل الدم لديهم تأثير التعبير الجيني، والتي ينبغي اختبار، وأخذها في الاعتبار.

  • نقل الخلايا المسمى في أنابيب FACS مع فلتر الأعلى: الخلايا في أنابيب التصفية لمنع كتل الخلايا.
  • استبعاد الخلايا الميتةق، إضافة 7AAD (0.5 ميكروغرام / مل) أو Propidium يوديد (PI) لعينات (باستثناء لسيطرة الامم المتحدة الملطخة).

ملاحظة: لتجنب إضاعة الخلايا، يمكنك إضافة إلى 7AAD/PI عينة من الامم المتحدة والملون بعد أن سجل في FACS، واستخدام مرة أخرى كما 7AAD فقط السيطرة.

  • الحفاظ على الجليد بينما عينات تحليل.

6. عزل الخلايا عن طريق FACS

(ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول يتطلب معرفة سابقة في تشغيل فارز FACS، على سبيل المثال BD AriaII FACS، أو المساعدة من فني المهرة).

  • باستخدام برنامج فارز FACS (BD FACSDiva)، وإعداد المخططات التحليل المناسب لتحليل مبعثر إلى الأمام (FSC)، مبعثر الجانب (SSC)، 7AAD، FITC، PE وأي fluorophore الأخرى المستخدمة لخلايا تسمية (الشكل 2).
  • قبل تحميل كل عينة إلى فارز الخلية، دوامة لفترة وجيزة ل resuspend الخلايا.
  • تبدأ من خلال تحليل عينة غير ملوثين في أودير لضبط النابضة للسكان الخلية الكلي، إلى بوابة الخروج الحطام الخلية، وتحديد تألق ذاتي أو تلطيخ الخلفية.
  • تحليل عينة غير ملوثين + 7AAD لتحديد وبوابة سكان الخلايا الحية من السكان خلية الإجمالي.
  • تحليل كل عنصر تحكم لتحديد لون واحد ومعايرة معلمات مثل التعويض.
  • تحليل العينة الملون لتحديد موقف من البوابات للفرز.
  • مرة واحدة تم تعيين المعلمات وبوابات للسكان الخلية المطلوبة، تبدأ فرز السكان الخلية المسمى في أنابيب إيبندورف أنابيب مخروطية أو 15 مل تحتوي على مستنبت أو RNA العازلة تحلل (مثل RLT عازلة أو Trizol).

ملاحظة: إذا فرز عدد كبير من الخلايا، فمن غير المستحسن لفرز مباشرة إلى المخزن المؤقت تحلل الحمض النووي الريبي، حيث بلغ حجم كبير من السائل غمد المصاحبة للخلايا في إضعاف المخزن المؤقت تحلل وتقليل العائد.

  • تدور أسفل الخلايا فوريابعد انتهاء الفرز اعل، ونقل إلى متوسطة طازجة أو RNA العازلة تحلل، وهذا يتوقف على الغرض من التجربة.
  • إذا الفرز من أجل الثقافة الخلايا المعزولة، نفذ نوع العقيمة. لتحسين الانتعاش من الخلايا، استخدم الفينول الحمراء مجانا DMEM + 5٪ FCS بدلا من FACS العازلة II وجمع الخلايا في مستنبت مع FCS 20٪.
  • إذا تم الفرز زراعة الخلايا الليفية، alwaysplate على لوحات الكولاجين والمغلفة بشكل مباشر أبدا على البلاستيك وينتج عن هذا التنشيط يؤدي إلى الخلايا الليفية التغيرات في التعبير الجيني لها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام PDGFRα كعلامة لنتائج الخلايا الليفية في عزلة السكان عالي التخصيب من الخلايا الليفية الأنسجة. كان مستوى نقاء 99٪ بعد الفرز، كما كميا بعد تحليل نوع (الشكل 2A). تقدير النسبة المئوية للتلوث غير الليفية الخلايا عن طريق التعبير النسبية للجينات الخلية التحكم الخاصة (الشكل 2B) ويظهر عادة 0،1-0،6٪ تلوث. هذا المستوى من النقاء يسمح عالية الجودة التنميط transcriptome من الخلايا الليفية معزولة 9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بينما التجارب التي أجريت في زراعة الأنسجة يمكن أن يكون بالمعلومات واقتراح المبادئ الوظيفية التي يمكن التحقق منها في الجسم الحي، ومن المعروف أن تحدث تغييرات كبيرة في التعبير الجيني للخلايا في الثقافة 11،12. وضعنا من أجل تجنب خطوة زراعة الأنسجة عند التنميط التعبير الجيني في الخلايا الليفية، وهو البروتوكول الذي يسمح عزلة طبيعية، الخلايا الليفية بالسرطان المرتبطة وكذلك من الماوس طازجة أو الأنسجة البشرية. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح مع أنسجة الجلد والبنكرياس والثد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور اسحق Oschry والدكتور آصف أوريت ساغي، لمساعدتهم مع FACS الفرز. وأيد هذا البحث من المنح لNE من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة رقم [276890]، من جمعية السرطان إسرائيل (# 20110078)، وصندوق إسرائيل من بحوث السرطان (بحوث شهادة جائزة التنمية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج عدد التعليقات (اختياري)
DMEM Gibco 41965
PBS البيولوجي للصناعات 02-023-1A
كولاجيناز II ورثينجتون LS4176
كولاجيناز IV ورثينجتون LS4188
ديوكسي ريبونيوكلياز ورثينجتون LS2007
PharmLyse BD 555899
مصفاة الخلية 70 ميكرومتر SPL 93070
تنقية مكافحة الماوس CD16/CD32 BD Pharmingen 553142
عن طريق المسبار (7AAD) البريد العلوم البيولوجية 00-6993-50
مكافحة الماوس CD140a-PE (PDGFRa) البريد العلوم البيولوجية 12-1401-81
مكافحة الماوس F4/80- FITC Cederlane CL8940F
DMEM ث / س الفينول الأحمر Gibco 31053
نوع الكولاجين I BD العلوم البيولوجية 354236

المراجع

  1. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  2. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
  3. Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
  4. Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
  5. Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
  6. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  7. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
  10. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
  11. Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.
  12. Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
  13. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
  14. Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
  15. Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19(2008).
  16. Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
  17. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).
  18. Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PDGFR alpha Q RT PCR
عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.