Method Article

إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4

DOI:

10.3791/4442

⸱

October 21st, 2012

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Faculty of Medicine, Technion - Israel Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم قياس مساهمة إعادة عرض لونين ACF عامل إلى موت الخلايا التي يسببها E4orf4. أن البروتوكول تضمن مجموعة من الحيوانات المستنسخة الخلية التي الدوكسيسيكلين العلاج يدفع الشرطي ضربة قاضية للAcf1 مفارز ACF وSNF2h، واستخدام الفحص دابي لقياس E4orf4 التي يسببها موت الخلايا في خطوط الخلايا محرض.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعطيل وظيفية في التعبير الجيني في خلايا الثدييات أمر بالغ الأهمية لدراسة مساهمة بروتين التي تهم 1،2 مسارات مختلفة. ومع ذلك، هناك حاجة ضربة قاضية المشروطة في التعبير الجيني في الحالات التي لا يمكن تحمله من قبل خلايا التأسيسي ضربة قاضية لفترة طويلة من الزمن 3-5. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد خطوط الخلايا السماح المشروط ضربة قاضية من مفارز من إعادة عرض لونين ACF عامل. هذه خطوط الخلايا تسهيل تحديد مساهمة ACF لتحريض موت الخلايا من البروتين اتش E4orf4 6. والمستنسخة متواليات ترميز الرناوات دبوس الشعر القصير للمفارز Acf1 وSNF2h من إعادة عرض لونين ACF عامل بجوار المروج الدوكسيسيكلين-محرض في البلازميد التي تحتوي على الجين أيضا لالنيوميسين الجينات المقاومة. وقد تم اختيار استنساخ الخلية مقاومة للالنيوميسين في وجود G418 ومعزولة. وقد حثت على خطوط الخلايا الناتجة منالدوكسيسيكلين العلاج، ومرة ​​واحدة أو Acf1 تم تخفيض مستويات التعبير SNF2h، وتقاس الخلايا مع ترميز البلازميد E4orf4 أو متجه فارغة. لتأكيد الأثر المحدد للبنيات shRNA، تم استعادة مستويات البروتين Acf1 أو SNF2h إلى مستويات WT بواسطة cotransfection مع Acf1 البلازميد أو التعبير عن SNF2h التي صدرت مقاومة للshRNA بواسطة إدخال الطفرات الصامتة. تم تحديد قدرة E4orf4 للحث على موت الخلايا في عينات مختلفة من الفحص دابي، والتي تم قياس تواتر ظهور نواة الأشكال التضاريسية مع أفكارك في عدد السكان الخلية بالنقل 7-9.

ويمكن استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتينات مختلفة لتحريض من قبل الشركاء موت الخلايا البروتين في الحالات التي قد يكون ضربة قاضية التأسيسي الخلية القاتلة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من خطوط الخلايا محرض

  1. قبل التجربة يحتاج المرء للبحث عن تركيز الحد الأدنى من G418 المخدرات التي تقتل كل الخلايا المستخدمة لإعداد خطوط الخلايا المطلوب. لهذا الغرض، لوحة الخلايا المفضل في لوحات مكررة عدة في confluency 70٪ في المتوسط ​​التي سيتم استخدامها أثناء التجربة وإضافة زيادة تركيزات G418 (0-1،000 ميكروغرام لكل مل). رصد الخلايا اليومية لتحديد الحد الأدنى من تركيز G418 الذي يقتل الخلايا بكفاءة. لوحظ موت الخلايا في غضون 3-7 أيام.
  2. قبل جيل من خطوط الخلايا فمن المستحسن للتحقق من المقايس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ضربة قاضية للتعبير جين معين هو مدخلا مهما لتحقيق مساهمة بروتين لمسارات التنظيمية. منذ ضربة قاضية التأسيسي للتعبير عن الجينات الأساسية يؤثر سلبا على تكاثر الخلايا، قد تتطلب دراستهم إما مقدمة من siRNAs عابرة أو تطبيق أنظمة مستقرة ضربة قاضية الشرطي. جيل من خطوط الخلايا مستقرة مع القدرة على المخدرات التي يسببها التعبير عن shRNAs وصفها هنا، يوفر ميزة على transfections عابرة قد لا تكون فعالة في كثير من خطوط الخلايا، والقصير على استخدام الفيروسات التي تتطلب إعداد المتكررة وأحيانا إضافية .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل (جزئيا) من قبل مؤسسة العلوم إسرائيل (المنحة 399/11)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG) في إطار مشروع التعاون الألماني والإسرائيلي (DIP)، ومعهد للبحوث الأسرة رابابورت في في العلوم الطبية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
ارتفاع الجلوكوز DMEM Gibco 41965
تيت النظام المعتمد FBS Clontech 631106
الجلوتامين L- Gibco 25030
القلم بكتيريا Gibco 15140
0.25٪ التربسين EDTA- Gibco 25200
T-REX-293 الخلايا إينفيتروجن R710-07
G418 سيجما A1720
blasticidin Invitروجن R210-01
+ GFP البلازميد pSuperior.neo OligoEngine VEC-PBS-0007/0008
jetPIE Polyplus ترنسفكأيشن 101-40
الدوكسيسيكلين سيجما D9891
بارافورمالدهيد علوم المجهر الإلكتروني 15710
4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) سيجما D9542
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
  2. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-med....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Conditional KnockdownGene Expression KnockdownE4orf4 Induced Cell DeathDoxycycline InductionshRNA Cell LinesChromatin RemodelingACF SubunitsWestern BlotDAPI AssayApoptotic Morphology

Related Articles