Method Article

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم C. ايليجانس

DOI:

10.3791/4443

⸱

December 22nd, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم Caenorhabditis ايليجانس. على البروتين كيناز G، EGL-4، ضروري لاستجابات التكيف مستقرة في زوج الخلايا العصبية الحسية الأولية دعا AWC. خلال فترات طويلة من التعرض translocates رائحة-4 EGL من العصارة الخلوية لنواة AWC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال التحفيز المستمر والخلايا العصبية الحسية الأكثر استجابة التكيف عن طريق خفض حساسيتها للإشارة. استجابة التكيف يساعد اهتمام شكل ويحمي الخلايا من التحفيز أيضا بين أكثر. التكيف داخل الدائرة حاسة الشم من C. وكان أول وصف ايليجانس من كولبير وBargmann 1،2. هنا، والكتاب تعريف المعلمات لنموذج التكيف حاسة الشم، التي تستخدم لتصميم شاشة الوراثية لعزل طفرات معيبة في قدرتها على التكيف مع الروائح المتطايرة لمست من قبل الخلايا العصبية Amphid نوع الجناح الخلايا (AWC) C الحسية. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست AWC-3 لل30 دقيقة وسوف التكيف مع استجابتها للرائحة وسيتم تجاهل ثم رائحة التكيف في الفحص الكيميائي لالسلوكية للساعة 1 ~. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست-AWC للساعة 1 ~ أنها سوف تتجاهل ثم رائحة التكيف AC فيhemotaxis الفحص السلوكي للساعة 3 ~. هاتين المرحلتين من التكيف حاسة الشم في C. وقد وصفت ايليجانس على المدى القصير التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 30 دقيقة رائحة)، وعلى المدى الطويل التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 60 دقيقة رائحة). العمل في وقت لاحق من L'نجم وآخرون.، كشفت 4 أ G بروتين كيناز (PKG) دعا EGL-4 ما هو مطلوب لكلا التكيف حاسة الشم قصيرة الأجل وطويلة الأجل في الخلايا العصبية AWC. و-4 EGL البروتين يحتوي على تسلسل توطين النووية ما هو ضروري على المدى الطويل ولكن استجابات التكيف حاسة الشم يمكن الاستغناء عنها على المدى القصير استجابات التكيف حاسة الشم في 4 AWC. من علامات EGL-4 مع البروتين الفلورية الخضراء، كان من الممكن تصور توطين EGL-4 في AWC خلال التعرض لفترات طويلة رائحة. استخدام هذا تعمل بكامل طاقتها GFP الموسومة EGL-4 (GFP :: EGL-4) جزيء كنا قادرين على تطوير قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم ال 5 AWC. استخدام هذا مقراءات olecular التكيف حاسة الشم كنا قادرة على أداء كل من الأمام وعكس شاشات الجينية لتحديد الحيوانات التي تظهر متحولة معيبة أنماط توطين التحت خلوية من GFP :: EGL-4 في 6،7 AWC. نحن هنا وصف: 1) بناء GFP :: EGL-4 معربا عن الحيوانات؛ 2) بروتوكول لزراعة الحيوانات لفترة طويلة الأجل المقايسات إزفاء رائحة بفعل النووية، و 3) التسجيل للمن صنع رائحة طويلة الأمد الحدث النووية إزفاء والانتعاش (إعادة التوعية) من GFP النووية :: EGL-4 الدولة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء GFP ذات الكلمات الدلالية EGL-4 تعرب عن الحيوانات

  1. استنساخ متعدية GFP الانصهار :: EGL-4 تحت المروج لهذا الجين ODR-3 (2678 BP استخدام المنبع مباشرة من كودون بداية): (ع) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. التعبير ODR-3 محركات المروج في أزواج الخلايا العصبية amphid: AWA؛ AWB؛ AWC، وضعيفة في ASH.
  2. حقن بلازميد (ع) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 في الحيوانات (N2) wildtype في 50 نانوغرام / ميكرولتر مع علامات شارك في حقن باستخدام معيار تقنيات التحول الجرثومية سطر 8: ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد مثال على نمط توطين GFP :: EGL-AWC 4in وقبل وبعد التعرض لفترات طويلة رائحة في الشكل 2. يتم ترجمة قبل التعرض لفترات طويلة رائحة، GFP :: EGL-4 إلى العصارة الخلوية من AWC (الشكل 2B)، وبعد 80 دقيقة من التعرض رائحة GFP :: يتم ترجمة EGL-4 إلى نواة AWC (الشكل 2D). على المستوى السلوكي، تنجذب الحيوانات مع GFP عصاري خلوي :: EGL-4 في AWC إلى مصدر الرائحة نقطة (الشكل 2C الرسوم البيانية نتائج ممثلة من المقايسات الكيميائي ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دخول رائحة النووية التي يسببها جزيء من GFP الموسومة-4 EGL الموصوفة هنا يقدم قراءات قوية الجزيئي للتكيف حاسة الشم في C. ايليجانس. رائحة الناجم عن المقايسات إزفاء النووية هي واضحة وتتطلب سوى بضعة أيام من وقت الإعداد. الحيوان pyIs500 أننا شيدت لهذه المقايسات، يعبر عن علامة الذي ينير الخلايا العصبية AWC وكذلك التعبير عن GFP الموسومة EGL-4 البروتين. وهكذا، نرى أن مجرب مع قليل من دون خبرة في العمل مع هذه الفئة من الخلايا العصبية يمكن بسرعة كبيرة (ربما بعد فحص الحيوانات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر سكوت هاملتون، وأعضاء المختبر O'Halloran لقراءة متأنية لهذه المخطوطة. نشكر أيضا مجتمعنا مجهول للحصول على اقتراحات ممتازة والتعليقات الثاقبة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
Bacto آجار Difco DF0140-07-4 لوحات NGM
كلوريد الصوديوم فيشر الكيميائية S671-10 لوحات NGM
Bacto ببتون Difco DF0118-07-2 لوحات NGM
ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم فيشر الكيميائية S375-500 S-بصل العازلة وألواح NGM
أحادى فوسفات البوتاسيوم فيشر الكيميائية P285-500 S-بصل العازلة وألواح NGM
Kimwipes - الصغيرة كيمبرلي كلارك LS2770
الإيثانول بنسبة 100٪ الذهب درع الكيميائيةشركة 43196-115 تمييع الروائح لفحوصات الكيميائي
كلوريد الكالسيوم سيغما الدريخ C8106-500G لوحات NGM
المغنيسيوم كبريتات النائب Biomedicals 150136-500G لوحات NGM
أزيد الصوديوم 99٪ فيشر العلمية ICN10289180 مخدر
الاغاروز - عالى النقاء إينفيتروجن 16500-500 الاغاروز منصات
بنزيلديهايد سيغما الدريخ B1334-100G AWC رائحة
Butanone، ACS الصف سيغما الدريخ 360473-500ML AWC رائحة
أنابيب microcentrifuge - 1.5 مل الملونة Denville LS8147
5-3/4 الماصة باستور الزجاج يعاد " فيشر العلمية 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV التكامل
تصفية فراغ زجاجة - 500 مل Nalgene 09-740-25B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory AdaptationC ElegansAWC NeuronsGFP TaggingProtein Kinase GNuclear TranslocationChemotaxis AssayLong term AdaptationGenetic ScreenSensory Neuron Plasticity

Related Articles